Name: תיוג נוגדן עם צבעי ניאון באמצעות חלבון מגנטי חלבון G חרוזים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: למדו שיטת תיוג נוגדנים בחלקיקים מגנטיים עם חלבון G ללא צורך בטיהור מראש. השיטה מאפשרת אופטימיזציה של כימיית התיוג לכמויות קטנות ותומכת באוטומציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. לכידת נוגדן על בקיבולת גבוהה חלבון מגנטי או חלבון מגנטי חרוזים G <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אחיד מחדש להשעות חרוזים מגנטיים ידי רעד עדין. שמור את מדי השעיה כאשר aliquoting חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של slurry חרוז צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. מקום לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. מוציאים בזהירות את למאגר אחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חיץ נוגדן מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים ומניחים לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. מוציאים בזהירות את חיץ מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.0 מ&quot;ל של מדגם המכיל 50-100 מיקרוגרם של נוגדנים חרוזים. דוגמאות ניתן מטוהרים נוגדנים או נוגדנים בתקשורת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מדגם למשך 60 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח צינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות ולהסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חיץ מחייב / כביסה נוגדן ומערבבים. המקום לעמוד המגנטי במשך 10 שניות ולהסיר חיץ מחייב / כביסה. חזור על פעולה זו sTEP עבור סכום כולל של שני שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לסעיף 2 לנוגדני תווית באמצעות כימיה אמינה או סעיף 3 לנוגדני תווית באמצעות כימית תיאול. </li></ol> 2. תיוג נוגדן שימוש אמין לכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצומד נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של חיץ נטיה אמין אל חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את צבעי ניאון-reactive אמין (AlexaFluor 532-SE) ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​על ידי הוספת 100 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO) ל -1.0 מ&quot;ג של צבע. מערבבים על ידי vortexing. בצע פתרון זה רק לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5 μl של צבע אמין-פעיל 100 מיקרוגרם של הנוגדן. הערה: בדרך כלל עודפת 5-20 טוחן של צבע תגובתי מומלצת. עם זאת, כמות של צבע תגובתי להוסיף התגובה צריכה להיות מותאמת באופן אמפירי בהתאם לצבוע רצוי יחס נוגדן ומאפייני נוגדן מהותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מדגם למשך 60 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי החרוזים להישאר suspension. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח צינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות ולהסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חיץ מחייב / כביסה נוגדן ומערבבים. מקום לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. סר וזורק חיץ מחייב / כביסה. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שני שוטף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של חיץ elution על חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים במשך 5 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי חרוזים לרחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח צינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. הסר מדגם eluted ולהעביר צינור מיקרו צנטריפוגות חדש המכיל 5 μl של חיץ הניטרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עוד פעם אחת לרכז את דגימות eluted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ריכוז הנוגדנים לצבוע-אל-נוגדן יחס כמפורט בסעיף 4. </li></ol></li></ol> 3. תיוג נוגדן שימוש תיאול לכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחתת נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μlשל חיץ ותמהיל נטיה תיאול. מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. סר וזורק למאגר. חזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של חיץ נטיה תיאול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Dithiothreitol (DTT) לריכוז סופי של 2.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מדגם למשך 60 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי חרוזים לרחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות וזורקים חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חיץ נטיה תיאול ומערבבים. מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. סר וזורק למאגר. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שני שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של חיץ נטיה תיאול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצומד נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את צבען תיאול-reactive ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​על ידי הוספת 100 μl של DMSO ל -1.0 מ&quot;ג של צבע. מערבבים על ידי vortexing. בצע פתרון זה רק לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5 μl של צבע תיאול-פעיל 100 מיקרוגרם של אנטיגוּף. הערה: בדרך כלל עודפת 5-20 טוחן של צבע תגובתי מומלצת. עם זאת, כמות של צבע תגובתי להוסיף התגובה צריכה להיות מותאמת באופן אמפירי בהתאם לצבוע רצוי יחס נוגדן ומאפייני נוגדן מהותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מדגם למשך 60 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי חרוזים לרחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות ולהסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חיץ נטיה תיאול ומערבבים. מקום לעמוד מגנטי במשך 10 שניות ולהסיר למאגר. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שני שוטף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של חיץ elution על חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים במשך 5 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי חרוזים לרחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח צינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. הסר מדגם eluted ולהעביר צינור מיקרו צנטריפוגות חדש המכיל 5 μl של neutחיץ ralization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עוד פעם אחת לרכז את דגימות eluted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ריכוז הנוגדנים לצבוע-אל-נוגדן יחס כמפורט בסעיף 4. </li></ol></li></ol> 4. חישוב יחס צבען אל-נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה של המצומד הנוגדן-צבען ב 280 ננומטר (A280) ובבית λmax עבור הצבע (אמקס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את ריכוז הנוגדן: ריכוז נוגדן (מ&quot;ג / מ&quot;ל) = A280 - (מקסימום × CF) / 1.4 איפה CF = תיקון גורם של הצבע (המסופק על ידי היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את יחס צבען אל-נוגדן: צבען אל-נוגדן יחס (DAR) = (A max × 150,000) / ריכוז Ab (מ&quot;ג / מ&quot;ל) × ε לצבוע שם, לצבוע ε = מקדם הכחדה של צבע במקסימום ספיגת שלה ועל משקל מולקולרי של נוגדן = 150,000 דא. </li></ol>

<ol><li>Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+to+generate+renewable+protein+binders+to+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome.</a> Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).</li>
<li>Silverstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeled+antigens+and+antibodies%3A+the+evolution+of+magic+markers+and+magic+bullets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).</li>
<li>Day, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+modified+antibodies+as+diagnostic+imaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).</li>
<li>Cunningham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+flow+cytometry+and+fluorescent+probes+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
<li>Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptavidin-biotin+technology%3A+improvements+and+innovations+in+chemical+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).</li>
<li>Kraeber-Bodere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunoconjugates+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer.</a> Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).</li>
<li>Leal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+an+emerging+modality+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).</li>
<li>Drachman, J. G., Senter, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+the+chemistry+behind+empowering+antibodies+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Academic Press. 380-382 (1996).</li>
<li>Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+the+three+different+fluorophore+antibody+conjugation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies.</a> Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).</li>
<li>Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-labeled+antibodies%3A+Balancing+functionality+and+degree+of+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling.</a> Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).</li>
<li>Isa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+system+to+identify+small+molecules+that+induce+internalization+and+degradation+of+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2.</a> ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).</li>
<li>Liao-Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+antibody+internalization+with+novel+monoclonal+antibodies+against+Alexa+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores.</a> PLoS One. 10 (4), e0124708(2015).</li>
<li>Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+for+Internalizing+Antibodies+by+Homogeneous+Fluorescence+Imaging+of+a+pH-Activated+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe.</a> J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).</li>
<li>Nath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+plate+based+antibody+internalization+assay+using+pH+sensor+fluorescent+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye.</a> J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).</li>
<li>Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+reproducible+fluorescent+labeling+of+small+amounts+of+antibodies+on+solid+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase.</a> J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).</li>
<li>Strachan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+biotinylation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Solid-phase biotinylation of antibodies.</a> J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).</li>
<li>Dezfouli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+bead+assisted+labeling+of+antibodies+at+nanogram+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale.</a> Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).</li>
<li>Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-bead+antibody-small+molecule+conjugation+using+high-capacity+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads.</a> J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).</li>
<li>Lund, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+variation+in+binding+of+Protein+A+and+Protein+G+to+immunoglobulin+type+G+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry.</a> J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).</li>
<li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+techniques+for+the+isolation+and+purification+of+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomagn+Res+Technol%22%5BJournal%5D)">Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides.</a> Biomagn Res Technol. 2 (1), 7(2004).</li>
<li>Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer.</a> Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).</li>
<li>Shen, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).</li>
<li>Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+linker+and+conjugation+chemistry+on+antigen+binding%2C+Fc+receptor+binding+and+thermal+stability+of+model+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates.</a> MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).</li>
</ol>

המחברים הם עובדי Promega Corporation.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח שיטה לתייג נוגדנים, נוכח בתקשורת התא בריכוזים נמוכים, עם מגוון רחב של מולקולות קטנות. שיטה כזו תאפשר מספר רב של נוגדנים, בשלבים הראשונים של גילוי נוגדנים, כדי להיות מתויגת עם מולקולות קטנות, ובדרך הוקרנה באמצעות assay רלוונטית מבחינה ביולוגית. assay אחת כזו היא assay הפנמת נוגדן בתיווך הקולט שבו הפנמה עשויה להשתנות בין נוגדנים אפילו עם זיקות מחייבות דומות. לפיכך, חשוב להקרין נוגדנים במיוחד עבור נכסי ההפנמה שלהם בנוסף אנזים מסורתי מקושרי Assay immunosor...

נוגדנים שכותרתו עם מולקולות קטנות הם אולי ריאגנטים הנפוצים ביותר 1,2 ביולוגיה. נוגדנים שכותרתו עם צבעי ניאון ו ביוטין נמצאים בשימוש נרחב בתחום ההדמיה, immunoassays, cytometry זרימה, כתמים מערביים, ו immunoprecipitation בין יישומים אחרים 3-6. נוגדני radiolabeled 3,7 למצוא שימוש נרחב בתחום הדמית טיפול, נוגדנים שכותרתו עם תרופות ציטוטוקסיות (ADC) מציעים אפשרויות חדשות לטיפול הסרטן, ושני ממירים ADC שכבר אושרו לשימוש טיפולי 8. למרות השימוש הנרחב שלהם, שיטות נוגדני תיוג נותרו ללא שינוי מפתיע ובדרך כלל כרוכות תגובות מרובות desalting שלבי 9-12. שיטות פתרון היטב לשימוש במקרים בם רק כמה נוגדנים צריכים להיות מתויגים והם זמינים בצורה נקיה במיוחד בריכוז גבוה בהיקפי מספיק. עם זאת, עבור יישומים חדשים יותר כמו ממירי ADC, קייםצריך לתייג נוגדנים בשלב hybridoma מוקדם כדי שיוכלו להיות מוקרן על תכונות רלוונטיות מבחינה ביולוגית, למשל, 13-16 הפנמת נוגדן קולטן בתיווך. בשלב hybridoma, כרכי מדגם מוגבלים, הנוגדנים באים לידי ביטוי בריכוזים נמוכים ומספר דגימות גדולות, ומכאן שיטות תיוג מבוסס פתרון אינן מתאימות. כדי לפשט ולשפר את התפוקה של שיטות תיוג נוגדן המסורתיות, כמה גישות חלופיות הוצעו 17,18. גישה אחת היא להשתמש חלבון שאינו מגנטי חרוזים זיקה ארוזים עמודים קטנים ללכוד נוגדנים ואחריו התגובה תיוג ו elution של חלבון הנקרא וטיהר. שיטה זו יכולה לשמש כדי לתייג נוגדנים ישירות תקשורת תא, לעומת זאת, השימוש בעמודים יכול להיות מייגע. שיטה מגנטית חרוז מבוססת לאחרונה דווחה 19 זה מבטל את השימוש בעמודים משפר את התפוקה אך בשלכדי הנוגדן המוגבל יכולת קשירה של החרוזים, רק ננוגרם לכמויות מיקרוגרם נמוכים של הנוגדנים יכול להיות מתויג. פתחנו לאחרונה והשתמשנו קיבולת גבוהה חלבון מגנטי חלבון G חרוזים (&gt; 20 מ&quot;ג של IgG אדם / מיליליטר של חרוזים מיושבים) לתייג נוגדנים נוכחיים בתקשורת תא עם מולקולות קטנות 20. הקיבולת הגבוהה של החרוזים מאפשרת עשרות עד מאה מיקרוגרם של נוגדנים להיות מתויגות בנוחות התגובה המגנטית המהירה של חרוזי מפשט טיפול ועיבוד של מספר רב של דגימות במקבילות. באמצעות צבעי ניאון כמו התחליפים עבור מולקולות קטנות, אנו מראים כי השיטה תואמת כימיה תיוג אמין ו תיאול ומציע החלמה גבוה של נוגדנים שכותרתו מאוד טהור. פרוטוקול זה ואת הסרטון מלווה לתאר תיוג על-חרוז של נוגדני העכבר נוכחיים בתקשורת התא באמצעות חלבון מגנט חלבון G חרוזים. הפרוטוקול הואלארבעה חלקים מחולקים: סעיף 1 מתאר את לכידתו של נוגדנים על החרוז מ דגימות ביולוגיות. בעקבות לכיד, התיוג של נוגדנים עם צבע פלואורסצנטי באמצעות כימיה אמינה או באמצעות כימית תיאול מתואר בסעיפים 2 וסעיף 3, בהתאמה. לבסוף, סעיף 4 מתאר את השיטה לצורך החישוב של ריכוז נוגדנים ואת צבע יחס נוגדן.

<table><tbody><tr><td>מגנה חלבון A חרוזים</td><td>Promega Corporation</td><td>&nbsp; G8781</td><td></td></tr><tr><td>חלבון מגנה G חרוזים</td><td>Promega Corporation&nbsp;</td><td>&nbsp; G7471</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)</td> <td>Life Technologies</td><td>A20001</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td> <td>Life Technologies</td><td>A10255</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td> <td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-ME (Maleimide)</td> <td>Life Technologies</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>Promega</td><td>Z5332</td><td></td></tr></tbody></table>

תיוג נוגדן עם צבעי ניאון באמצעות חלבון מגנטי חלבון g חרוזים

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

נוגדנים שכותרתו עם מולקולות קטנות כמו צבעי ניאון, תרופות ציטוטוקסיות קליעים נותבים רדיואקטיביים הם כלים חיוניים במחקר ביו, immunodiagnostics ולאחרונה כסוכנים טיפוליים. שיטות מסורתיות נוגדני תיוג עם מולקולות קטנות דורשות מטוהרי נוגדנים בריכוז גבוה יחסית, כרוכות צעדי דיאליזה מרובות מוגבלות תפוקה. עם זאת, מספר יישומים, כוללים בתחום הנוגדן ותרופות conjugates (ADC), ייהנו שיטות חדשות שתאפשרנה תיוג של נוגדנים ישירות תקשורת תא. שיטות אלה עשויות לאפשר נוגדנים שיוקרו מבחנים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, למשל, assay הפנמת נוגדן קולטן בתיווך במקרה של ממירי ADC. כאן, אנו מתארים שיטה (על-חרוז) שיטה המאפשרת תיוג של כמויות קטנות של נוגדנים ישירות תקשורת תא. גישה זו משתמשת חלבון מגנטי קיבולת גבוהה חלבון זיקת G חרוז ללכוד נוגדניםמתקשורת התא ואחריו תיוג עם מולקולות קטנות או באמצעות אמין או כימית תיאול ו elution הבאה של הנוגדנים שכותרתו. אם ניקח צבעי ניאון כמו תחליפים עבור מולקולות קטנות, אנחנו מדגימים את התוויות על-חרוז של שלושה נוגדנים שונים עכבר ישירות מהמדיה תא באמצעות שני אמין וכימית תיוג תיאול. הזיקה מחייבת נוגדנים הגבוהה לחלבון וחלבון G מבטיחה החלמה גבוהה, כמו גם טוהר גבוה של הנוגדנים שכותרתו. בנוסף, שימוש חרוז מגנטיים מאפשר דגימות מרובות כדי להיות מטופלים באופן ידני, ובכך לשפר את תפוקת תיוג משמעותי.

סכימטי תיוג נוגדנים עם מולקולות קטנות באמצעות חלבון מגנטי גבוהה קיבולת חלבון G חרוזים מוצג באיור 1. נוגדנים שנתפסו על חרוזים המגנטי החלבון G יכולים להיות מתויגים עם מולקולות קטנות, עבור צבעי ניאון למשל, באף אחת כימיה אמינה אשר תוויות אמינים ראשוניים של חומצות אמינו ליזין או באמצעות כימיה תיאול אשר תוויות על thiols מופחת באזור ציר של נוגדנים. זיקה בין נוגדני החלבון G היא חזקה 21 ותוצאות הפסד מינימאלי של נוגדנים במהלך תגוב...

השיטה על-חרוז תיוג נוגדנים עם מולקולות קטנות מאפשרת סימון של כמות קטנה של נוגדנים ישירות תקשורת תא. שיטה זו תואמת אמין וכימית תיאול, ואת יכולה להתמודד עם דגימות מרובות במקביל, באופן ידני או באמצעות פלטפורמות אוטומטיות.

תיוג נוגדן עם צבעי ניאון באמצעות חלבון מגנטי חלבון G חרוזים

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לסמן נוגדנים בצבעים פלואורסצנטיים מדגימות מטוהרות או ישירות מתווך תרבית תאים, באמצעות חרוזי מגנטיים של protein A או G. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבצע אופטימיזציה של כימיית הסימון של כמויות קטנות של נוגדנים בתוך תווך התרבית, דבר המוביל ליישומים יעילים יותר של הנוגדנים בשלבי העבודה הבאים.היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהנוגדנים אינם דורשים טיהור, ניתן להשתמש בכימיה של אמינים או תיולים, והשיטה יכולה להיות אוטומטית או ידנית. התחל בערבוב אחיד של החרוצים באמצעות ניעור עדין. לאחר מכן, הוסף 50 µL של חרוצים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL.לאחר מכן, מקמו את המבחנה במעמד מגנטי. לאחר 10 שניות, החליפו בזהירות את תחליל האחסון ב-250 µL של תחליל קישור לנוגדנים וערבבו היטב את החרו지를. לאחר 10 שניות נוספות, החליפו בזהירות את תחליל הקישור ב-1 mL של הנוגדן הרצוי.ערבבו את הדגימה למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. בסיום האינקובציה, החזירו את המבחנות למגנט והסירו את הנוזל העליון כאשר החרוזים נעברו לדפנות המבחנה. לאחר מכן, שטפו את תערובת החרוזים והנוגדנים בשני שטיפות של 10 שניות באמצעות 250 µL של בופר שטיפה לקשירת נוגדנים לכל שטיפה.כדי לסמן את הנוגדנים באמצעות כימיה של אמינים, לאחר השטיפה השנייה, החליפו את בופר השטיפה ב-100 microliters של בופר קונג'וגציה של אמינים והוסיפו 2.5 microliters של צבע רגיש לאמינים שהוכן טרי עבור כל 100 micrograms של נוגדן. ערבבו את הדגימה ב-Vortex למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשמור על החרו지를 בתסמין במהלך הסימון. לאחר מכן, החזירו את המבחנה למגנט למשך 10 שניות והסירו את הנוזל העליון.שטפו את החרוצים פעמיים עם בופר שטיפה לקשירת נוגדנים, כפי שהודגם כעת. לאחר מכן, החליפו את בופר השטיפה ב-50 µL של בופר אלוציה וערבבו את החרוצים במשך חמש דקות. החזירו את המבחנה למגנט למשך 10 שניות והעבירו את הנוגדן שנאלוא למבחנה חדשה של מיקרוצנטריפוגה המכילה 5 µL של בופר נטרול.בצעו אלוציה של הנוגדן פעם נוספת, כפי שהודגם כעת, תוך הוצאת הדגימות שנאלואו. לאחר מכן, מדדו את הבליעה של הצמיד נוגדן-צבע באורך גל של 280 ננומטר וב-lambda max של הצבע. כדי לסמן את הנוגדנים באמצעות כימיה של תיול, לאחר השטיפה השנייה, החליפו את תמיסת השטיפה ב-250 microliters של תמיסת חיבור תיול וערבבו את החרו지를 באמצעות פיפוט עדין.לאחר 10 שניות, שטפו את החרו지를 פעמיים עם תמיסת שטיפה לקשירת נוגדנים. לאחר מכן, החליפו את תמיסת השטיפה ב-100 µL של תמיסת צימוד תיול והוסיפו DTT לריכוז סופי של 2.5 mM. ערבבו את החרוזים למשך 60 דקות נוספות.לאחר מכן, החזירו את החרוצים למגנט למשך 10 שניות והשליכו את הבופר. בשלב הבא, הוסיפו 250 microliters של בופר לצימוד תיול (thiol-conjugation buffer) לחרוצים תוך ערבוב עדין. לאחר 10 שניות, שטפו את החרוצים פעמיים עם בופר שטיפה לקישור נוגדנים (antibody-binding wash buffer), והחליפו את השטיפה השנייה ב-100 microliters של בופר לצימוד תיול טרי.כעת, הוסיפו 2.5 µL של צבע ריאקטיבי לתיאול שהוכן טרי עבור כל 100 µg של נוגדן, וערבבו את החרוצים למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. בסיום הדגירה, החזירו את המבחנה למגנט למשך 10 שניות. החליפו את הנוזל העליון ב-250 µL של בופר צימוד תיאול טרי תוך ערבוב עדין.לאחר 10 שניות, שטפו את החרוצים פעמיים. לאחר מכן, החליפו את תמיסת השטיפה ב-50 microliters של תמיסת אלוציה ובצעו אלוציה של הנוגדן המצומד פעמיים, כפי שהודגם הרגע. לאחר מכן, מדדו את הבליעה של הצמיד נוגדן-צבע ב-280 nanometers וב-lambda max של הצבע.הזיקה החזקה בין הנוגדנים לבין Protein G, הזיקה העוצמתית של המגנט לחרוצים, ואופטימיזציית השיטה לפני טיהור החרוצים, מובילים יחד לאובדן מזעור של נוגדנים במהלך תגובת הסימון, כפי שמעיד השחזור היעיל של שלושה איזוטיפים שונים של נוגדנים מעכבר לאחר סימון פלואורסצנטי כפול בהשוואה לטיהור פשוט. שחזור זה ניכר גם בג'לים של Coomassie, שבהם תכונות הקישור הבלתי-ספציפי הנמוכות של חרוצי Protein G המגנטיים מביאות לנוכחות של שרשראות כבדות וקלות מסומנות פלואורסצנטית כפול ומטוהרות ברמה גבוהה. סימון על גבי חרוצים באמצעות חרוצי Protein A מגנטיים הוא תואם גם למספר צבעים פלואורסצנטיים, מה שמוביל לשחזור גבוה וליחסי צבע-לנוגדן טובים.במידה ושולטים בטכניקה זו, ניתן להשלימה בשעתיים עד שלוש שעות, אם היא מבוצעת כראוי. הדבר מאפשר טיפול ידני במספר דגימות או שימוש בפלטפורמה אוטומטית לשיפור התפוקה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על חרוזי המגנט בתגליה בכל עת.יש לבחור את הנפח המתאים של חרוזי מגנט עבור הדגימה. כמו כן, יש לבצע אופטימיזציה של כמות הצבע הפלואורסצנטי עבור הנוגדן הרלוונטי. לאחר ביצוע הליך זה, יש לבחון את הנוגדנים המסומנים כדי לקבוע את תפקודם באמצעות בדיקות ביולוגיות רלוונטיות, כגון ELISA, FACS או בדיקות מבוססות תאים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לסמן נוגדנים מופקים ובלתי מופקים באמצעות תגי פלואורסצנציה או מולקולות קטנות אחרות, כגון biotin או תרופות ציטוטוקסיות, תוך שימוש בחרוזי Protein A או G מגנטיים.

antibody-labeling-with-fluorescent-dyes-using-magnetic-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

התא חדיר crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] מייצב אינטראקציות חלוף...

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

סרטון זה מדגים שיטה לזיהוי זני ציאנובקטריה בדגימה סביבתית באמצעות שבב מיקרו-מערך נוגדנים. דגימות הנושאות חיידקים שונים מקיימות אינטראקציה עם נוגדנים מודפסים, והצבעה חיסונית עם נוגדנים אנטי-ציאנובקטריאליים המסומנים כפלואורופורים חושפת את נוכחותם של זנים ציאנובקטריאליים ספציפיים באמצעות פלואורסצנטיות בנקודות שונות.

טכניקה לזיהוי זנים ציאנובקטריאליים באמצעות שבב מיקרו-מערך נוגדנים

סרטון זה מדגים זיהוי חיידקי כמותי מרובה באמצעות מיקרוספרות פוליסטירן מגנטיות קרבוקסיליות הצבועות לקבוצות נפרדות. ההליך כולל היווצרות קומפלקסים של חיידקי חרוזים, הפרדה מגנטית ואנליזה מבוססת זרימה, המאפשרים כימות מדויק וסימולטני של מספר חיידקים באותה תגובה היטב.

זיהוי כמותי של חיידקים באמצעות מיקרוספרות מגנטיות עם תווית צבע

אנו מתארים שיטה לתייג חלבון על פני השטח של תאי עצב חיים באמצעות נוגדן polyclonal ספציפי לאפיטופים תאיים. החלבון קשור בנוגדן על פני התא, ולאחר מכן הפנים באמצעות אנדוציטוזה ניתן להבחין בין החלבון שנותר ב, או נסחרים ל, את פני השטח במהלך הדגירה.

תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להחדרת בדיקות כימיות באופן ספציפי לתוך מקטע נוגדנים על ידי שילוב גנטי של חומצת אמינו המכילה אזיד, ולאחר מכן צימוד האזיד עם בדיקה כימית על ידי תוספת ציקלו-אזיד-אלקין המקודמת על ידי זן (SPAAC).

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

מתרגם הריבוכמה אהדה הזיקה (מלכודת) מאפשר בידוד מהיר ויעיל של סוג תא ספציפי לתרגם mRNA. כאן, אנו מדגימים שיטה המשלבת הזרקת זנב הידרודינמי במודל העכבר של אוכלוסיית הכבד והמלכודת כדי לבחון את פרופיל הביטוי של אכלוס מחדש של hepatocytes.

סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

אנו מציגים כאן הליך למדידת אוליגומרים של חלבונים וצבירה בתאים ליזלתיים ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות.

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

אנו מדווחים על אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לצלם ולכמת ישירות את התנועה של מנחת מסוקים Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) המסומן באופן פלואורסצנטי ומשוחזר במלואו על מולקולות דנ"א ליניאריות המוחזקות במקומן במלכודת אופטית.

אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות את התנועה של CMG משוחזר במלואו

פרוטוקול זה מתאר סימון נוגדן יחיד (SAL) לפתרון הארגון המרחבי בקנה מידה ננומטרי של חלבוני ממברנת הפלזמה. על ידי ניצול אינטראקציות מצטברות בין נוגדנים לאפיטופים ברמת המולקולה היחידה, SAL ממברנה (mSAL) ממפה התפלגות אפיטופים מקומיות תוך כדי לכידת התנהגות קשירת נוגדנים בסביבה התאית הטבעית.

מיקרוסקופיית מיקום מולקולה אחת של חלבוני ממברנה באמצעות תיוג נוגדן יחיד

למדו שיטת תיוג נוגדנים בחלקיקים מגנטיים עם חלבון G ללא צורך בטיהור מראש. השיטה מאפשרת אופטימיזציה של כימיית התיוג לכמויות קטנות ותומכת באוטומציה.

תיוג נוגדן עם צבעי ניאון באמצעות חלבון מגנטי חלבון G חרוזים

גלה סרטונים נוספים