תיוג נוגדן עם צבעי ניאון באמצעות חלבון מגנטי חלבון G חרוזים

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לסמן נוגדנים בצבעים פלואורסצנטיים מדגימות מטוהרות או ישירות מתווך תרבית תאים, באמצעות חרוזי מגנטיים של protein A או G. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבצע אופטימיזציה של כימיית הסימון של כמויות קטנות של נוגדנים בתוך תווך התרבית, דבר המוביל ליישומים יעילים יותר של הנוגדנים בשלבי העבודה הבאים.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהנוגדנים אינם דורשים טיהור, ניתן להשתמש בכימיה של אמינים או תיולים, והשיטה יכולה להיות אוטומטית או ידנית. התחל בערבוב אחיד של החרוצים באמצעות ניעור עדין. לאחר מכן, הוסף 50 µL של חרוצים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL.

לאחר מכן, מקמו את המבחנה במעמד מגנטי. לאחר 10 שניות, החליפו בזהירות את תחליל האחסון ב-250 µL של תחליל קישור לנוגדנים וערבבו היטב את החרו지를. לאחר 10 שניות נוספות, החליפו בזהירות את תחליל הקישור ב-1 mL של הנוגדן הרצוי.

ערבבו את הדגימה למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. בסיום האינקובציה, החזירו את המבחנות למגנט והסירו את הנוזל העליון כאשר החרוזים נעברו לדפנות המבחנה. לאחר מכן, שטפו את תערובת החרוזים והנוגדנים בשני שטיפות של 10 שניות באמצעות 250 µL של בופר שטיפה לקשירת נוגדנים לכל שטיפה.

כדי לסמן את הנוגדנים באמצעות כימיה של אמינים, לאחר השטיפה השנייה, החליפו את בופר השטיפה ב-100 microliters של בופר קונג'וגציה של אמינים והוסיפו 2.5 microliters של צבע רגיש לאמינים שהוכן טרי עבור כל 100 micrograms של נוגדן. ערבבו את הדגימה ב-Vortex למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשמור על החרו지를 בתסמין במהלך הסימון. לאחר מכן, החזירו את המבחנה למגנט למשך 10 שניות והסירו את הנוזל העליון.

שטפו את החרוצים פעמיים עם בופר שטיפה לקשירת נוגדנים, כפי שהודגם כעת. לאחר מכן, החליפו את בופר השטיפה ב-50 µL של בופר אלוציה וערבבו את החרוצים במשך חמש דקות. החזירו את המבחנה למגנט למשך 10 שניות והעבירו את הנוגדן שנאלוא למבחנה חדשה של מיקרוצנטריפוגה המכילה 5 µL של בופר נטרול.

בצעו אלוציה של הנוגדן פעם נוספת, כפי שהודגם כעת, תוך הוצאת הדגימות שנאלואו. לאחר מכן, מדדו את הבליעה של הצמיד נוגדן-צבע באורך גל של 280 ננומטר וב-lambda max של הצבע. כדי לסמן את הנוגדנים באמצעות כימיה של תיול, לאחר השטיפה השנייה, החליפו את תמיסת השטיפה ב-250 microliters של תמיסת חיבור תיול וערבבו את החרו지를 באמצעות פיפוט עדין.

לאחר 10 שניות, שטפו את החרו지를 פעמיים עם תמיסת שטיפה לקשירת נוגדנים. לאחר מכן, החליפו את תמיסת השטיפה ב-100 µL של תמיסת צימוד תיול והוסיפו DTT לריכוז סופי של 2.5 mM. ערבבו את החרוזים למשך 60 דקות נוספות.

לאחר מכן, החזירו את החרוצים למגנט למשך 10 שניות והשליכו את הבופר. בשלב הבא, הוסיפו 250 microliters של בופר לצימוד תיול (thiol-conjugation buffer) לחרוצים תוך ערבוב עדין. לאחר 10 שניות, שטפו את החרוצים פעמיים עם בופר שטיפה לקישור נוגדנים (antibody-binding wash buffer), והחליפו את השטיפה השנייה ב-100 microliters של בופר לצימוד תיול טרי.

כעת, הוסיפו 2.5 µL של צבע ריאקטיבי לתיאול שהוכן טרי עבור כל 100 µg של נוגדן, וערבבו את החרוצים למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. בסיום הדגירה, החזירו את המבחנה למגנט למשך 10 שניות. החליפו את הנוזל העליון ב-250 µL של בופר צימוד תיאול טרי תוך ערבוב עדין.

לאחר 10 שניות, שטפו את החרוצים פעמיים. לאחר מכן, החליפו את תמיסת השטיפה ב-50 microliters של תמיסת אלוציה ובצעו אלוציה של הנוגדן המצומד פעמיים, כפי שהודגם הרגע. לאחר מכן, מדדו את הבליעה של הצמיד נוגדן-צבע ב-280 nanometers וב-lambda max של הצבע.

הזיקה החזקה בין הנוגדנים לבין Protein G, הזיקה העוצמתית של המגנט לחרוצים, ואופטימיזציית השיטה לפני טיהור החרוצים, מובילים יחד לאובדן מזעור של נוגדנים במהלך תגובת הסימון, כפי שמעיד השחזור היעיל של שלושה איזוטיפים שונים של נוגדנים מעכבר לאחר סימון פלואורסצנטי כפול בהשוואה לטיהור פשוט. שחזור זה ניכר גם בג'לים של Coomassie, שבהם תכונות הקישור הבלתי-ספציפי הנמוכות של חרוצי Protein G המגנטיים מביאות לנוכחות של שרשראות כבדות וקלות מסומנות פלואורסצנטית כפול ומטוהרות ברמה גבוהה. סימון על גבי חרוצים באמצעות חרוצי Protein A מגנטיים הוא תואם גם למספר צבעים פלואורסצנטיים, מה שמוביל לשחזור גבוה וליחסי צבע-לנוגדן טובים.

במידה ושולטים בטכניקה זו, ניתן להשלימה בשעתיים עד שלוש שעות, אם היא מבוצעת כראוי. הדבר מאפשר טיפול ידני במספר דגימות או שימוש בפלטפורמה אוטומטית לשיפור התפוקה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על חרוזי המגנט בתגליה בכל עת.

יש לבחור את הנפח המתאים של חרוזי מגנט עבור הדגימה. כמו כן, יש לבצע אופטימיזציה של כמות הצבע הפלואורסצנטי עבור הנוגדן הרלוונטי. לאחר ביצוע הליך זה, יש לבחון את הנוגדנים המסומנים כדי לקבוע את תפקודם באמצעות בדיקות ביולוגיות רלוונטיות, כגון ELISA, FACS או בדיקות מבוססות תאים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לסמן נוגדנים מופקים ובלתי מופקים באמצעות תגי פלואורסצנציה או מולקולות קטנות אחרות, כגון biotin או תרופות ציטוטוקסיות, תוך שימוש בחרוזי Protein A או G מגנטיים.