ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש Cremaster
19 באוקטובר 2016
מחקר זה מדגים את ההכנה הכירורגית של שריר החולדה להדמיה של השכבה נטולת התאים in vivo. גורמים ניכרים המשפיעים על הדיוק של מדידת רוחב השכבה נטולת התאים נדונים במחקר זה.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לכמת את השינויים המרחביים-זמניים (spatiotemporal) ברוחב השכבה נטולת התאים in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המיקרו-המודינמיקה, ולהבנה טובה יותר של תפקיד ה-cell-philia במיקרו-סירקולציה. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שניתן לכמת את רוחב ה-cell-philia ב-in vivo באופן עקבי ונוח יותר מאשר בטכניקות מדידה ידניות קודמות, שהיו גוזלות זמן רב.
לפני תחילת מדידת רוחב השכבה נטולת התאים, הפעל את קובץ סקריפט ה-pre-MatLab של השכבה נטולת התאים. לאחר מכן, לחץ על "open file" כדי לבחור את קובץ הווידאו לניתוח, וכוונן את גלגול הסיבוב (rotation slide) כדי ליישור אנכי של דפנות הכלי הבודד, תוך שימוש בגלגול הזום (zoom slide) להתאמת רמת הזום לפי הצורך. כאשר הכלי נמצא במיקום המתאים, לחץ על "confirm editing", ולאחר מכן לחץ על "set ROI to crop" כדי להגדיר את אזור העניין.
התמונה המיושרת תוצג בחלון קופץ. התאימו את המלבן המגדיר את המטרה על גבי התמונה לפי הצורך, ולחצו לחיצה כפולה על המטרה כדי לאשר את אזור העניין. לאחר מכן, לחצו על Extract Images כדי למשוך את כל פריימי הווידאו הערוכים כתמונות bitmap רצופות, אשר יישמרו בתיקייה בעלת שם זהה לקובץ הווידאו שנבחר.
כדי למדוד את רוחב השכבה נטולת התאים, לחצו על Select Folder ובחרו בתיקיית התמונות. פריים התמונה הראשון יופיע בפנל תמונת גווני האפור יחד עם היסטוגרמת עוצמת האפור התואמת בפנל היסטוגרמת התמונה. בחרו את פריים התמונה הרצוי מרשימת הבחירה כדי לבצע את הניתוח, ולחצו על Find Vessel Walls כדי לזהות את דופן הכלי הפנימית בתמונה, אשר נקבעת כמיקום שבו שיא פרופיל עוצמת האור עובר מכהה לבהיר על פני שני פיקסלים.
סמנו את median filter כדי להחיל מסנן חציוני על התמונה להפחתת רעש מסוג "מלח ופלפל" (salt and pepper noise). סמנו את auto-contrast לצורך התאמה דיגיטלית של עוצמות התמונה לשיפור הניגודיות שלה. לאחר מכן, בחרו אלגוריתם סף (thresholding algorithm) מתיבת הרשימה כדי לקבוע באופן אוטומטי את ערך הסף המפריד את רמות האפור לשתי מחלקות: פיקסלים לבנים עם רמות אפור מעל ערך הסף, ופיקסלים שחורים עם רמות אפור מתחת לערך הסף.
כדי למדוד את השונות המרחבית של רוחבי השכבה נטולית התאים, הזינו את רזולוציית הפיקסלים בתיבת רזולוציית הפיקסלים. לאחר מכן לחצו על Calculate כדי לקבל את השונות המרחבית של רוחבי השכבה נטולית התאים ולחצו על Export. csv כדי לייצא את נתוני רוחב השכבה נטולית התאים בפורמט של טבלה.
כדי למדוד את השונות הזמנית של רוחבי השכבה נטולת התאים בקו ניתוח ספציפי לאורך הכלי, לחצו על Temporal Variation והזינו את נתוני קצב הפריימים. הזינו את הפריים הראשון והאחרון של התמונות לניתוח בתיבות start frame ו-last frame בהתאמה. התאימו את סרגל הגלישה של קו הניתוח כדי לבחור את מיקום קו הניתוח לאורך הכלי, ואשרו את מיקום קו הניתוח כפי שמוצג הן בתמונות בגווני אפור והן בתמונות הבינאריות.
לאחר מכן, לחצו על Calculate כדי לקבל את השונות הזמנית של רוחב השכבה נטולית התאים ולחצו על Export. csv כדי לייצא את נתוני רוחב השכבה נטולית התאים בפורמט של טבלה. כאן מוצגת זרימה טיפוסית של תאי דם אדומים בעורק ללא הסתעפויות בשריר הקרמסטרי (cremaster muscle) של חולדה, שבה ניתן להבחין בשכבה נטולית התאים בין ליבת ה-RBC לבין הדופן הפנימית של כלי הדם.
ניגודיות טובה בין רכיבים אלו היא קריטית להבטחת הדיוק של מדידות רוחב השכבה נטולת התאים. השלב הראשוני של ניתוח התמונה כלל את זיהוי הדופן הפנימית של כלי הדם. על ידי רכישת פרופיל עוצמת האור לאורך קו הניתוח הניצב לכלי הדם, המיקום מוערך בשיא שבו חלה מעבר מחושך לאור על פני שני פיקסלים.
לאחר מכן, גבולות הליבה של ה-RBC מזוהים באמצעות אלגוריתם סף תמונה (image thresholding), ולאחר מכן ניתן לחשב את רוחבי ה-CFL. מאחר שתאי דם אדומים בשכבה נטולת התאים בעלי מקדמי העברה של אור שונים, ניתן לחלק את ההבדלים ברמות האפור לשתי מחלקות. עם זאת, זיהוי ערך סף מדויק בין שני השיאים בהיסטוגרמה של התמונה עשוי להיות מוגבל עקב איכות תמונה וניגודיות (contrast) נמוכות.
כדי לשפר את הניגודיות בין תאי הדם האדומים לשכבה נטולת התאים, ניתן להשתמש במסנן כחול. הדבר בולט אף יותר בתמונות אלו, שבהן גבולות הגרעינים של תאי הדם האדומים זוהו באופן מדויק יותר באמצעות מסנן כחול. אלגוריתם סף (thresholding) עשוי להשפיע אף הוא על מדידת רוחב השכבה נטולת התאים, כפי שניתן לראות בתמונות אלו, שבהן אלגוריתמי סף שונים הובילו לזיהוי גבולות שונים של גרעיני תאי הדם האדומים, ולכן לרוחבים שונים של השכבה נטולת התאים.
מדידת רוחב השכבה נטולת התאים (cell-free layer) ב-in vivo רגישה מאוד לאיכות התמונות. לכן, יש להקפיד לבצע את הניתוח בזהירות ולהשתמש בעזר אופטי מתאים כדי להשיג איכות תמונה טובה. יתרה מכך, חיוני לבחור את אלגוריתם סף התמונה (thresholding) המתאים כדי להבטיח מדידה מדויקת ועקבית של רוחב השכבה נטולת התאים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את ההכנה הכירורגית של שריר הקרמסטר (cremaster) בחולדה לצורך ויזואליזציה של השכבה נטולת התאים (cell-free layer) in vivo. השיטה מאפשרת כימות עקבי ונוח של רוחב השכבה נטולת התאים, ובכך נותנת מענה לשאלות מרכזיות במיקרו-המודינמיקה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרו-המודינמיקה
- אפיליות תאית (Cell-philia) במיקרו-סירקולציה
רקע
- השכבה נטולת התאים (cell-free layer) היא חיונית להבנת דינמיקת זרימת הדם.
- טכניקות מדידה קודמות היו גוזלות זמן ופחות מדויקות.
- טכניקות ויזואליזציה in vivo משפרות את אמינות המדידה.
מטרת המחקר
- לכימות שינויים מרחביים-זמניים ברוחב השכבה נטולת התאים in vivo.
- לשיפור ההבנה של תפקידה של cell-philia במיקרו-סירקולציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה כירורגית של שריר הקרמסטרה (cremaster) בחולדה.
- שימוש בסקריפט MatLab מוכן לניתוח.
- ניתוח וידאו למדידת רוחב השכבה נטולת התאים (cell-free layer).
- חיתוך אזור עניין (ROI) למדידה ממוקדת.
תוצאות עיקריות
- ניתן למדוד את רוחב השכבה נטולת התאים in vivo בדיוק רב יותר.
- השיטה מספקת חלופה יעילה יותר לטכניקות ידניות.
מסקנות
- טכניקת ההכנה הכירורגית יעילה לצורך ויזואליזציה.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של המיקרו-המודינמיקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
ויזואליזציה כמותית של השכבה חסרת התאים (cell-free layer) בכלי דם זעירים מאפשרת בחינה מדויקת של ההמודינמיקה של מיקרוסירקולציה, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטית בביולוגיה וסקולרית ובגילוי תרופות. מדידה אוטומטית וניתנית לשחזור של רוחב השכבה חסרת התאים משפרת את הביטחון החוזה באישור יעדים בשלבים מוקדמים ומספקת נתונים למודלים תרגומיים של זרימת דם. יכולת זו רלוונטית אסטרטגית עבור צוותי ביו-פארמה המחפשים נקודות סיום כמותיות ואיתנות בקווי מחקר של כלי דם זעירים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה כמותית של דינמיקת זרימה מיקרו-וסקולרית לצורך תיקוף מטרות מבוסס היפותזה.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת תפקידה של השכבה נטולת התאים במיקרו-סירקולציה.
- מספק מדידות אוטומטיות הניתנות לשחזור לצורך תעדוף תיקים בשלבי פיתוח מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק זרימות עבודה מאושרות לניתוח תמונות לצורך כימות עקבי של פרמטרי כלי דם.
- מסייע בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובשחזור התוצאות באמצעות אלגוריתמים אוטומטיים לסף (thresholding).
- מפיק פלטים כמותיים המתאימים לסריקות המשך ולמחקרים השוואתיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את נקודות הקצה למדידת מיקרו-וסקולריות למודלים רלוונטיים למחלה במחקר פרה-קליני.
- מאפשרת המשכיות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות אספקת מדדי המודינמיקה חסונים.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על נתונים כמותיים של זרימת הדם בנימיות (microcirculatory data).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת מדידות מיקרו-וסקולריות כמותיות וסטנדרטיות, המהוות בסיס הן לגילוי מוקדם והן למחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובהבהרה של מסלולים במחקר של מיקרו-סירקולציה.
- סריקה: מספק מדידות כלי דם כמותיות וניתנות לשחזור לצורך מוכנות הבדיקה.
- אנליטיקה: מפיק נתונים מרחביים וזמניים על רוחב השכבה נטולת התאים להשוואה סטטיסטית חזקה.
- מחקר תרגומי: מגשר בין גילוי למודלים פרה-קליניים באמצעות נקודות סיום המודינמיות עקביות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע תהליך (pipeline) אוטומטי וניתן לשימוש חוזר לניתוח תמונות במגוון מחקרים וסקולריים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי מיקרו-כלי דם.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבת קנה המידה של מדידות כלי דם.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) ויעילות הון על ידי אספקת נקודות סיום כמותיות חסונות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף וקידום של מטרות ומודלים וסקולריים המותאמים לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה תוך-חיה (intravital microscopy) ובניתוח תמונות.
- תלוי במערכות דימוי באיכות גבוהה ובתשתית מחשוב לניתוח אוטומטי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדימוי ואלגוריתמי סף (thresholding).
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה לסוגי כלי דם שונים או למודלים שונים של בעלי חיים.
- דיוק המדידה רגיש לאיכות התמונה, לבחירת המסננים ולשיטת קביעת הסף.
