Name: ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש Cremaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: חקור מדידה מדויקת של שכבה חסרת תאים בכלי דם זעירים בעכברוש. השיטה משתמשת בהכנה כירורגית של שריר Cremaster וניתוח וידאו לכימות שינויים מרחביים-זמניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי (NMRC)/מענק מחקר בסיסי שיתופי (CBRG)/0078/2014.

מחקר זה עולה בקנה אחד עם האוניברסיטה הלאומית של סינגפור מוסדיים טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (פרוטוקול שאושר לא. R15-0225). הכנה כירורגי 1. במודל חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cannulations כלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי חולדות זכרים ספראג-Dawley (6 - 7 שבועות) במשקל (203 ± 20) g עם קטמין (37.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו xylazine (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) קוקטייל באמצעות הזרקה (IP) הזרקה (2 מ&quot;ל / ק&quot;ג) . אל לסכם את המחט או להסיר אותו מן המזרק לאחר ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שבעל החיים הורדמו (אושר על ידי הבוהן הצובט), ומניח אותו על משטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה ב 37 מעלות צלזיוס. בעדינות לגלח את השיער על השכמות, צוואר רחם קדמי, בטן תחתונה, רגל אחורית המדיאלי צק אשכים. בעדינות לרסן את הרגליים באמצעות קלטות נייר דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את כל הליכים כירורגיים באמצעות מספריים microdissection ו מלקחיים זווית תוך צפייה דרךסטראו. מניח את כל כלי כירורגיים חדו על מגש לנקב עמיד כדי למנוע פגיעה במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שפשפו את כל האתרים כירורגית 3 פעמים עם יוד לסירוגין ו -70% אלכוהול לפני ביצוע החתך. ריקון כל צנתרים עם 30 IU / ml פתרון הפרין-מלוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 1 - חתך בעור קו האמצע 1.5 ס&quot;מ על השכמות בעזרת זוג מספריים כירורגיות על וריד הצוואר הימני. הפרד את fascia ידי דיסקציה קהה כדי לחשוף את וריד הצוואר ואת cannulate אותו עם צינור פוליאתילן (PE-50) מלא-מלוחים הפרין באמצעות 5-0 תפרים משי. להשרות הרדמה משלים בעת הצורך (1/3 עד 1/2 של המינון ההתחלתי, תוך ורידי (IV)) לאורך כל מהלך הניתוח ולהתנסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הנשמה כדי לשמור patency דרכי נשימה. הפוך 1 - חתך ס&quot;מ 1.5 באזור צוואר הרחם הקדמי. Cannulate קנה הנשימה באמצעות צינור פוליאתילן (PE-205) עם 2-0 תפרי משי כדי לאבטח את הקטטר במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג לחץ דםדרך cannulation על עורק הירך. הפוך 1 - חתך ס&quot;מ 1.5 על פני השטח המדיאלי השמאלי של הרגל האחורית. הפרד את עורק הירך ידי דיסקציה קהה. Cannulate עורק הירך עם צינור פוליאתילן (PE-10) מלא-מלוחים הפרין באמצעות 5-0 תפרים משי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שרירי Cremaster ויזואליזציה הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס תפר משי 5-0 דרך הקודקוד של שק האשכים להאריכו. עושים חתך לאורך המשטח הגחון של שק האשכים. באופן קבוע ליישם פתרון איזוטוני חמים (37 מעלות צלזיוס; pH 7.4) לשריר החשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור שמסביב רקמות חיבור בזהירות וביסודיות באמצעות מטוש הטה-כותנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס תפר משי 5-0 דרך הקודקוד של השריר Cremaster. חותך את התפר לשני חלקים שווים באורכם ו לקשור קשר בכל צד. חותכים את השריר בין שני קשרים ולמתוח אותו על גבי פלטפורמת אישית פרספקס שקוף ידי משיכת תפר בעדינות. לתקןסוף התפר אל הרציף עם נקודת סימון כחולה. הערה: הסרה יסודית של סובבי רקמות חיבור היא קריטית בהשגה בניגוד תמונה מיטבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.2.3 חזור על השלב עד 5 עד 6 קיבעונות מבוצעים. מוציאים בזהירות את השריר Cremaster מן יותרת האשך באמצעות כויה בטמפרטורה גבוהה. Superfuse פתרון איזוטוני חם לשריר החשוף על מנת למנוע התייבשות של הרקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקף את שריר Cremaster עם חתיכות מקופלות של גזה. מכסה את השריר החשוף עם סרט פוליוויניל. חתיכות הגזה עם הסרט יוצרות אגן רדוד להחזיק פתרון איזוטוני חם עבור מטרת מיקרוסקופ מי טבילה (איור 1 א). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החיה על הבמה החיה של מיקרוסקופ intravital (איור 1 ג). חבר את cannulation העורקים למערכת להרכשת נתונים פיזיולוגית לניטור לחץ רצוף (1E איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על השריר לטמפרטורותיור ב 35 ° C עם גוף חימום המצורף מתחת לבמת החי (איור 1 ב). מניח בדיקת טמפרטורה ליד השריר על מנת לספק משוב שלילי על בקר הכח של גוף החימום (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשאיר את החיה על הבמה במשך 15 דקות כדי לאזן עם הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את זרימת דם תחת מיקרוסקופ intravital עם מטרת מי טבילת 40X ו מעבה עבודה מרובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו עורקיק unbranched (&lt;60 מיקרומטר) מבוסס על התמקדות תמונה ברורה ניגוד בין ליבת RBC, קירות CFL וכלי, על מנת למקד את המיקרוסקופ במטוס הקוטבי של כלי הדם. סובב את המצלמה רכובה על גבי מיקרוסקופ כדי ליישר את קיר הכלי אנכי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את זרימת הדם באמצעות מצלמת וידאו במהירות גבוהה בשיעור מסגרת של 3,000 / sec עבור 1 שניות. שמור הווידאו המוקלט בפורמט 8 סיביות בגווני אפור AVI לא דחוס כדי לשמר את איכות התמונה. הערה:<html> מסגרת דולר הקלטת מינימום של 3,000 מסגרות / sec מומלץ לוודא כי מדידת CFL יכולה להתבצע לפחות פעם האחת RBC בתנאי זרימת arteriolar פיסיולוגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במסנן כחול עם שידור שיא באורך גל של 394 ננומטר bandpass ספקטרלי על 310 - 510 ננומטר כדי לשפר את הניגוד בין RBCs ופלזמה. הערה: ודא כי ספקטרום האור עובר דרך המסנן הכחול ממקור האור המיקרוסקופי (100 W מנורת הלוגן) הוא של עוצמת אור הנמוכה כדי למנוע ניזק לרקמות פוטנציאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הניסוי, להרדימו עם ממנת יתר של נתרן pentobarbital. </li></ol></li></ol> ניתוח תמונה 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד מקדים למדידת רוחב CFL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח MATLAB ולהפעיל את הקובץ &#39;CFL_pre.m&#39;. (זה וקבצים MATLAB אחרים ניתן למצוא ב-IP &quot;&gt; ארכיון MATLAB משלימה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;פתח קובץ&#39; כדי לבחור את קובץ הווידאו לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את מחוון &#39;סיבוב&#39; כדי ליישר את דפנות כלי אנכית. הערה: משתמשים יכולים להציג את קווי רשת סיוע עבור יישור הכלי ידי בחירת לחצן האפשרויות &#39;ב- Grid&#39;, ולהתאים את רמת הזום של התמונה על ידי הזזת המחוון &#39;זום&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;אישור עריכה &#39;כדי לאשר את יישור הכלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;גדר ROI כדי היבול &#39;כדי להגדיר את האזור (ROI) ריבית. התמונה המיושרת יוצגה בחלון מוקפץ. התאם את המטרה המלבנית על התמונה, ולחץ לחיצה כפולה על מנת לאשר את ההחזר על ההשקעה. דלג על שלב זה אם החיתוך של תמונה אינו נדרש. הערה: רק כוללת לכלי שייט יחיד ROI לנתח את רוחב CFL מהספינה. לחצו על כפתור &quot;איפוס תמונה &#39;כדי לשחזר את התמונה לצורתו המקורית, במקרה הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על9; חלץ &#39;כדי לחלץ את כל המסגרות ערכת וידאו לתוך תמונות מפת סיביות ברציפות (8 סיביות בגווני אפור&#39; תמונות bmp &#39;פורמט). התמונות שחולצו ניתן למצוא בתיקייה עם שם זהה לזה של קובץ הווידאו שנבחרו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת רוחב CFL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח MATLAB ולהפעיל את הקובץ &#39;CFL_measure.m&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;בחר תיקייה&#39; כדי לבחור את התיקייה המכילה את תמונות חילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התיקייה המכילה את התמונות ולחץ על &#39;בחר תיקייה&#39;. מסגרת התמונה הראשונה בתיקייה תהיה טיעון המוצג בלוח התמונה הגוונים האפור &#39;, יחד עם היסטוגרמה בעצמה אפורה בלוח&#39; תמונת היסטוגרמה &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מסגרת תמונה הרצויה מתיבת הרשימה כדי לבצע את הניתוח, אחרת מסגרת התמונה הראשונה תיבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;מצא דפנות כלי&#39; כדי לזהות את קיר הכלי הפנימי בתמונה, אשר נקבעה על המיקום שבומעברי שיא פרופיל עוצמת אור את צבעם מכהה לבהירים יותר משני פיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק &#39;מסנן חציון&#39; כדי להחיל מסנן חציון אל התמונה כדי להקטין את הרעש &quot;מלח ופלפל&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק &quot;ניגודיות אוטומטי&quot; כדי להתאים את עוצמות תמונה דיגיטלית על מנת לשפר את הניגודיות בתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אלגוריתם thresholding בתיבת הרשימה הקובעת ערך thresholding אוטומטי (τ) המחלק את הרמות האפורות לשתי קבוצות - פיקסלים לבן עם רמות אפורות מעל τ (CFL), ופיקסלים שחורים עם רמות אפורות מתחת τ (ליבת RBC). הערה: ככל שיטה חלופית, השתמש thresholding ידני אם אף אחד אלגוריתם אוטומטי-thresholding מספק thresholding התמונה המתאימה. לחץ על לחצן הבחירה &#39;הידני&#39; ולהתאים את המחוון כדי להגדיר את ערך thresholding הידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את השתנות מרחבית של רוחבי CFL, להיכנס פיקסלים ברזולוציה בתיבה &#39;רזולוציה פיקסל&#39; (ברזולוציהעם הגדרת הניסוי הזה היה 0.42 מיקרומטר / פיקסל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;החישוב&quot; כדי להשיג את הווריאציה המרחבי של רוחבי CFL. לחץ על &#39;ייצוא .csv&#39; כדי לייצא את הנתונים רוחב CFL במתכונת מפוצלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את הווריאציה הזמנית של רוחבי CFL ב קו ניתוח ספציפי לאורך הספינה, לחץ על לחצן הבחירה &#39;Temporal הווריאציה&#39; והזן את מידע מסגרת דולר (שער המסגרת המשמש הגדרת הניסוי הזה היה 3,000 מסגרות / sec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את המסגרת הראשונה ועל המסגרת האחרונה של התמונות לניתוח בתיבות &#39;התחילו Frame&#39; ו &#39;Frame האחרונה&#39;, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המיקום של קו הניתוח לאורך הכלי-ידי הסטת המחוון &#39;ניתוח הקו &quot;. אשר את המיקום של קו הניתוח, אשר באה לידי ביטוי הוא &#39;תמונה בגוונים האפורה&#39; ו &#39;תמונה בינארי &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;חשב&#39; כדי להשיג את הווריאציה הזמנית של רוחבי CFL. CLIck &#39;יצוא .csv&#39; כדי לייצא את נתוני רוחב CFL במתכונת מפוצלת. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+variations+of+cell-free+layer+width+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).</li>
<li>Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+erythrocyte+aggregation+and+flow+rate+on+cell-free+layer+formation+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of erythrocyte aggregation and flow rate on cell-free layer formation in arterioles.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H1870-H1878 (2010).</li>
<li>Namgung, B., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+uneven+red+cell+influx+on+formation+of+cell-free+layer+in+small+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of uneven red cell influx on formation of cell-free layer in small venules.</a> Microvasc Res. 92, 19-24 (2014).</li>
<li>Goldsmith, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Microcirculatory+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Eugene+M.+Landis+Award+Lecture.+The+Microrheology+of+Human-Blood.+Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">The Microcirculatory Society.</a> Eugene M. Landis Award Lecture. The Microrheology of Human-Blood. Microvasc Res. 31 (2), 121-142 (1986).</li>
<li>Buerk, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+We+Model+Nitric+Oxide+Biotransport%3F+A+Survey+of+Mathematical+Models+for+a+Simple+Diatomic+Molecule+with+Surprisingly+Complex+Biological+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Can We Model Nitric Oxide Biotransport? A Survey of Mathematical Models for a Simple Diatomic Molecule with Surprisingly Complex Biological Activities.</a> Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 109-143 (2001).</li>
<li>Tateishi, N., Suzuki, Y., Soutani, M., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dynamics+of+erythrocytes+in+microvessels+of+isolated+rabbit+mesentery%3A+cell-free+layer+and+flow+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Flow dynamics of erythrocytes in microvessels of isolated rabbit mesentery: cell-free layer and flow resistance.</a> J Biomech. 27 (9), 1119-1125 (1994).</li>
<li>Ong, P. K., Cho, S., Namgung, B., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cell-free+layer+formation+on+NO%2FO2+bioavailability+in+small+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of cell-free layer formation on NO/O2 bioavailability in small arterioles.</a> Microvasc Res. 83 (2), 168-177 (2012).</li>
<li>Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NO+bioavailability+by+temporal+variation+of+the+cell-free+layer+width+in+small+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Modulation of NO bioavailability by temporal variation of the cell-free layer width in small arterioles.</a> Ann Biomed Eng. 39 (3), 1012-1023 (2011).</li>
<li>Park, S. W., Intaglietta, M., Tartakovsky, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+stochastic+fluctuations+in+the+cell+free+layer+on+nitric+oxide+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Comput+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impact of stochastic fluctuations in the cell free layer on nitric oxide bioavailability.</a> Front Comput Neurosci. 9, 131(2015).</li>
<li>Ng, Y. C., Namgung, B., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+transient+model+for+prediction+of+arteriolar+NO%2FO2+modulation+by+spatiotemporal+variations+in+cell-free+layer+width%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional transient model for prediction of arteriolar NO/O2 modulation by spatiotemporal variations in cell-free layer width.</a> Microvasc Res. 97, 88-97 (2015).</li>
<li>Sriram, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+small+changes+in+hematocrit+on+nitric+oxide+transport+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Sign%22%5BJournal%5D)">The effect of small changes in hematocrit on nitric oxide transport in arterioles.</a> Antioxid Redox Sign. 14 (2), 175-185 (2011).</li>
<li>Hightower, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cardiovascular+regulation+by+the+blood%2Fendothelium+cell-free+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Integration of cardiovascular regulation by the blood/endothelium cell-free layer.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 458-470 (2011).</li>
<li>Ng, Y. C., Namgung, B., Leo, H. L., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+aggregation+may+promote+uneven+spatial+distribution+of+NO%2FO+in+the+downstream+vessel+of+arteriolar+bifurcations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte aggregation may promote uneven spatial distribution of NO/O in the downstream vessel of arteriolar bifurcations.</a> J Biomech. , (2015).</li>
<li>Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variations+of+the+cell-free+layer+width+may+enhance+NO+bioavailability+in+small+arterioles%3A+Effects+of+erythrocyte+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Temporal variations of the cell-free layer width may enhance NO bioavailability in small arterioles: Effects of erythrocyte aggregation.</a> Microvasc Res. 81 (3), 303-312 (2011).</li>
<li>Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+rheology+in+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte rheology in microcirculation.</a> Jpn J Physiol. 46 (1), Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8743714">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8743714</a> 1-14 (1996).</li>
<li>Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Evaluation+of+Flow+Dynamics+of+Erythrocytes+in+Microvessels+-+Influence+of+Erythrocyte+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels - Influence of Erythrocyte Aggregation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), Available from:
 <a target="_blank" href="http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959">http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959</a> H1959-H1965 (1995).</li>
<li>Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-based+method+for+determination+of+the+cell-free+layer+width+in+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">A computer-based method for determination of the cell-free layer width in microcirculation.</a> Microcirculation. 13 (3), 199-207 (2006).</li>
<li>Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Evaluation+of+Flow+Dynamics+of+Erythrocytes+in+Microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Influence+of+Erythrocyte+Aggregation.+Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels.</a> Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), H1959-H1965 (1995).</li>
<li>Namgung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+histogram-based+thresholding+methods+for+the+determination+of+cell-free+layer+width+in+small+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Meas%22%5BJournal%5D)">A comparative study of histogram-based thresholding methods for the determination of cell-free layer width in small blood vessels.</a> Physiol Meas. 31 (9), N61-N70 (2010).</li>
<li>Ong, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+method+for+cell-free+layer+width+determination+in+small+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Meas%22%5BJournal%5D)">An automated method for cell-free layer width determination in small arterioles.</a> Physiol Meas. 32 (3), N1-N12 (2011).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Syst.%2C+Man%2C+Cybern%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Prewitt, J. M., Mendelsohn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+cell+images%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The analysis of cell images.</a> Ann N Y Acad Sci. 128 (3), 1035-1053 (1966).</li>
<li>Ridler, T. W., Calvard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picture+Thresholding+Using+an+Iterative+Selection+Method%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Syst.%2C+Man%2C+Cybern%22%5BJournal%5D)">Picture Thresholding Using an Iterative Selection Method.</a> IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 8 (8), 630-632 (1978).</li>
<li>Shanbhag, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+Information+Measure+as+a+Means+of+Image+Thresholding%5BTitle%5D)+AND+%22Cvgip-Graph+Model+Im%22%5BJournal%5D)">Utilization of Information Measure as a Means of Image Thresholding.</a> Cvgip-Graph Model Im. 56 (5), 414-419 (1994).</li>
<li>Bishop, J. J., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+erythrocyte+aggregation+and+venous+network+geometry+on+red+blood+cell+axial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of erythrocyte aggregation and venous network geometry on red blood cell axial migration.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (2), H939-H950 (2001).</li>
<li>Yamaguchi, S., Yamakawa, T., Niimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+plasma+layer+in+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Cell-free plasma layer in cerebral microvessels.</a> Biorheology. 29 (2-3), 251-260 (1992).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מדידת רוחב CFL חיונית להבנה טובה יותר של ופרמטרים המודינמיים בזרימת הדם. בפרט, מדידת רוחב CFL שבוצעה mesenteric 6, spinotrapezius 24 ו מוחין 25 microcirculations. המדידה המקובלת של רוחבי in vivo CFL הוגבל הערכות על ידי בדיקה ידנית של מסגרות הווידאו המוקלט. המדידות הידניות הנדרשות המיצוע של מסגרות וידאו מספר רצופות לפני חזותי זיהוי גבולות קירות הבסיס וכלי RBC 15,16. במחקר אחר, isothiocyanate והעמסה (FITC) -labelled RBCs ו isothio...

מחקרים בבעלי חיים in vivo הם חיוניים למדע בסיסי להבנת הפיזיולוגיה והפתולוגיה של האדם. בפרט, מחקרים מיקרו-המודינמיים in vivo יכולים להבהיר את הפגיעה הפוטנציאלית בתפקודי המיקרו-סירקולציה המשתנים על ידי תנאים ריאולוגיים חריגים של הדם. מספר מחקרים מיקרו-המודינמיים קודמים1 השתמשו במודל שריר החולדה להמחשת זרימת הדם המיקרו-וסקולרית. שריר הקרמאסטר הוא שכבה דקה של שריר מפוספס המקיף את האשכים. לפיכך, ניתן לדמיין את זרימת הדם בשריר באמצעות מיקרוסקופ טרנס-תאורה באמצעות חשיפה כירורגית. זה מאפשר לנו לרכוש את תמונות זרימת הדם in vivo ללא שימוש בחומרי פלואורסצנטיות או ניגודיות. בנוסף, ניתן לשלוט על כל זלוף הדם של רשת השרירים על ידי הפחתת זרימת הדם במעלה הזרם עם חסימת אבי העורקיםהבטני 2. בשל יתרונות אלה, נעשה שימוש נרחב במודל שריר הקרמאסטר כדי לחקור את היווצרות שכבה נטולת תאים (CFL) במיקרו-כלי1,3. 
רוחב ה-CFL הוא פרמטר המודינמי בולט במיקרו-סירקולציה, שעורר עניין רב בשל תפקידיו החשובים בוויסות פונקציות מיקרו-סירקולטוריות. ה-CFL נוצר על ידי נדידה רוחבית פנימה הנגרמת על ידי גזירה של תאי דם אדומים (RBCs) לכיוון מרכז הזרימה4. כתוצאה מכך, הגירה זו מובילה לדלדול של תאי דם אדומים ליד דפנות כלי הדם, וכתוצאה מכך בסופו של דבר שכבת פלזמה נטולת תאים. בהתאם לכך, ה-CFL הקודקודי הופך באופן טבעי למחסום דיפוזיה לאספקת חמצן (O2) מליבת ה-RBC לרקמות, ולניקוי תחמוצת החנקן (NO) על ידי ה-RBCs5,6. בנוסף, ניתן לווסת את ייצור ה-NO גם על ידי הווריאציות הדינמיות של רוחב ה-CFL7,8. לכן, יש לברר באופן מלא את תפקידי ה-CFL הן בהובלת גזים והן בוויסות ההומאוסטזיס במיקרו-סירקולציה כדי להבין טוב יותר את זרימת הדם במיקרו-סירקולציה. מחקרים אחרונים התמקדו בגישור בין ההמודינמיקה ופונקציות הובלת הגז של ה-CFLבמיקרו-סירקולציה 9-12. יתר על כן, קבוצה נפרדת של מחקרים חקרה גם כיצד העלייה הפתולוגית בצבירת RBC מווסתת את היווצרות CFL והשפעתה על הזמינות הביולוגית של O2 ו-NO ברקמות13,14. 
תפקידי ה-CFL הופכים משמעותיים יותר במיקרו-סירקולציה שבה הגודל היחסי של רוחב ה-CFL לקוטר הכלי בולט. זה מחייב גישה יעילה של כימות ה-CFL בזרימת הדם in vivo. במיוחד, רכישת תמונות וניתוח תמונות הם שני מרכיבי המפתח הקובעים את הדיוק של מדידת רוחב CFL. הדמיה מוצלחת של זרימת הדם ברקמות צריכה להקדים הכנה כירורגית מתאימה של מודל החיה. בנוסף, יש צורך בטכניקת ניתוח תמונה נכונה כדי להתגבר על המגבלות של מדידות ידניות קונבנציונליות הנגרמות בעיקר על ידי טעויות אנוש15,16. עם התקדמות במכשור אופטי וכוח מחשוב לעיבוד תמונה דיגיטלית, ניתן כעת להשיג מדידה מדויקת ועקבית יותר של רוחב CFL17-19. עם זאת, הדיוק של מדידות אלה, בהיותן מבוססות תמונה, עדיין תלוי בסופו של דבר באיכות התמונות.
לכן, מחקר זה בוחן את הגורמים המשפיעים על מדידת רוחב ה-CFL in vivo. התמקדנו במיוחד בהדגמת ההכנה הכירורגית וניתוח התמונה הדיגיטלית למדידות רוחב ה-CFL בעורקים של שריר השריפה של החולדה.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ תוך-חיוני</td><td>ציוד אולימפוס</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה במהירות גבוהה</td><td>Photron</td><td>1024PCI</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>פילטר כחול</td><td>HOYA</td><td>B390</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>חיישן לחץ ומערכת ביופאק</td><td>מערכת ביופאק</td> TSD104A, בקר טמפרטורת <td>ציוד</td><td>MP100</td></tr><tr><td></td> ציוד <td>Shimaden</td><td>SR 1</td><td></td></tr><tr><td>פלזמה לייט</td><td>בקסטר</td><td>NDC:0338-0221</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>מי מלח 0.9%</td> <td>בראון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הפרין (5,000 יחב"ל/מ"ל)</td><td></td> צינור פוליאתילן LEO <td></td><td></td></tr><tr><td>PE-10</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>427400.024</td> <td>אינץ' OD x .011 אינץ' ID&nbsp;</td></tr><tr><td>צינור פוליאתן PE-50</td><td>בקטון דיקינסון</td><td></td> <td>427411.038 אינץ' OD x .023 אינץ'</td></tr><tr><td>מזהה PE-205 צינור פוליאתן</td><td>בקטון דיקינסון</td> <td>427446.082 אינץ' OD x .062 אינץ' מזהה</td><td></td></tr> <tr><td>2-0 תפר משי שאינו נספג</td><td>Deknatel</td><td>113-S</td><td></td></tr><tr><td>5-0 תפר משי שאינו נספג</td><td>Deknatel</td><td>106-S</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום במחזור מים</td><td>Gaymar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>פישר מדעי</td><td>איזוטמפ 205</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>גזה כותנה סטרילית&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-415-468</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים עם קצה כותנה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>דומונט מלקחיים</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>INS14188</td><td>מכשיר כירורגי</td></tr><tr><td>מיקרו מלקחיים לניתוח</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>INS15915</td><td>מכשיר כירורגי</td></tr><tr><td>מלקחיים לאיריס 1 x 2 שיניים</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>INS15917</td><td>כירורגי מכשיר</td></tr><tr><td>מלקחיים קנולציה של כלי</td><td>שיט קנט סיינטיפיק</td><td>INS500377</td><td>מכשיר כירורגי</td></tr><tr><td>מיקרו מספריים</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>INS14177</td><td>מכשיר כירורגי</td></tr><tr><td></td><td>מספריים קנט סיינטיפיק</td><td>INS14225</td><td>מכשיר כירורגי</td></tr><tr><td>קליפ כלי</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>INS14120</td><td>מכשיר כירורגי</td></tr><tr><td>מערכת צריבה תאומים</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>מכשיר כירורגי</td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש cremaster

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

השכבה נטולת התאים מוגדרת כשכבת הפלזמה הקודקודית בזרימת המיקרו-כלי דם, נטולת כדוריות דם אדומות. מדידת רוחב השכבה נטולת התאים in vivo והווריאציות המרחביות-זמניות שלה יכולה לספק הבנה מקיפה של המודינמיקה במיקרו-סירקולציה. במחקר זה, השתמשנו במערכת מיקרוסקופית תוך-חיונית בשילוב עם מצלמת וידאו מהירה כדי לכמת את רוחב השכבה נטולת התאים בעורקים in vivo. שריר הקרמאסטר של חולדות ספראג-דולי הוצא בניתוח כדי לדמיין את זרימת הדם. כמו כן פותח סקריפט הדמיה מותאם אישית כדי להפוך את עיבוד התמונה והניתוח של רוחב השכבה נטולת התאים לאוטומטי. גישה זו מאפשרת לכמת וריאציות מרחביות-זמניות באופן עקבי יותר מאשר מדידות ידניות קודמות. דיוק המדידה, לעומת זאת, תלוי בחלקו בשימוש בפילטר כחול ובבחירת אלגוריתם סף מתאים. באופן ספציפי, הערכנו את הניגודיות והאיכות של תמונות שנרכשו עם ובלי שימוש במסנן כחול. בנוסף, השווינו חמישה אלגוריתמי סף שונים מבוססי היסטוגרמה של תמונה (Otsu, מינימום, אינטרמוד, בחירה איטרטיבית וסף אנטרופי מטושטש) והמחשנו את ההבדלים בקביעת רוחב השכבה נטולת התאים.

ויזואליזציה של CFL in vivo תלויה במידה רבה על ההכנות כירורגית של החיה. איבוד דם מוגזם או משך ניתוח מורחב עלול לחשוף את החיה לזעזע ומשוגות זרימת דם. שמירה על טמפרטורת רקמות באמצעות כרית חימום וכן פלטפורמה אישית במהלך הניתוח ולהתנסות גם חיונית בשמירה על המצבים הפיסיולוגיים של החולדה. באמצעות מנורת הלוגן W 100 במערכת מיקרוסקופ, אין נזק לרקמות להבחין נצפתה גם בסוף הניסוי. איור 2 א מראה זרימת...

מחקר זה מדגים את ההכנה הכירורגית של שריר החולדה להדמיה של השכבה נטולת התאים in vivo. גורמים ניכרים המשפיעים על הדיוק של מדידת רוחב השכבה נטולת התאים נדונים במחקר זה.

ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש Cremaster

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לכמת את השינויים המרחביים-זמניים (spatiotemporal) ברוחב השכבה נטולת התאים in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המיקרו-המודינמיקה, ולהבנה טובה יותר של תפקיד ה-cell-philia במיקרו-סירקולציה. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שניתן לכמת את רוחב ה-cell-philia ב-in vivo באופן עקבי ונוח יותר מאשר בטכניקות מדידה ידניות קודמות, שהיו גוזלות זמן רב.לפני תחילת מדידת רוחב השכבה נטולת התאים, הפעל את קובץ סקריפט ה-pre-MatLab של השכבה נטולת התאים. לאחר מכן, לחץ על "open file" כדי לבחור את קובץ הווידאו לניתוח, וכוונן את גלגול הסיבוב (rotation slide) כדי ליישור אנכי של דפנות הכלי הבודד, תוך שימוש בגלגול הזום (zoom slide) להתאמת רמת הזום לפי הצורך. כאשר הכלי נמצא במיקום המתאים, לחץ על "confirm editing", ולאחר מכן לחץ על "set ROI to crop" כדי להגדיר את אזור העניין.התמונה המיושרת תוצג בחלון קופץ. התאימו את המלבן המגדיר את המטרה על גבי התמונה לפי הצורך, ולחצו לחיצה כפולה על המטרה כדי לאשר את אזור העניין. לאחר מכן, לחצו על Extract Images כדי למשוך את כל פריימי הווידאו הערוכים כתמונות bitmap רצופות, אשר יישמרו בתיקייה בעלת שם זהה לקובץ הווידאו שנבחר.כדי למדוד את רוחב השכבה נטולת התאים, לחצו על Select Folder ובחרו בתיקיית התמונות. פריים התמונה הראשון יופיע ב

visualization-quantification-cell-free-layer-arterioles-rat-cremaster

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הכנת רקמות מתואר עבור להדמיה של מניפולציה ניסויית בזרימת הדם החי. בעכברים מורדמים זכר, רזה, שרירי מאוד vascularized cremaster מוכן מיקרוסקופיה intravital ללמוד רשתות כלי הדם כולל arterioles, נימים venules. הכנה זו היא מותאמת בקלות לחולדות ואוגרים.

Cremaster עכבר הכנה שריר עבור הדמיה של Intravital microcirculation

מטרת מאמר זה היא להדגים שיטה לייעל את זיהוי immunofluorescent של קולטן אסטרוגן α (ERα) על פרוסות עכברוש pial עורקים באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי immunofluorescent.

הדמיה של קולטן אסטרוגן α ב Arterioles Pial עכברוש באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי Immunofluorescent

מיקרוסקופ דיגיטלי intravital epifluorescence של venules postcapillary ב microcirculation cremasteric היא שיטה נוחה להבנה טובה של אינטראקציה...

בזמן אמת הדמיה דיגיטלית של אינטראקציה ליקוציט-אנדותל של פגיעה איסכמיה reperfusion (IRI) של השריר Cremaster עכברוש

אנחנו מדגימים את מודל רומן עורקי קשירה בשריר spinotrapezius עכברי, לרבות הליך צעד אחר צעד ותיאור של מכשור הנדרש. אנו מתארים את הניתוח ומדידות תוצאה רלוונטיות הנוגעות לשיפוץ כלי דם והרחבת כלי דם ברשת פונקציונלית באמצעות מיקרוסקופ intravital וconfocal.

דגם Spinotrapezius Murine כדי להעריך את ההשפעה של קשירת arteriolar על תפקוד כלי דם וRemodeling

כאן אנו מדווחים טכניקה ניסויית של מיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי לדמיין אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים. טכנולוגיה מיקרוסקופית זה תהיה יקרה כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של מחלת כלי דם ולבדוק סוכנים תרופתיים בתנאי pathophysiological.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

מיקרוסקופיה Intravital של זרימת דם Cremaster העכבר מ 'מציעה ייחודית וסטנדרטיזציה גם במודל vivo לניתוח נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי.

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

כתב יד זה מתאר במבחנה מיקרוסקופ וידאו פרוטוקולים להערכת הפונקציה כלי הדם בעכברוש מוחי התנגדות העורקים. כתב היד מתאר גם טכניקות להערכת צפיפות microvessel עם fluorescently שכותרתו זלוף לקטין ורקמות באמצעות לייזר Flowmetry דופלר.

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוטה עבור בידודו של רבים מן הרשתית עכברוש יכול לשמש אלקטרופיזיולוגיות, סידן הדמיה ואת הלחץ myography מחקרים.

בידוד של רבים ברשתית ללימודי פיזיולוגיה של התא Vivo לשעבר

כאן, אנו מראים כיצד לבצע מיקרוסקופ לאחר הנימי של השריר הראשי של העכבר. בדרך כלל מיושם מודלים שונים של דלקת אלח דם, במיוחד אלה המושרה על ידי נוגדנים ו ציטוקינים, אנו להדגיש את הרלוונטיות שלה במחקר של מוסקולופאאס מעורבים חדירה מוגזמת שרירי לוקיציט.

הסתננות לאוציט של שריר Cremaster בעכברים המוערך על ידי מיקרוסקופ אינטרטל

מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את microcirculation כלילית ברקמת לב מורין חי על ידי ניטור ex vivo של לחץ זלוף העורקים וזרימה השומרת על הלחץ, כמו גם רכיבי עץ כלי דם כולל מיטות נימי pericytes, כמו עורק הספל הוא משומר ולחץ.

מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca2+] ופוטנציאל הממברנה.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

חקור מדידה מדויקת של שכבה חסרת תאים בכלי דם זעירים בעכברוש. השיטה משתמשת בהכנה כירורגית של שריר Cremaster וניתוח וידאו לכימות שינויים מרחביים-זמניים.

ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש Cremaster

גלה סרטונים נוספים