Name: שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: למדו שיטות בידוד ותרבות של תאי שריר צומת סינואטריאלי מעכברים בוגרים לחקר פיזיולוגיה לבבית ומנגנוני קצב לב. השיטה מאפשרת ניסויים אלקטרופיזיולוגיים ודימות תאי לטווח קצר ובינוני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר כריסטיאן ריקרט על הקריאה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי ללב, ריאות ודם (R01-HL088427) ל-CP. EJS נתמך על ידי 5T32-AG000279 מהמכון הלאומי להזדקנות. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Irisawa, H., Noma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+currents+in+mammalian+nodal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Pacemaker currents in mammalian nodal cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).</li>
<li>DiFrancesco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+mechanisms+in+cardiac+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pacemaker mechanisms in cardiac tissue.</a> Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).</li>
<li>Mangoni, M., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+regulation+of+the+heart+automaticity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Genesis and regulation of the heart automaticity.</a> Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).</li>
<li>Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+keeps+us+ticking%3A+a+funny+current%2C+a+calcium+clock%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both.</a> J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).</li>
<li>Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+and+modulation+of+hyperpolarization-activated+HCN4+channels+by+protein+kinase+A+in+the+mouse+sinoatrial+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node.</a> J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).</li>
<li>Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myristoylated+peptides+potentiate+the+funny+current+%28I%28f%29%29+in+sinoatrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes.</a> Channels. 5 (2), 115-119 (2011).</li>
<li>Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressed+pacemaker+activity+of+sinoatrial+node+myocytes+contributes+to+the+age-dependent+decline+in+maximum+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate.</a> Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).</li>
<li>St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKA-independent+activation+of+I%28f%29+by+cAMP+in+mouse+sinoatrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes.</a> Channels. 7 (4), 318-321 (2013).</li>
<li>St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+adenoviral+infection+of+sinoatrial+node+myocytes+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).</li>
<li>Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapidly+activating+delayed+rectifier+K%2B+current+regulates+pacemaker+activity+in+adult+mouse+sinoatrial+node+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).</li>
<li>Mangoni, M., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+hyperpolarization-activated+current+%28I%28f%29%29+in+isolated+mouse+sino-atrial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells.</a> Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).</li>
<li>Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrophysiological+properties+of+spontaneously+beating+pacemaker+cells+isolated+from+mouse+sinoatrial+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node.</a> J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).</li>
<li>Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+C-type+natriuretic+peptide+on+ionic+currents+in+mouse+sinoatrial+node%3A+a+role+for+the+NPR-C+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).</li>
<li>Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Heart+Rate+and+Sinoatrial+Node+Function+in+Mice+Lacking+the+cAMP+Regulator+Phosphoinositide+3-Kinase-%5Cgamma%5C%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\.</a> Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).</li>
<li>Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+constitutive+phosphodiesterase+activity+in+mouse+sinoatrial+node+and+atrial+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium.</a> PloS ONE. 7 (10), e47652(2012).</li>
<li>Groenke, S., Larson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+atrial-specific+knockout+of+sodium-calcium+exchange+eliminates+sinoatrial+node+pacemaker+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity.</a> PloS ONE. 8 (11), e81633(2013).</li>
<li>Torrente, A. G., Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Denyer, J. C., Brown, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+sino-atrial+node+cells%3A+isolation+and+electrophysiological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties.</a> J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).</li>
<li>Thum, T., Borlak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butanedione+monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).</li>
<li>Borlak, J., Zwadlo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+ATPase+inhibitor+2%2C3-butanedione+monoxime+dictates+transcriptional+activation+of+ion+channels+and+Ca%282%2B%29-handling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molec+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins.</a> Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).</li>
</ol>

מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים עבור הבידוד וההתרבות של מיוציטים צומת sinoatrial בדיל באופן מלא מעכברים בוגרים. פרוטוקול הבידוד באופן מהימן מייצר סאמס עכבר פעיל באופן ספונטני מתאים לניתוח אלקטרו מיידי או תרבות שלאחר מכן. פרוטוקולים דומים דווחו על ידי קבוצות רבות אחרות (למשל, לראות את הפניות 11,12,10,13-17). עם זאת, הפרוטוקול שלנו לשמירה על סאמס עכבר בוגר במבחנה משמר את המורפולוגיה האופיינית, פעילות ספונטנית, ואת תכונות אלקטרו של התא ומאפשר למסירת adenoviral של ...

מיוציטים קוצבים צומת sinoatrial של הלב (myocytes sinoatrial, &quot;סאמס&quot;) ליצור פוטנציאל פעולה ספונטני, אומנותי (APS) כי להפיץ דרך שריר הלב ליזום כל לב. ניסויים באמצעות סאמס מבודד בחריפויות ממינים רבים היו חיוניים לגיבוש מבהיר המנגנונים לתרום לדור של פעילות קוצבת. סאמס הוא מאוד cardiomyocytes מיוחד שונה באופן מהותי מן עמיתיהם שריר לב הפרוזדורים חדרית מבחינת מורפולוגיה, פונקציה, ביטוי חלבון. המאפיין העיקרי של נקודות גישה ספונטנית סאמס היא שלילת קוטביות ספונטנית במהלך דיאסטולה שמניע את פוטנציאל הממברנה אל סף כדי לעורר את הבא AP 1,2. זה &quot;פוטנציאל קוצב לב&quot; תלוי בפעילות המתואמת של זרמי קרום שונים כולל &quot;הנוכחי המצחיק&quot; (אני F), T-וזרמי סידן L-סוג, ואת curr מחליף נתרן-סידןאף אוזן גרון (אני NCX), אשר מונע על ידי שחרור 2 + Ca מן הרטיקולום sarcoplasmic 3,4. בעוד סאמס העכבר מבודדים בחריפות מהווים הכנה ניסיוני חיוני לחקר pacemaking, בידודה של סאמס מעכברים יכולה להיות שיטה מאתגר לאמץ בגלל האנטומיה ברור וגודל קטן של SAN העכבר דורש microdissection ניואנסים ואת האנזימטית בשילוב מכני דיסוציאציה של תאים דורש אופטימיזציה זהיר. אנו מספקים כאן הפגנת וידאו מפורטת של פרוטוקול נוצל בהצלחה לבודדת סאמס מעכברים בוגרים עבור צמד תיקון הקלטות 5-8. למיטב ידיעתנו, אין הפגנה ויזואלית כגון זמינה מכל מקור אחר. בנוסף, שיטה חדשה מודגמת שבודד סאמס מעכברים בוגרים יכול להישמר במבחנה במשך מספר ימים, ובכך לאפשר הכניסה של חלבונים, מקודד גנטימולקולות כתב או RNAi באמצעות זיהום adenoviral 9.

<table><tbody><tr><td>ערכת סילגרוארד/אלסטומר</td><td>דאו קורנינג</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>בורוסיליקט 9 אינץ' פיפטות פסטור</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית קטנים ועגולים עם תחתית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית גדולים ועגולים עם תחתית</td><td>קורנינג</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>אלסטאז</td><td>וורת'ינגטון LS002279</td><td></td><td></td>ביוכימי</tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>תמיסת דיסוציאציה של רקמות</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>SAGENT Pharmaceuticals&nbsp;</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>עכבר למינין</td><td>קורנינג</td><td>CB-354232</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית עגולים 12 מ"מ</td><td>פישר&nbsp;</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 24 בארות</td><td>פישר</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Ad-mCherry</td><td>וקטור Biolabs</td><td>1767</td><td></td></tr><tr><td>Ad-eGFP</td><td>וקטור Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק, פיפטת העברה חד פעמית</td><td>פישר סיינטיפיק</td> מיקרו מספריים פישר סיינטיפיק <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>17-467-496</td><td></td></tr><tr><td>דומונט #4 מלקחיים</td><td>Roboz Instruments</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>רקמות מלקחיים</td><td>Roboz Instruments</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח איריס מספריים</td><td>WPI, Inc.</td><td></td><td></td>501264</tr><tr><td>Dissecting Pins</td><td>Fine Science</td><td>Tools 26002-20</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>60353</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G0350500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>K-גלוטמט</td><td>Sigma</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>K-aspartate</td><td>Sigma</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>קריאטין</td><td>סיגמא</td><td>C0780</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>סיגמא</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>סיגמא</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין-B</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>איזופרוטרנול</td><td>קלביוכימיה</td><td>420355</td><td></td></tr><tr><td>Media199</td><td>סיגמא</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>2,3-בוטנדיון מונוקסימה (BDM)</td><td>סיגמא</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>סיגמא</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>סיגמא</td><td>A5611</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>טרנספרין</td><td>סיגמא</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>סלניום</td><td>סיגמא</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין</td><td>GE Healthcare</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין</td><td>היקלון</td><td>SV30010</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת sinoatrial של עכברים בוגרים

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

מיוציטים צומת Sinoatrial (Sams) לשמש כמנהל הקוצבים הטבעיים של הלב, לביצוע כל לב הכה על ידי יצירת פוטנציאל פעולה ספונטני (APS). נקודות גישה הקוצבות אלה משקפים את הפעילות המתואמת של זרמי קרום רבים ורכיבה על אופני סידן תוך תאים. עם זאת המנגנון המדויק אשר מוביל פעילות קוצב ספונטנית סאמס להישאר חמקמק. סאמס מבודדים בחריפות מהווים הכנה הכרחית ניסויים כדי לנתח את הבסיס המולקולרי של pacemaking הלב. עם זאת, לא בוררת את האנטומיה, microdissection המורכב, ותנאי עיכול אנזימטי בררנים מנעו שימוש נרחב של סאמס בחריפות המבודדת. בנוסף, שיטות לא היו זמינות עד לאחרונה להתיר תרבות לטווח הארוך של סאמס ללימודי ביטוי חלבון. כאן אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול ווידאו הפגנה למען בידודה של סאמס מעכברים בוגרים. שיטה מודגמת גם לשמירה על סאמס עכבר בוגר במבחנה עבור expressiעל חלבונים אקסוגניים באמצעות זיהום adenoviral. בחריפות מבודדים סאמס תרבותי מוכן באמצעות שיטות אלה מתאימים מגוון רחב של מחקרים אלקטרו הדמיה.

הפרוטוקולים המתוארים כאן הועסקו בעבר לבודד ספונטני פעיל סאמס מעכברי בוגרים מתאימים מגוון רחב של מחקרי מהדק תיקון שונה 5-8. בנוסף, הפרוטוקולים מאפשרים סאמס מבודדים שאפשר לקיים בתרבות עד שבוע אחד. החדרת גנים לתוך תאים בתרבית יכול להתבצע באמצעות זיהום adenoviral 9. התוצאות המוצגות בסעיף זה נובעים מהעבודות הקודמות שלנו מוצגות כאן כדוגמות המאפיינים של בחריפות סאמס מבודד תרבותי. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

שיטות הם הפגינו לבידוד של מיוציטים צומת sinoatrial (Sams) מעכברים בוגרים ללימודי electrophysiology צמד תיקון או הדמיה. תאים מבודדים ניתן להשתמש ישירות או יכול להישמר בתרבות להתיר ביטוי של חלבונים של עניין, כגון עיתונאים מקודדים גנטית.

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד מיוציטים פעילים ספונטנית מהקשר הסינו-אתריאלי (sinoatrial node) של עכברים עבור ניסויי דימוי או אלקטרופיזיולוגיה לטווח קצר או בינוני. מיוציטים מבודדים מהקשר הסינו-אתריאלי חשובים לחקר מנגנוני קצב הלב, ובמיוחד לחקר זרמי יונים ספציפיים או תזמון של שחרור סידן תוך-תאי. עם זאת, מעט מעבדות משתמשות במיוציטים מבודדים מהקשר הסינו-אתריאלי של עכברים, בין היתר משום שקשה מאוד ללמוד את הפרוצדורה משיטות כתובות בלבד.לאחר הכנת כל התמיסות הנדרשות לבידוד, הסר את הפרווה מחזה בעל החיים באמצעות מספריים. לאחר מכן, בצע חיתוך לובריבית (בית החזה) כדי לחשוף את חלל החזה באמצעות פינצטה לרקמות חיצוניות ומספרי ניתוח. שטוף את חלל החזה עם 2 mL של תמיסת Tyrode's מלאה מחוממת עם heparin.תחת מיקרוסקופ סטריאו, הסירו בזהירות את הריאות והתימוס באמצעות מספריים פנימיים ופינצטת דיסקציה. תוך כדי החזקה עדינה של חוד הלב, חתכו בזהירות את הווריד הנבוב התחתון ואת אבי העורקים כדי להוציא את הלב מחלל החזה. לאחר מכן, העבירו את הלב לאחת מכלי הדיסקציה מסיליקון ושטפו אותו עם 2 עד 4 milliliters של תמיסת Tyrode's מלאה ומחוממת עם הפרין.כוון את הלב כך שהכליים האחוריים יהיו גלויים ופונים כלפי מעלה. לאחר מכן, קבע את הלב על ידי הצמדתו בעזרת סיכות דרך חוד הלב (apex) אל תוך צלחת הניתוח מסיליקון. לאחר מכן, אתר את החריץ שבין החדרים לעליות.באמצעות מספרי הניתוח הפנימיים, בצעו חתך בחריץ תוך שמירה על קרבה לחדרים. שטפו את החריץ ואת החתך בכמות נוספת של תמיסת Tyrode's מלאה מחוממת עם הפרין, לפי הצורך, כדי לאפשר ראייה ברורה של העליות והמסתמים. לאחר מכן, המשיכו לחתוך לאורך החריץ כדי להפריד את העליות מהחדרים.לאחר מכן, העבירו את רקמת העליה לכלי הניתוח השני העשוי סיליקון ושטפו אותה בשלושה מיליליטרים של תמיסת Tyrode's מלאה ומחוממת עם הפרין. לאחר מכן, בעודכם מותחים את הדגימה בעדינות, מקבעו את הרקמה באמצעות סיכות דרך הווריד הרחב התחתון (inferior vena cava). לאחר מכן הפכו את הרקמה כך שהעליה הימנית של בעל החיים תהיה כעת בצדו השמאלי של החוקר והעליה השמאלית תהיה בצדו הימני של החוקר.חשוב מאוד להשיג ולזהות את האוריינטציה כדי לבודד את הרקמה הנכונה. המשיכו לקיבוע הרקמה באמצעות סיכות דרך הווריד החולף העליון (superior vena cava), ולאחר מכן דרך התוספתות של העליות הימנית והשמאלית. הסירו שאריות שומן או רקמה אחרת כדי לאפשר תצפית ברורה על הדגימה.לאחר מכן, פתחו את הדופן הקדמית של העליות על ידי חיתוך דרך הוורידים החלולים. סובבו את הצלחת לפי הצורך כדי להשקיף על הווריד החלול העליון והתחתון. reposition את המסמרים לפי הצורך כדי להמחיש את המחיצה הבין-עליית.לאחר מכן, גזרו לאורך המחיצה הבין-עליותית כדי להסיר את העליה השמאלית. מקבעו מחדש את הדגימה בעזרת סיכות, מתחו אותה בעדינות, והסירו את השומן שנמצא מאחורי הקשר הסינו-עליתי. לאחר מכן, הסירו את התהייכות של העליה הימנית ושחררו את הקשר הסינו-עליתי על ידי גזירה לאורך ה-crista terminalis, הנראית כפס כתום כהה הגובל בתהייכות העליותית.הצמד מחדש או שחרר את הרקמה הצומתית וגזור אותה לרוחבה כדי להפיק שלושה רצועות שוות בגודלן. בהליך זה, העבר באמצעות פיפטה צרה שעברה חישול באש שלוש רצועות של רקמת הצומת הסינו-אתריאלית למסורה הראשונה מבין שלוש המסורות הקטנות בעלות התחתית העגולה, המכילה 2.5 milliliters של תמיסת Tyrode's דלה בסידן ומגנזיום, והדגר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, העבר את רצועות הרקמה למסורה השנייה בעלת התחתית העגולה, המכילה 2.5 milliliters של תמיסת Tyrode's דלה בסידן ומגנזיום.שטפו את רצועות הרקמה על ידי סיבוב עדין של המבחנה או על ידי פיפטינג עדין באמצעות פיפטה צרה. אין להפוך את המבחנה. לאחר מכן, העבירו את רצועות הרקמה למבחנה השלישית בעלת התחתית העגולה והקטנה המכילה 2.5 milliliters של תמיסת Tyrode's עם רמה נמוכה של calcium magnesium, וחזרו על שלב השטיפה.לאחר מכן, העבירו את הרצועות למבחנה גדולה בעלת תחתית עגולה המכילה 2.5 milliliters של תמיסת Tyrode's עם ריכוז נמוך של סידן ומגנזיום בתוספת אנזימים. ערבבו בכל חמש דקות על ידי סיבוב עדין של המבחנה. לאחר העיכול האנזימטי, השתמשו בפיפטה צרה שעברה עיבוד בלהבה (fire polished) כדי להעביר בעדינות את רצועות הרקמה למבחנה הראשונה מבין שלוש מבחנות קטנות בעלות תחתית עגולה המכילות תמיסת KB משופרת.לאחר מכן, העבירו את הפסים דרך השפופרות השנייה והשלישית בעלות התחתית העגולה והקטנה כדי לשטוף את הרקמה, לפני ההעברה לשפופרת הגדולה בעלת התחתית העגולה המכילה תמיסת KB. בעזרת פיפטה גדולה יותר שעברה ליטוש באש, הפרדו את התאים בשפופרת הגדולה בעלת התחתית העגולה על ידי טריטורציה (trituration) מתמדת, תוך הקפדה להשאיר את שפופרת ההפרדה טבולה באמבט מים בטמפרטורה של 35 °C ולהימנע מהחדרת בועות לתמיסה. מצאנו כי פליטה חזקה של התמיסה בתדירות של בערך פעם אחת לשנייה או 1 Hz היא היעילה ביותר.כעת הוסיפו 75 µL של תמיסת אדפטציה של sodium chloride calcium chloride לרקמות. סובבו בעדינות לערבוב והדגרימו אותן למשך חמש דקות. המשיכו להוסיף סידן במנות כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.לאחר התאדמות מחדש לסידן, אספו את המיוציטים הסינו-אטריאליים על ידי השקעה למשך כ-10 דקות או באמצעות סבוב בצנטריפוגה במהירות של 2,000 ×g למשך שלוש דקות. עבור תאים שבודדו באופן אקוטי, הסירו בעדינות והשליכו כ-5 milliliters של הנוזל העליון באמצעות פיפט העברה. לאחר מכן, אחסנו את התאים בטמפרטורת החדר למשך עד שמונה שעות לצורך ניסויי patch clamp.בשלב הבא, ניתן לבצע הערכות תפקודיות של המיוציטים הסינו-אטריאליים המבודדים באמצעות הקלטות patch clamp עבור פוטנציאלי פעולה ספונטניים וזרמי ממברנה. ניתן להחזיק מיוציטים סינו-אטריאליים בעלי פעילות ספונטנית בתרבית למשך שישה ימים. התאים המגודלים בתרבית שומרים על מורפולוגיה כללית הדומית מאוד לזו של המיוציטים הסינו-אטריאליים המבודדים באופן אקוטי, ללא שינויים משמעותיים באורך הממוצע, ברוחב, בשטח החתך או בקיבול הממברנה של התאים המגודלים בתרבית בהשוואה לתאים המבודדים באופן אקוטי.התאים מתאימים למגוון של מחקרים ניסיוניים, כגון הקלטות current clamp ו-voltage clamp. מוצגים כאן כדוגמאות פוטנציאלי פעולה ספונטניים והזרם המצחיק (funny current). לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים את הדיסקציה של הצומת הסינו-אטריאלית, את בידוד התאים ואת החזרת הסידן תוך כשעתיים, כך שהתאים יהיו מוכנים לניסויים שלך.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי אוריינטציית הרקמה היא קריטית לה diseection מוצלח, וכי יש לייעל את שלבי הדיסוציאציה האנזימטית והמכנית כפי שפורט בטקסט. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש במיוציטים המבודדים מהקשרי sinoatrial למגוון ניסויים, כולל אלקטרופיזיולוגיה של תא בודד, דימוי סידן ואימונוציטוכימיה. ניתן גם לשמר את התאים בתרבית עבור ניסויים הדורשים מניפולציה גנטית או ביטוי של מולקולות דגלית (reporter molecules).לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו מבודדים מיוציטים מהקשרי sinoatrial מעכברים בוגרים. בהצלחה בניסוייכם.

methods-for-isolation-culture-functional-characterization-sinoatrial

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון וידאו זה מדגים את ההליך לבידוד צומת סינופרוזדורי או SAN מלב העכבר. ה-SAN מאכלס את התאים הסינואפרוזדוריים שיוזמים את פעימות הלב על ידי יצירת פוטנציאלי פעולה ספונטניים.

בידוד צומת סינופרוזדורי ממודל עכבר: הליך לקצירת צומת SA מלב מורין

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

הפרוטוקול הזה משמש כדי לבודד פרפור לב בודד מהלב של העכבר המבוגר באמצעות הגישה העיכול קטע. גישה זו משמשת כדי לבודד את הפרפור הימני או השמאלי, שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את פרפור מיציט אלקטרופיזיולוגיה במחקרים הדבקת מהדק.

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טרנס-תירטוי ותרבות ארוכת טווח של עכבר בוגר וקרדיומיוציטים של חולדות.

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

הפרוטוקול המוצג כאן מספק גישה שלב אחר שלב לבידוד מקרופאגים תושבי לב מאזור הצומת הסינואטרלי (SAN) והצומת האטריובנטריקולרי (AVN) של לבבות העכברים.

בידוד ותרבות של מקרופאגים לבביים תושבים מהצומת הסינואטריאלית והאטריובנטריקולרית של מורין

פרוטוקול זה מתאר שינויים בשיטת לנגנדורף כולל עומק שינון אבי העורקים לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרזדורים חדריים מעכברים בוגרים.

שינויים בשיטת לנגנדורף לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרשים בוגרים

למדו שיטות בידוד ותרבות של תאי שריר צומת סינואטריאלי מעכברים בוגרים לחקר פיזיולוגיה לבבית ומנגנוני קצב לב. השיטה מאפשרת ניסויים אלקטרופיזיולוגיים ודימות תאי לטווח קצר ובינוני.

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

גלה סרטונים נוספים