שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד מיוציטים של בלוטות סינו-אטריאליות פעילות באופן ספונטני מעכברים לניסויים אלקטרופיזיולוגיים או הדמיה לטווח קצר או בינוני. מיוציטים מבודדים של בלוטות סינו-פרוזדוריות חשובים לחקר מנגנוני קוצב הלב, בפרט לחקר זרמי יונים ספציפיים או תזמון שחרור סידן תוך תאי. אבל מעט יחסית מעבדות משתמשות במיוציטים סינו-פרוזדוריים מבודדים מעכברים, בין השאר מכיוון שקשה מאוד ללמוד את ההליך משיטות כתובות בלבד.

לאחר הכנת כל הפתרונות הנדרשים לבידוד, הסר את הפרווה מחזה החיה בעזרת מספריים. לאחר מכן חצו את כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל החזה באמצעות מלקחיים חיצוניים של רקמות ומספריים לדיסקציה. שטפו את חלל החזה עם שני מיליליטר של טירוד שלם מחומם עם הפרין.

תחת מיקרוסקופ מנתח, הסר בזהירות את הריאות ואת בלוטת התימוס באמצעות מספריים פנימיים ומלקחיים דיסקציה. תוך כדי החזקה עדינה של קודקוד הלב, חתכו בזהירות את הווריד הנבוב התחתון ואת אבי העורקים כדי להסיר את הלב מחלל החזה. לאחר מכן העבירו את הלב לאחד מכלי חיתוך הסיליקון ולאחר מכן שטפו אותו עם שניים עד ארבעה מיליליטר של טירוד שלם מחומם.

כוון את הלב כך שהכלים האחוריים נראים ופונים כלפי מעלה. לאחר מכן, שתק את הלב על ידי הצמדתו דרך הקודקוד לתוך צלחת חיתוך הסיליקון. לאחר מכן, אתר את החריץ בין החדרים לפרוזדורים.

בעזרת מספריים הדיסקציה הפנימית, בצע חתך בחריץ תוך שמירה עליו קרוב לחדרים. שטוף את החריץ ואת החתך עם טירוד שלם מחומם נוסף לפי הצורך כדי לאפשר תצוגה ברורה של הפרוזדורים והשסתומים. לאחר מכן המשיכו לחתוך לאורך החריץ כדי להפריד את הפרוזדורים מהחדרים.

לאחר מכן, העבירו את רקמת הפרוזדורים לכלי החיתוך השני מסיליקון ושטפו אותה בשלושה מיליליטר של טירוד שלם מחומם. לאחר מכן, תוך מתיחת התכשיר בעדינות, הצמידו את הרקמה דרך הווריד הנבוב התחתון. לאחר מכן הפכו את הרקמה כך שהפרוזדור הימני של החיה נמצא כעת בצד שמאל של הנסיין והאטריום השמאלי נמצא בצד ימין של הנסיין.

חשוב מאוד להשיג ולזהות אוריינטציה על מנת לבודד את הרקמה הנכונה. המשך להצמיד את הרקמה דרך הווריד הנבוב העליון, ואז את נספחי הפרוזדורים הימנית והשמאלית. הסר את כל השומן שנותר או רקמה אחרת כדי לאפשר תצוגה ברורה של התכשיר.

לאחר מכן, פתח את הדופן הקדמית של הפרוזדורים על ידי חיתוך דרך הוורידים הנבוביים. סובב את המנה לפי הצורך כדי לנתח את הוורידים העליונים והתחתונים. מקם מחדש את הפינים לפי הצורך כדי לדמיין את המחיצה הבין-פרוזדורית.

לאחר מכן חותכים לאורך המחיצה הבין-פרוזדורית כדי להסיר את האטריום השמאלי. הצמידו מחדש את התכשיר, מתחו אותו בעדינות והסירו את השומן מאחורי הצומת הסינו-אטריאלי. לאחר מכן, הסר את התוספתן הפרוזדורי הימני ואז שחרר את הצומת הסינו-פרוזדורי על ידי חיתוך לאורך ה-crista terminalis המופיע כפס כתום כהה הגובל בתוספתן הפרוזדורים.

הצמד מחדש או שחרר את ההצמדה של רקמת הצומת וחתוך אותה לרוחב כדי ליצור שלוש רצועות שוות בגודלן. בהליך זה, באמצעות הפיפטה הצרה המלוטשת באש, העבירו שלוש רצועות של רקמת בלוטת סינוס לראשונה מבין שלושת הצינורות התחתונים העגולים הקטנים המכילים 2.5 מיליליטר מגנזיום דל סידן Tyrode's ודגרו למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, העבירו את רצועות הטישו לצינור התחתון העגול הקטן השני המכיל 2.5 מיליליטר מגנזיום דל סידן Tyrode's.

שטפו את רצועות הטישו על ידי סיבוב עדין של הצינור או על ידי פיפטינג עדין עם הפיפטה הצרה. אין להפוך את הצינור. לאחר מכן העבירו את רצועות הטישו לצינור התחתון העגול הקטן השלישי המכיל 2.5 מיליליטר מגנזיום דל סידן Tyrode's וחזרו על שלב הכביסה.

לאחר מכן, העבירו את הרצועות לצינור התחתון העגול הגדול המכיל 2.5 מיליליטר מגנזיום דל סידן Tyrode's עם אנזימים. מערבבים כל חמש דקות על ידי סיבוב עדין של הצינור. לאחר עיכול האנזים, השתמש בפיפטה צרה מלוטשת אש כדי להעביר בעדינות את רצועות הרקמה לראשונה מבין שלושת הצינורות התחתונים העגולים הקטנים המכילים תמיסת KB שונה.

לאחר מכן העבירו את הרצועות דרך הצינורות התחתונים העגולים הקטנים השני והשלישי כדי לשטוף את הרקמה לפני העברתם לצינור התחתון העגול הגדול המכיל תמיסת KB. בעזרת הפיפטה המלוטשת באש הגדולה יותר, נתק את התאים בצינור התחתון העגול הגדול על ידי טריטורציה מתמדת, תוך הקפדה על שמירת צינור הדיסוציאציה שקוע באמבט המים של 35 מעלות צלזיוס וכדי להימנע מהכנסת בועות לתמיסה. מצאנו שגירוש בכוח של התמיסה בתדר של בערך אחד לשנייה או הרץ אחד עובד הכי טוב.

כעת הוסף 75 מיקרוליטר של תמיסת הסתגלות נתרן כלורי סידן כלורי לרקמות. מערבבים בעדינות כדי לערבב ולדגור אותם במשך חמש דקות. המשך להוסיף סידן במרווחים כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

לאחר הסתגלות מחדש של סידן, אספו את המיוציטים הסינו-פרוזדוריים על ידי מתן אפשרות להם להתיישב במשך כ-10 דקות או על ידי צנטריפוגה ב-2,000 פעמים גרם למשך שלוש דקות. עבור תאים מבודדים באופן חריף, הסר בעדינות והשליך כחמישה מיליליטר של הסופרנטנט באמצעות פיפטת העברה. לאחר מכן אחסן את התאים בטמפרטורת החדר עד שמונה שעות לניסויי מהדק טלאי.

לאחר מכן, ניתן לבצע הערכות תפקודיות של מיוציטים סינו-פרוזדורים מבודדים באמצעות הקלטות מהדק טלאי עבור פוטנציאל פעולה ספונטני וזרמי ממברנה. ניתן לשמור על מיוציטים סינו-פרוזדוריים פעילים באופן ספונטני בתרבית עד שישה ימים. התאים המתורבתים שומרים על מורפולוגיה כוללת הדומה מאוד לזו של מיוציטים סינו-פרוזדורים מבודדים באופן חריף ללא שינויים משמעותיים באורך הממוצע, ברוחב, בשטח החתך או בקיבול הממברנה של תאים מתורבתים בהשוואה לתאים המבודדים באופן חריף.

התאים מתאימים למגוון מחקרים ניסיוניים כגון הקלטות מהדק זרם ומתח. מוצגים כאן כדוגמאות פוטנציאל פעולה ספונטני והזרם המצחיק. לאחר השליטה, ניתן להשלים את דיסקציה של הצומת הסינו-פרוזדורית, הבידוד וההחדרה מחדש של הסידן תוך כשעתיים, כך שתוכלו להכין תאים לניסויים שלכם.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי כיוון הרקמה הוא קריטי לדיסקציה טובה וכי יש לייעל את שלבי הדיסוציאציה האנזימטיים והמכניים כמתואר בטקסט. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש במיוציטים של הצומת הסינו-פרוזדורי המבודד למגוון ניסויים כולל אלקטרופיזיולוגיה של תא בודד, הדמיית סידן ואימונוציטוכימיה. ניתן לשמור את התאים גם בתרבית לניסויים הדורשים מניפולציה גנטית או ביטוי של מולקולות מדווחות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד מיוציטים סינו-פרוזדוריים מעכברים בוגרים. בהצלחה בניסויים שלך.