Adenofection: שיטה בחקר התפקיד של מלוויהם מולקולריים הסלולרית Morphodynamics ידי ניסויי דלדול-הצלה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאפשר ביצוע ניסויי הצלת דלדול בתנאים השומרים על שלמות התא והומאוסטזיס של חלבון. לאנליזות פונקציונליות של תהליכים ביולוגיים ברמת התא הבודד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתפקודי חלבון ודרישות מבנה בדינמיקה של תאים כגון מיטוזה והתמיינות תאים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לדלל חלבון מעניין ולהציג מחדש במקביל גרסה של חלבון זה ברמה הניאו-פיזיולוגית במדידה של אוכלוסיית תאים. התחל בציפוי כלי זכוכית תחתונים בפריברונקטין. לשם כך, יש לדלל מיליגרם אחד למיליליטר מלאי פירברונקטין אחד עד 100 עם PBS סטרילי.

הוסף מיליליטר אחד לכל צלחת של 35 מיליליטר כדי לכסות את כל המשטח. דגירה למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. במהלך הדגירה, אלפא MEM לפני חם הוסיף 10% FBS ו-0.05% טריפסין EDTA ל-37 מעלות צלזיוס.

לאחר 45 דקות של דגירה, התחל להכין את תמיסת התאים. שאפו את המדיום מצלחת של 10 סנטימטר של תאי HeLa RFP H2B. ולשטוף בעדינות פעמיים עם 1.5 מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA.

השאירו 0.5 מיליליטר טריפסין EDTA על הצלחת לאחר השאיפה האחרונה. ודגרו על התאים במשך שתיים-שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ו-5% פחמן דו חמצני.

הקש בעדינות על הצלחת. והתבונן בשכבת התא מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שכל התאים נותקו. לאחר מכן הוסף 10 מיליליטר בינוני ופיפטה בעדינות מספר פעמים כדי להפריד בין התאים ולהעביר את מתלה התאים בצינור של 15 מיליליטר.

ספרו דגימה של 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, שאפו את תמיסת הפיברונקטין מכלי תחתית הזכוכית. אל תאפשר לפיברונקטין להתייבש לפני ציפוי התאים.

הכן תמיסת תרחיף תאים לצלחת 1.5 כפול עשרה עד חמישית תאים לכל צלחת של 35 מילימטר בשני מיליליטר בינוני. לוחית אחת של 35 מילימטר בנוסף למספר התנאים על מנת לספור את מספר התא לפני התמרת הנגיף. דוגרים במשך 30 עד 45 דקות.

לאחר שחלף זמן הדגירה, בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מופרדים היטב. כפי שניתן לראות כאן. מחזירים את הצלחות לחממה ומגדלים את התאים עד למחרת.

ביום שלאחר הציפוי, ודא שהתאים הגיעו לצפיפות של לפחות 50%צפיפות תאים נמוכה מ-50% מביאה לירידה ביעילות העברת הנגיף. שונות מוגברת של ביטוי חלבון לתא, ורעילות תאים מוגברת. לאחר מכן קצרו את התאים מהצלחת המצופה הנוספת כמו קודם.

וספרו את מספר התאים. חשב את נפח הנגיפים הנדרש להתמרה יעילה של התאים. סמן צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לכל מצב.

ולהוסיף 400 מיקרוליטר אלפא MEM חם מינוס. לאחר הפשרה איטית של הנגיפים על קרח, הוסף את הנפח הנדרש של כל וירוס לצינורות וערבב בעדינות על ידי פיפטינג. לאחר מכן, לאחר שאיבת המדיום מהתאים, הוסף בעדינות את תערובת הנגיף בצורת טיפה.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. כל 15 דקות למשך שעה, ערבבו את הצלחות בזהירות מתחת למכסה המנוע הסטרילי כדי לכסות את התאים בנגיף. שימוש בכמות קטנה של מדיום מקל על מגע הנגיף עם התאים.

לאחר הדגירה, פיפטה בעדינות 1.6 מיליליטר אלפא MEM מינוס לכל צלחת לקבלת נפח כולל של שני מיליליטר. לאחר מכן התחל לסנכרן תאים על ידי הוספת שני תימידין מילי-מולרי לפני הדגירה של התאים למשך שעתיים נוספות. בינתיים, הכינו את תערובת הטרנספקציה של siRNA על ידי הוספת מיקרו-שפופרת 139 מיקרוליטר מים סטריליים, 50 מיקרוליטר של סידן כלורי מולארי אחד ו-11 מיקרוליטר של 20 מיקרו-מולרי siRNA.

אם אין צורך ב-siRNA, החלף את כמות ה-siRNA במים סטריליים כדי לבצע טרנספקציה ריקה. הוסף תמיסת HBSS2X טיפה חכמה לאט לתערובת הסידן כלוריד siRNA. מערבבים בעדינות פעמיים על ידי הזרקת אוויר באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר.

מכיוון שמשקעים קטנים יותר מביאים ליעילות טרנספקציה טובה יותר. לאחר מכן דגרו את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה מוסיפים לאט לאט 200 מיקרוליטר טיפה חכמה לכל צלחת ומערבבים לערבב.

דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 16 שעות. למחרת, הוציאו את הכלים מהחממה והעבירו אותם למכסה המנוע של תרבית רקמות. לאחר שטיפת התאים פעמיים עם שני מיליליטר של הפיס חם, הוסיפו שני מיליליטר אלפא MEM מינוס לפני שתחזרו לחממה.

שבע שעות לאחר מכן, הוסף שני תימידין מילימולר לצלחות לפני החזרתם לחממה. עבוד עם לא יותר מארבע לוחות תאים בכל פעם מכיוון ששינויי טמפרטורה משפיעים על אורך מחזור התא. למחרת, 48 שעות לאחר טרנספקציה של siRNA וזיהום בנגיף, שטפו את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS חם ואז הוסיפו שני מיליליטר אלפא MEM ללא פנול אדום להדמיית תאים חיים.

דגירה במשך שבע שעות. בצע ניסויי הדמיית תאים חיים לטווח קצר על תאים מיטוטיים עם מיקרוסקופ הפוך המצויד בתא לח של 5% פחמן דו חמצני מווסת תרמו. לפני הרכישה, ודא שהתא הגיע לטמפרטורה המתאימה של 37 מעלות צלזיוס.

הנח את הכלים המתורבתים בתא המיקרוסקופ שעה לפני הרכישה כדי לאפשר שיווי משקל תקין של המדיום ולמנוע סחף פוקוס עקב שינויי טמפרטורה. בחן את המצב המיטוטי של התאים. בשלב זה.

10 עד 15% מהתאים צריכים להיות בשלבים המוקדמים של המיטוזה. במהלך זמן שיווי המשקל, הגדר את פרמטרי הרכישה כפי שנקבעו בניסויים קודמים. חשוב להשיג רזולוציה מתאימה ללא הלבנת תמונות.

מכיוון שהדבר גורם לנזק לתאים ומפריע להתקדמות המיטוטית. בחר מספר שדות המכילים תאים שנמצאים בכניסה מיטוטית לכל תנאי כדי לקבל מספר משמעותי של תאים לניתוח מבלי לחרוג ממרווח הרכישה. לאחר בחירת כל התחומים, אפס את המיקוד והתחל את הרכישה מהר ככל האפשר.

שימוש בדיסק מסתובב יכול למקד את המערכת. מערך טיפוסי יכלול ארבעה תנאים שונים. שבעה שדות לכל צלחת.

ושני ערוצי צבע במרווח של 1.5 עד שתי דקות על פני תקופה של 75 דקות. קבע קריטריונים מוגדרים היטב לניתוח סוגי פנואים מיטוטיים בתאים, אשר יהיו תלויים בסמנים הפלואורסצנטיים שבהם נעשה שימוש. בניגוד לטרנספקציה של BAG3 GFP, DNA פלזמי, כפי שנראה משמאל, אדנופיקציה עם אדנו-וירוסים מוכשרים המוצגים כאן מימין מאפשרת ביטוי הומוגני ויעיל יותר של BAG3 GFP.

ברוב אוכלוסיית התאים בריבוי זיהום נמוך. כתם מערבי מייצג זה מראה כי אדנופקציה עם siRNAs ספציפיים ל-BAG3 ו-adenovirus BAG3 GFP מאפשר דלדול יעיל של BAG3 אנדוגני והחדרה מחדש של חלבון BAG3 GFP ברמות כמעט אנדוגניות. כפי שמוצג כאן, אדנופקציה יכולה לשמר הומאוסטזיס חלבון מכיוון שאין עלייה ניתנת לזיהוי ברמות חלבוני הלם החום הנגרמים על ידי לחץ בתאי HeLa שעברו אדנופט.

בניגוד לתאי HeLa שטופלו בגורם המתח הפרוטאוטוקסי, MG132. כאן אנו רואים כי התקדמות התאים דרך מיטוזה אינה מופרעת באופן משמעותי על ידי אדנופקטיה כפי שמוצג על ידי תמונות ה-con focal time lapse מתאי HeLa המוגדרים עם siRNA בקרה ו-BacMam GFP alpha Tubulin. ו-BacMam FRP Actin.

הגרף מציין את שיעור התאים עם מיטוזה חריגה. תאים עם siRNA ספציפי ל-BAG3 בלבד הראו עלייה של פי שניים ברמת הפגמים המיטוטיים. כפי שמתואר על ידי הפס האדום.

אשר שוחזר קרוב לרמת תא הבקרה על ידי החדרה מחדש של BAG3 GFP המוצג על ידי הפס השחור. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע ניסויי הצלה של דלדול באמצעות adenofection. שיטה זו מספקת מערכת מהירה ופשוטה ליצירת דפיקות היפומורפיות לניתוח פונקציות מבנה ברקעים תאיים מרובים.

בעקבות שיטה זו, ניתן לזהות דרישות מבניות מרכזיות על החלבון המעניין עבור פונקציה נתונה. לאחר מכן ניתן להשתמש בגישות אחרות של עריכת גנום כדי להעמיק את המכניקה המעורבת.