Name: נביגה יעילה של שמר האפייה בתוך פורמט 96 multiwell (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: למדו שיטה יעילה לנביגת שמר האפייה בפורמט 96-well לסקרינינג גבוה-תפוקה. השיטה משפרת אווירור ומאפשרת מחקר גנטי ב-Saccharomyces cerevisiae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ג&#39;וזף פ הילי מאוניברסיטת מסצ&#39;וסטס בבוסטון (LSH) ו R15 GM86805 מ- NIH (LSH). SMP הוא נתמך בחלקו על ידי עמיתי Sanofi-ג&#39;נזיים באוניברסיטת מסצ&#39;וסטס בבוסטון.

1. הכנות לקראת נביגה הערה:. התקשורת המתוארת בפרוטוקול זה מבוצע באמצעות 13,17 מתכונים ושיטות תקן הטבלה 1 נותנת את הניסוח עבור 1 ליטר של התקשורת השונה בשימוש בפרוטוקול זה. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;"> bacto Peptone </td><td style="width: 50px;"> תמצית שמרים </td><td style="width: 50px;"> bacto אגר </td><td style="width: 60px;"> דקסטרוז </td><td style="width: 70px;"> אשלגן יצטט </td><td style="width: 60px;"> גליצרול </td><td style="width: 60px;"> DDH 2 O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> צלחות YPG </td><td> 20 גרם </td><td> 10 גרם </td><td> 20 גרם </td><td> - </td><td> - </td><td> 30 מ&quot;ל </td><td> 970 מ&quot;ל </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> צלחות YPD </td><td> 20 גרם </td><td> 10 גרם </td><td> 20 גרם </td><td> 20 גרם </td><td> - </td><td> - </td><td> 1,000 מ&quot;ל </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> נוזלי YPD </td><td> 20 גרם </td><td> 10 גרם </td><td> - </td><td> 20 גרם </td><td> - </td><td> - </td><td> 1,000 מ&quot;ל </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> נוזל YPA </td><td> 20 גרם </td><td> 10 גרם </td><td> - </td><td> - </td><td> 20 גרם </td><td> - </td><td> 1,000 מ&quot;ל </td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;"> תקשורת נביגה </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 גרם </td><td> - </td><td> 1,000 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 1:. ניסוחים מדיה סכומים ניתנים 1 ליטר של התקשורת. פרטים על תקשורתניתן למצוא מרכיבים של חומרי הטבלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כל תאי Sporulating יהיו גנוטיפ הזהה, בצע הליך זה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן שמרים ההפשרה לשמש לצלחת YPG (YPGlycerol). לגדול שמרים במשך 12-16 שעות על 30 מעלות צלזיוס. חשוב לציין, תאי sK1 עומדים גם sporulate, כך זני sK1 אסור להשאיר יותר מדי זמן על צלחות YPG, או שהם עשויים sporulate על הצלחת. הערה: זן טרי מופשר גדל על YPG הוא העדיף, כמו ניצול של גליצרול כמקור פחמן דורש זרחון חמצוני, ובכך בוחר עבור תאים בעלי הדנ&quot;א המיטוכונדרי פונקציונלי. יש sK1 תאים נטייה לאבד הדנ&quot;א המיטוכונדרי פונקציונלי ולהיות petites. הדנ&quot;א המיטוכונדרי פונקציונלי דרוש נביגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרים Streak מהצלחת YPG לצלחת YPD (YPDextrose) עבור מושבות אחת. לגדול שמרים על 24-28 שעות צלחת YPD על 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי בערך 36-48 שעות של צמיחה על תקשורת המוצקה YPD, להתחיל 25 מיליליטר תרבות YPD באמצעות מושבה אחתמהצלחת YPD. לגדול בתרבות זו עד תאים על OD 600 = 4.0 ל -7.0. בצע פעולה זו על 30 מעלות צלזיוס לילה חממה רועד, רועד ב 220 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתרבות YPD, השתמש כמות מתאימה של תאים להתחיל 1,000 מ&quot;ל של YPA (YPAcetate) תרבות הוא OD 600 = 0.1 עבור כל צורך בצלחת 96 באר בסעיף 2. לגדול השמרים 30 ° C רועד חממה (רועד ב 220 סל&quot;ד) עד התרבות OD 600 היא בין 1.3 1.5. הערה: לחסן 100 מ&quot;ל של תרבות YPA עבור 96 כל צלחת multiwell שיוקרנו בסעיף 2. לדוגמה, אם ההקרנה ארבע 96 צלחות multiwell, 400 מ&quot;ל של תרבות YPA יהיה צורך. החל נפח תוספת 10% בתרבות YPA יש צורך להגן מפני איבוד מסת אוויר. בדרך כלל, זה ייקח בין 12-16 שעות עבור תאים להגיע OD המתאים 600; את משך הזמן עשוי להשתנות תלוי גנוטיפ של זן השמרים. YPA הוא התקשורת presporulation. Pregrowthב תצטט עוזר להשרות ביטוי של גנים (כגון IME1) דרושי נביגה יעיל סינכרוני 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 1,800 XG בצנטריפוגה בראש הטבלה במשך 5 דקות עד גלולה התאים הגדלים YPA. לשטוף את התאים 1X עם 0.5 נפח של מים ללא יונים autoclaved סטרילי. ספין שוב, וזורקים לשטוף. Resuspend תאי תקשורת נביגה נפח 1x. המשך לסעיף 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות תאים עבור נביגה כי הם של גנוטיפים שונים, (כלומר, הפך עם פלסמידים שונים או המכילים מוטציות שונות, בדרך כלל מתקבל ומאוחסנים כמו מניות קפוא), תאי מערך של גנוטיפים שונים לפורמט multiwell 96. לאחר מכן, בצע את התהליך הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Frogger 96 שיניים סטרילי להעביר תאים ממניות קפוא מופשר ב 96 צלחת multiwell (ים) על גבי מדיה YPG מוצק. לגדול לילה שמרים על 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות Frogger 96 שיניים סטרילי, להעביר תאי תקשורת מוצקה YPG גבי מדיה מוצקה YPD או סלקטיביתתקשורת מוצקה (כלומר, תקשורת מינימאלית סינטתית חסרת חומצות אמינו, אם התאים מכילים פלסמידים הדורשים מבחר). לגדול שמרים ב 30 מעלות צלזיוס עד מושבות נוצרות עבור כל זן, בדרך כלל 1 יום על YPD ו -2 ימים אם התקשורת סלקטיבית היא הכרחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 1.2 מיליליטר של תקשורת הנוזלת YPD או תקשורת הנוזלת סלקטיבית לבאר כל צלחת multiwell 96 עמוק 2 מיליליטר. העברת תאים מן התקשורת מוצקה לתוך תקשורת נוזלית באמצעות פרוגר, מכסים עם מכסה פלסטיק מוחזק במקום על ידי קלטת, ולגדול לילה 30 ° C שייקר, רועד ב 220 סל&quot;ד. הערה: כדי למזער זיהום, אטמים באמצעות מכסי הפלסטיק מתוך צלחת הפטר מלבני. החזק מכסה במקום באמצעות נייר דבק, כך זרימת האוויר מוגבלת מינימאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות צנטריפוגה ב 1,800 XG במשך 5 דקות, באמצעות צנטריפוגות דלי מתנדנד עם מתאמים כדי להכיל 96 צלחות היטב. יוצקים את התקשורת מתאי; להוסיף 500 μl YPA זה היטב resuspend התאים pelleted ב YPA. כיסויעם מכסה פלסטיק מוחזק במקום על ידי קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים עבור 15 שעות ב 30 מעלות צלזיוס חממה רועדת, רועד ב 220 סל&quot;ד. המשך לסעיף 2. </li></ol></li></ol> 2. תאים Sporulating במתכונת 96 multiwell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אחד מהם 3 מ&quot;מ חרוז זכוכית מוצקה סטרילי או בר ומערבבים מגנטי סטרילי 5 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ לבאר כל צלחת 96 גם עם 1.3 מ&quot;ל בארות. (ראה תוצאות נציג להלן דיון בשאלה האם להשתמש חרוז או בר ומערבבים.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כל התאים שיוקרנו הם מאותו גנוטיפ, ללכת 2.2.1. אם תאים שיוקרנו הם של גנוטיפים שונים, ללכת 2.2.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח התאים משלב 1.1.5 ו aliquot 500 μl של תאים בתוספת התקשורת לבאר כל 96 הצלחת multiwell. מכסים עם מכסה פלסטיק מוחזק במקום על ידי קלטת. המשך 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ספין הנמצאים YPA מ 1.2.4 1,800 XG במשך 5 דקות, באמצעות צנטריפוגות דלי מתנדנד עם מתאמים כדי להכיל 96 צלחות היטב. יוצקים שלמדיה מתאי f. הוסף 500 μl של התקשורת נביגה זה היטב resuspend התאים pelleted בתקשורת נביגה. מכסים עם מכסה פלסטיק מוחזק במקום על ידי קלטת. המשך 2.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות חרוז זכוכית, דגימות מקום חממה רועדת ב 30 ° C ולנער ב 220 סל&quot;ד במשך נביגה. אם אתם משתמשים במכשיר בר ומערבבים מגנטיים, דגימות מקום בצלחת ומערבבים בתוך חממת 30 מעלות צלזיוס במשך נביגה. הערה: המהירות והמערבבים המדויקת עבור הברים ומערבבים המגנטיים אינה חשובה מאוד, כל עוד כל הברים נעים במרץ ואת התרבות מוגזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחר התקדמות דרך נביגה, לסגת דגימות מתרבות sporulating להדמיה, להוסיף 6 μl של תאים מן התרבויות sporulating 24 μl של התקשורת נביגה בצלחת coverslip 96 באר (1: 5 דילול). השאירו תאים להסתפק 5 דקות לפני בחינת התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. הערה: תאי sK1 סוג ברים, נבגים בוגרים קומפקטיים יהוו ידי 36 שעות לאחר העברת מדיה נביגה. התקדמות דרך נביגה ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ באמצעות סמנים ניאון, כגון סמן גרעיני (כלומר, Htb2-mCherry 18) לבחון את חלוקת meiotic או סמן קרום prospore (כלומר, G20 19) לבחון morphogenesis נבג. לחלופין, היווצרות נבגי refractile ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופ Nomarski דסק&quot;ש החל כ -12 שעות לאחר העברה למדיה נביגה. </li></ol>

<ol><li>Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+in+budding+yeast%3A+sister+chromatid+cohesion+and+related+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms.</a> Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).</li>
<li>Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+meiotic+recombination+initiation%3A+general+principles+and+molecular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways.</a> Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).</li>
<li>Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+signaling+pathways+orchestrate+yeast+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development.</a> Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).</li>
<li>Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+control+of+growth+and+development+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nutritional control of growth and development in yeast.</a> Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).</li>
<li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sum1%2FNdt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparison+of+recombination+and+synaptonemal+complex+formation+during+meiosis+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae.</a> Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).</li>
<li>Liti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+genomics+of+domestic+and+wild+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population genomics of domestic and wild yeasts.</a> Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).</li>
<li>McCusker, J. H., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+sporulation+of+yeast+in+media+buffered+near+pH6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6.</a> J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).</li>
<li>Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+which+affect+the+frequency+of+sporulation+and+tetrad+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae+baker%27s+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).</li>
<li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).</li>
<li>Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6rner%2C+GV+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22">Cold Spring Harb. Protoc</a>. 2015 (11), 1003-1008 (2015).</li>
<li>Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6rner%2C+GV+%22Cold+Spring+Harb.+Protocols%22">Cold Spring Harb. Protocols</a>. (10), 908-913 (2015).</li>
<li>Jones, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+library+for+comprehensive+overexpression+screens+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).</li>
<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpession+screen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpession screen.</a> J. Vis. Exp. (53), e2836(2011).</li>
<li>Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timely+Closure+of+the+Prospore+Membrane+Requires+SPS1+and+SPO77+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. , (2016).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Labooratory+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).</li>
<li>Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPO71+mediates+prospore+membrane+size+and+maturation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).</li>
<li>Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+a+SNARE+protein+by+control+of+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization.</a> Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).</li>
<li>Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smk1p+MAP+kinase+negatively+regulates+Gsc2p%2C+a+1%2C3-beta-glucan+synthase%2C+during+spore+wall+morphogenesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מציגים פרוטוקול sporulating שמרים sK1 במתכונת multiwell 96. אוורור הוא מפתח עבור נביגה יעילה, אשר מחייבת שימוש או בר ומערבב או חרוז זכוכית בכל טוב. כאשר תאים התנבג בצלחת multiwell 96 בתוך חממה רועדת בלי שאחד חרוז או ומערבבים ברים, תאים אינם sporulate ביעילות. רק עלייה קטנה יעילות נביגה נתפסת כאשר התאים התנבג מבלי שאיש חרוז או בר ומערבבים בתוך חממה רועד, לעומת להיות ב 30 מעלות צלזיוס ללא תסיסה (טבלה 1; 17% ב שייקר vs 10% להציב על ומערבבים צַלַחַת). באופן דו...

נביגה ב השמרים ניצני נחקרה לספק תובנות היבטים רבים של הביולוגיה, כולל שליטה על הפרדה כרומוזום במהלך המיוזה 1, מנגנוני שחלוף 2, שליטה של פיתוח על ידי התא איתות 3, שליטה התזונתי של פיתוח 4, תעתיק הסדרת פיתוח 5, ובחינת יצירת הנבגים 6. יצירת נבגים כוללת אירוע חלוקת תא רומן מעורב ההיווצרות של תאי קרום חדשים בתוך תא אמא ואחריו בתצהיר של קיר נבג מגן 6. מחקרים אלה הבוחנים תאים sporulating מנצלים לעתים קרובות זן שמרים sporulating במהירות sK1, אשר יכול לעבור תהליך של נביגה בערך 24 שעות בצורה יעילה יחסית 7,8. למרות אופטימיזציה של תנאי נביגה בשביל נבגי שמרים תוארו 9-13, אלה לביצוע הניסויs בחן נביגה על התקשורת מוצק או נוזלי בתרבויות בקנה מידה גדול יותר שבו נביגה מתבצעת באמצעות צינורות תרבות או צלוחיות. כאן אנו מתארים שיטה sporulating שמרים במתכונת צלחת multiwell 96. אנו מוצאים כי בשיטה זו, אוורור הוא קריטי עבור נביגה סינכרוני ויעיל, פיתחו טכניקות כדי להבטיח נביגה מספיק בפורמט multiwell קטן-נפח. Sporulating במתכונת צלחת multiwell 96 מאפשר לתאים להיות מוקרנים באמצעות טכניקות תפוקה גבוהה ריאגנטים מותאם במיוחד בפורמט צלחת multiwell, הקרנה כזה מדכאי גבוהה עותק באמצעות ספריית רעפים 14-16.

<table><tbody><tr><td>Nunc 1.3 מ"ל צלחות</td><td>DeepWell</td><td>ThermoScientific 260251</td><td>המשמשות לנבגים</td></tr><tr><td>Nunc 2.0 מ"ל צלחות DeepWell</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>המשמשות לגידול קדם נבגים, שלב 1.2.3</td></tr><tr><td>חרוז זכוכית 3 מ"מ</td><td>פישר</td><td>11-312A</td><td>משמש לנבגים</td></tr><tr><td>5 מ"מ x 2 מ"מ מוט ערבוב, חבילה של 12</td><td>פישר</td><td>14-511-82</td><td>משמש לנבגים</td></tr><tr><td>96 ובכן frogger</td><td>V& P Scientific</td><td>VP407</td><td>דרוש עבור</td></tr><tr><td>מכונת צילום ספרייה</td> שלב 1.2 <td>V& P Scientific</td><td>VP381</td><td>דרוש לשלב 1.2; לשימוש עם</td></tr><tr><td>צלחת פטרי מלבנית</td><td>ThermoScientific</td><td>264728</td><td>דרושה לשלב 1.2</td></tr><tr><td>דרושה</td><td>211677</td><td>בקטו פפטון</td><td>BD</td> למדיה</tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>BD</td><td>212750</td><td>דרושה למדיה</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>212750</td><td>דרושה למדיה</td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>פישר</td><td>D16-3</td><td>דרוש למדיה</td></tr><tr><td>אשלגן אצטט</td><td>פישר</td><td>P171-500</td><td>דרוש למדיה</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר</td><td>G33-500</td><td>דרוש למדיה</td></tr><tr><td>שחור 96 באר צלחת תחתונה מזכוכית</td><td>MatTek</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td><td>דרוש לשלב 2.4</td></tr></tbody></table>

נביגה יעילה של<em&gt; שמר האפייה</em&gt; בתוך פורמט 96 multiwell

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

בתקופות של לחץ תזונתי, Saccharomyces cerevisiae עובר גמטוגנזה, המכונה נבגים. תאי שמרים דיפלואידים הרעבים לחנקן ופחמן יתחילו את תהליך הנבגים. תהליך הנבגים כולל מיוזה ואחריה היווצרות נבגים, כאשר הגרעינים ההפלואידים נארזים בנבגים עמידים לסביבה. פיתחנו שיטות לנבגים יעילים של שמרים ניצנים ב-96 צלחות מרובות בארות, כדי להגדיל את התפוקה של תאי שמרים מסננים לפנוטיפים של נבגים. שיטות אלו תואמות להקרנה עם שמרים המכילים פלסמידים הדורשים בחירה תזונתית, כאשר נעשה שימוש במדיה מינימלית מתאימה, או עם סינון שמרים עם שינויים גנומיים, כאשר נעשה שימוש במשטר קדם נבגים עשיר. אנו מוצאים כי עבור שיטה זו, אוורור במהלך נבגים הוא קריטי להיווצרות נבגים, ופיתחנו טכניקות להבטחת אוורור מספיק התואמות לפורמט הצלחת הרב-בארית 96. למרות ששיטות אלו אינן משיגות את רמת הנבגים האופיינית ~80% שניתן להשיג בניסויים מבוססי בקבוק בנפח גדול, שיטות אלו ישיגו באופן אמין כ-50-60% רמת נבגים בצלחות מרובות בארות בנפח קטן.

<html> כדי להעריך בפרוטוקול זה, יעילות נביגה המתקבלת sporulating תאי צלחות multiwell (כמתואר לעיל) הושוותה תאים התנבג באמצעות כמויות גדולות יותר צלוחיות (טבלה 2). השימוש צלחות multiwell לא להשיג את היעילות הגבוהה לראות כאשר sporulating צלוחיות, שבו ~ 80% יעילות ניתן לראות באופן שגרתי. Sporulating צלחות multiwell עם אוורור נאה (המסופק על ידי חרוזי זכוכית או ברים ומערבבים) יכולה להשיג יעילות נביגה מספיק גדול מ -50%, עם התוצאות הטובות ...

כאן, נבגים של Saccharomyces cerevisiae מתבצעים בפורמט מרובה בארות 96.

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להביא להיווצרות נבגים (sporulation) של שמרים מניצים ביעילות בפורמט של 96 בארות. למרות שבוצעו סקרימות רבות בהיקף נרחב על שמרים מניצים, מחקרים בעלות תפוקה גבוהה הבוחנים מייוזה והיווצרות נבגים היו מוגבלים. לטכניקה המתוארת בסרטון זה יש את היתרון של השראה יעילה של נבגים בשמרים באופן חסכוני בפורמט 96 בארות, התואם לסריקות בעלות תפוקה גבוהה.קיבלתי לראשונה את הרעיון לשיטה זו מכיוון שרציתי להשתמש בספריית פלסמידים של two micron מסוג tiled כדי לסרוק עבור מדכאים בעלי מספר עתקים גבוה של מוטנט שלא היה מסוגל ליצור נבגים רפרקטיליים. בתחילה, יעילות הספורולציה שלי הייתה נמוכה בפורמט של 96 בארות. גיליתי כי הדבר נבע מאוורור לא מספק.התחילו את הפרוצדורה על ידי הפשרת זן השמרים SK1 על מצע YPG (yeast extract peptone glycerol). השתמשו במקל סטרילי כדי לגרד כמות קטנה של תאים מתוך מבחנת ההקפאה המכילה את מאגר הגליצרול ופזרו אותם על מצע YPG. גדלו את השמרים במשך 12 עד 16 שעות בטמפרטורה של 30 °C.לאחר מכן, בצעו מריחה של השמרים מלוח YPG אל לוח תמצית שמרים, פפטון ודקסטרוז, או YPD, לקבלת מושבות בודדות. גדלו את השמרים על לוח ה-YPD למשך 24 עד 48 שעות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. לאחר 24 עד 48 שעות של גדילה על מצע YPD מוצק, התניחו תרבית YPD בנפח 25 milliliter באמצעות מושבה בודדת מלוח ה-YPD.גדלו תרבית זו למשך הלילה באינקובטור מדשש בטמפרטורה של 30 degree Celsius במהירות של 220 RPM עד שהתאים יגיעו ל-OD600 של 4.0 עד 7.0. למחרת, השתמשו בכמות מתאימה של תאים מתרבית ה-YPD כדי להתחיל תרבית של 125 milliliter במדיום yeast extract peptone acetate, או YPA, עם OD600 של 0.1. גדלו את התרבית באינקובטור מדשש בטמפרטורה של 30 degree Celsius במהירות של 220 RPM עד שה-OD600 יהיה בין 1.3 ל-1.5.העבירו את התרבית למבחנות צנטריפוגה וסובבו במהירות של 1800X G בצנטריפוגה שולחנית למשך חמש דקות כדי לשקק את התאים. שטפו את התאים פעם אחת עם 0.5 נפח של מים דיוניים סטריליים שעברו אוטוקלאב. סובבו שוב ושלפו את המים.סספנדו מחדש את התאים בנפח של 1X מתוך מצע ספורולציה. להכנת תאים מגנוטיפים שונים, העבירו תחילה תאים ממנות קפואות שהופשרו בלוחית 96 בארות אל מצע YPG מוצק. עקרו באמצעות להבה "פרוגר" (frogger) בעל 96 שיניים, ולאחר מכן קררו אותו לרגע על פלטת מצע מוצק לפני המגע עם מושבות השמרים.גדלו את השמרים למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C. למחרת, העבירו את התאים ממצע מוצק YPG אל מצע מוצק YPD או מצע סלקטיבי, בהתאם לגנוטיפ של הזן. בהדגמה זו נעשה שימוש ב-YPD.גדלו את השמרים בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עד להיווצרות מושבות עבור כל זן. חלקו 1.2 milliliters של מצע נוזלי YPD לכל באר בלוח 96 deep well plate. העבירו את התאים מהמצע המוצק אל המצע הנוזלי.כסו את הפלטה במכסה פלסטיק של פטריה מלבנית וקבעו את המכסה בעזרת חתיכת סרט הדבקה כדי להגביל באופן מינימלי את זרימת האוויר. גדלו את התאים למשך לילה בנקנעת בטמפרטורה של 30 degree Celsius ובמהירות של 220 RPM. למחרת, ביצעו צנטריפוגציה ב-1800X G למשך חמש דקות.שפכו את המצע והוסיפו 500 µL של YPA לכל באער. לאחר מכן, השעיקו מחדש את התאים שהשקיעו. כסו את הפלטה במכסה פלסטיק המקובע באמצעות סרט דביק.גדלו את התאים במשך 15 שעות באינקובטור נער בטמפרטורה של 30 °C במהירות של 220 RPM. כדי לספק אוורור נאות לספורולציה יעילה, הוסיפו לכל באר בלוח 96-בארים פניס זכוכית סטרילי מוצק בקוטר 3 mm או מוט ערבוב מגנטי סטרילי בגודל 5 mm על 2 mm. אם כל התאים הם בעלי אותו גנוטיפ, חלקו 500 µL של תאים בתוספת מצע לכל באר בלוח ה-96-בארים.כסו את הצלחת עם מכסה פלסטיק המוחזק במקומו באמצעות סרט דבק. אם התאים הם מגנוטיפים שונים, סובבו את התאים שנמצאים ב-YPA ב-1800X G למשך חמש דקות ושפכו את המצע. הוסיפו 500 microliters של מצע ספורולציה לכל באר.שחזר את התאים השקועים במצע לספורולציה. כסה את הפלטה במכסה פלסטיק המקובע בעזרת סרט הדבקה. אם נעשה שימוש בחרוזי זכוכית, הנח את הדגימות באינקובטור עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C וניעור במהירות של 220 RPM לצורך ספורולציה.אם משתמשים במגנטיים לערבוב, הניחו את הדגימות על פלטת ערבוב בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 30 degrees Celsius לצורך ספורולציה. מהירות הערבוב המדויקת של המגנטים אינה קריטית, כל עוד כל המגנטים נעים בעוצמה והתרבית מאווררת. לאחר 36 שעות, הוציאו את הדגימות כדי לעקוב אחר ההתקדמות של תהליך הספורולציה.שאבו שש µL של תאים מכל תרבית ספורולציה והוסיפו אותם ל-24 µL של מצע ספורולציה בתוך פלטת כיסויים בעלת 96 בארות. השאירו את התאים לשקוע למשך חמש דקות לפני הבדיקה באמצעות מיקרוסקופ הפוך. ספורולציה מייצגת של שני זנים שונים מוצגת בתמונות אלו של תאים שנדגמו באמצעות עדשה של 63X במיקרוסקופ הפוך.טטרדות שבירה (Refractile tetrads), המסומנות על ידי חצי חצים, נראות בתרבית של סוג הבר (wild-type). אולם הן אינן נראות בתרבית המכילה תאים עם מחיקה של הגן smk1 הפגומים ביכולת הספורולציה. בוצעו השוואות בין יעילויות הספורולציה של תאים שעברו ספורולציה בפלטות רב-בארים לבין תאים שעברו ספורולציה בנפחים גדולים יותר בבקבוקים (flasks).השימוש בפלטות רב-בארים לא הניב את היעילות הגבוהה הנראית באופן שגרה בעת שימוש בפרוטוקול הטיפוסי יותר של ספורולציה בבלילי (flasks). ספורולציה בפלטות רב-בארים עם אוורור נאות יכולה להשיג יעילות ספורולציה מספקת הגבוהה מ-50%, כאשר התוצאות הטובות ביותר התקבלו באמצעות מוט ערבוב של חמישה מילימטרים. עם זאת, בהינתן העלות הגבוהה של מוטות הערבוב הקטנים, היעילויות שהושגו באמצעות חרוזי זכוכית הן דומות.למרות ששני סוגי מגנטי השקשוק, של 5 מילימטר ושל 7 מילימטר, נכנסים לתוך באר של פלטה בעלת 96 בארות, שימוש במגנט של 7 מילימטר הוביל ליעילות נביגה דלה. מגנט של 7 מילימטר בתוך באר נוטה להתרחב ולהשפיע על מגנט בבאר סמוכה, דבר המונע מהמגנטים להישקרשש כראוי ומפחית את האוורור המספק של התרבית.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן להביא תאי שמרים לספורולציה ביעילות בתרבית נוזלית בפורמט של 96 בארות. ברגע שהתהליך נשלט, ניתן להשלימו תוך שישה ימים, אם הוא מבוצע כהלכה. ניתן להשתמש בפרוצדורה זו לסריקה של זני מוטנטים שונים, פלסמידים או מעכבי מולקולות קטנות לבדיקת השפעתם על מייוזה וספורולציה.לאחר פיתוחה, טכניקה זו שימשה לחקר הרגולציה של מחזור התא המיוטי וכיצד ציטוקינזיס ומיוזה מקושרים בתהליך הספורולציה ב-Saccharomyces cerevisiae.

efficient-sporulation-saccharomyces-cerevisiae-96-multiwell

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המיקרומניפולציה בתאי שמרים דרוש ניתוח גנטי meiotic או לבחור zygotes דיפלואידי. Micromanipulations אלה מתבצעות באמצעות microneedle של מיקרוסקופ לנתיחה. Microneedle משמש להעביר תאים נשלטת על ידי micromanipulator אשר זמינים עם דרגות שונות של אוטומציה.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

בפרוטוקול זה, הגן ביטוי שמרים...

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

כאן אנו מתארים מסך overexpression פלסמיד...

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

שיטת המפלצת הירוקה מאפשרת הרכבה המהירה של מחיקות מרובות מסומנות בחלבון כתב גן קידוד ירוק זרחני. שיטה זו מבוססת על נהיגת זני שמרים במחזורים חוזרים ונשנים של מגוון מיני של מחיקות והעשרה פלואורסצנטי המבוסס של תאים שנשאו יותר מחיקות.

תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות Gene מרובות

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבנייה וסינון של ספריות מוטנטיות עבור מסעות אבולוציה מכוונים ב-Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את חילוף החומרים בדרכי הנשימה, fermentative על-ידי התאמת הגידול האקספוננציאלי של האפייה למשוואה צמיחה אקספוננציאלית. חישוב הפרמטרים קינטי מאפשר להקרנה של השפעות של חומרים/תרכובות תסיסה או מיטוכונדריאלי נשימה.

שמר האפייה קינטיקה גידול אקספוננציאלי בתרבות אצווה כדי לנתח את חילוף החומרים הנשימה ואת Fermentative

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

אנו מציגים פרוטוקול להכנת lamella של דגימות ביולוגיות קפואות לצלול על ידי מיקרו-מכונות קרן יונים ממוקדות קריו למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולולים במקום עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית. הפרוטוקול המוצג מספק קווים מנחים להכנת lamellae באיכות גבוהה עם רבייה גבוהה לאפיון מבני של macromolecules בתוך cerevisiae Saccharomyces.

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

בדיקת ACT1-CUP1, בדיקת גידול נחושת, מספקת קריאה מהירה של שחבור RNA שליח מבשר (pre-mRNA) וההשפעה שיש לגורמי שחבור מוטנטיים על תפקוד השחבור השחבור. מחקר זה מספק פרוטוקול ומדגיש את ההתאמה האישית האפשרית כדי להתמודד עם שאלת השחבור המעניינת.

מבחני ACT1-CUP1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים

למדו שיטה יעילה לנביגת שמר האפייה בפורמט 96-well לסקרינינג גבוה-תפוקה. השיטה משפרת אווירור ומאפשרת מחקר גנטי ב-Saccharomyces cerevisiae.

נביגה יעילה של

גלה סרטונים נוספים