נביגה יעילה של שמר האפייה בתוך פורמט 96 multiwell

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לנבג שמרים ניצנים ביעילות בפורמט של 96 בארות. למרות שמסכים רבים בקנה מידה גדול בוצעו על השמרים הניצנים, מחקרים בעלי תפוקה גבוהה שבחנו מיוזה ונבגים היו מוגבלים. לטכניקה המתוארת בסרטון זה יש את היתרון של נבגי שמרים ביעילות בצורה חסכונית בפורמט של 96 בארות התואם להקרנה בתפוקה גבוהה.

קיבלתי לראשונה את הרעיון לשיטה זו מכיוון שרציתי להשתמש בספריית פלסמיד מרוצפת של שני מיקרון על מנת לסנן מדכאי עותק גבוהים של מוטאנט שלא יכול ליצור נבגים עקשניים. בתחילה, יעילות הנבגים שלי הייתה גרועה בפורמט של 96 בארות. גיליתי שזה נובע מאוורור לא מספק.

התחילו בהליך זה על ידי הפשרת זן השמרים SK1 על תמצית שמרים, פפטון, גליצרול או צלחת YPG. השתמש במקל סטרילי כדי לגרד כמות קטנה של תאים מבקבוקון המקפיא המכיל את ציר הגליצרול ולמרוח אותו על צלחת YPG. מגדלים את השמרים במשך 12 עד 16 שעות בחום של 30 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, פס את השמרים מצלחת YPG על צלחת תמצית שמרים פפטון דקסטרוז, או YPD, עבור קולונים בודדים. מגדלים את השמרים על צלחת ה- YPD למשך 24 עד 48 שעות בחום של 30 מעלות צלזיוס. לאחר 24 עד 48 שעות של צמיחה על מדיה מוצקה של YPD, התחל תרבית YPD של 25 מיליליטר באמצעות מושבה אחת מלוח ה-YPD.

גדל תרבית זו בן לילה באינקובטור טלטול של 30 מעלות צלזיוס ב-220 סל"ד עד שהתאים מגיעים ל-OD600 של 4.0 עד 7.0. למחרת, השתמש בכמות מתאימה של תאים מתרבית YPD כדי להתחיל תרבית של 125 מיליליטר בתמצית שמרים פפטון אצטט, או YPA, עם OD600 של 0.1. גדל את התרבית בחממת טלטול של 30 מעלות צלזיוס ב-220 סל"ד עד שה-OD600 יהיה בין 1.3 ל-1.5.

העבירו את התרבית לצינורות צנטריפוגה וסובבו ב-1800X G בצנטריפוגה שולחנית למשך חמש דקות כדי לגלול את התאים. שטפו את התאים פעם אחת בנפח 0.5 של מים נטולי יונים סטריליים. סובב שוב והשליך את המים.

השעו מחדש את התאים בנפח פי 1 של אמצעי נבגים. כדי להכין תאים מגנוטיפים שונים, תאים ממאגרים קפואים מופשרים בצלחת מרובת בארות 96 מועברים תחילה למדיה מוצקה של YPG. להבעיר פרוגר 96 שיניים ואז לקרר אותו לרגע על צלחת של מדיה מוצקה לפני שנוגעים בו במושבות השמרים.

מגדלים את השמרים למשך הלילה בחום של 30 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את התאים ממדיה מוצקה YPG ל-YPD או למדיה מוצקה סלקטיבית, בהתאם לגנוטיפ של הזן. YPD משמש בהדגמה זו.

מגדלים את השמרים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד שנוצרות מושבות לכל זן. הכניסו 1.2 מיליליטר של מדיה נוזלית YPD לכל באר של צלחת באר עמוקה של 96. העבירו את התאים מהמדיה המוצקה למדיה נוזלית.

מכסים את הצלחת במכסה פלסטיק מצלחת פטרי מלבנית ומחזיקים את המכסה במקומו באמצעות פיסת סרט כדי להגביל באופן מינימלי את זרימת האוויר. גדל את התאים בן לילה בשייקר של 30 מעלות צלזיוס ב-220 סל"ד. למחרת, צנטריפוגה ב-1800X G למשך חמש דקות.

יוצקים את המדיה ומוסיפים 500 מיקרוליטר YPA לכל באר. ולהשעות מחדש את התאים הגלולים. מכסים את הצלחת במכסה פלסטיק המוחזק במקומו על ידי סרט.

לגדל את התאים במשך 15 שעות באינקובטור טלזול של 30 מעלות צלזיוס ב-220 סל"ד. כדי לספק אוורור נכון לנבגים יעילים, הוסף לכל באר של צלחת של 96 בארות חרוז זכוכית מוצק סטרילי אחד של שלושה מילימטר או מוט ערבוב מגנטי סטרילי של חמישה מילימטר על שני מילימטרים. אם כל התאים הם מאותו גנוטיפ, הכניסו 500 מיקרוליטר של תאים בתוספת מדיה לכל באר של צלחת 96 רב-בארות.

מכסים את הצלחת במכסה פלסטיק המוחזק במקומו על ידי סרט. אם התאים הם מגנוטיפים שונים, סובב את התאים שנמצאים ב-YPA ב-1800X G למשך חמש דקות ושפך את המדיה. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיית נבגים לכל באר.

ולהשעות מחדש את התאים הגלולים באמצעי הנבגים. מכסים את הצלחת במכסה פלסטיק המוחזק במקומו על ידי סרט. אם משתמשים בחרוזי זכוכית, הניחו את הדגימות באינקובטור רועד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ונערו ב-220 סל"ד לנבגים.

אם משתמשים במוטות ערבוב מגנטיים, הניחו את הדגימות על צלחת ערבוב בתוך אינקובטור של 30 מעלות צלזיוס לנבגים. מהירות הערבוב המדויקת של הפסים המגנטיים אינה חשובה במיוחד, כל עוד כל הסורגים נעים אנרגטית והתרבות מאווררת. 36 שעות לאחר מכן, אחזר את הדגימות כדי לעקוב אחר התקדמות הנבגים.

משוך שישה מיקרוליטר של תאים מכל תרבית נבגים והוסף ל -24 מיקרוליטר של אמצעי נבגים בצלחת כיסוי של 96 בארות. השאירו את התאים להתיישב במשך חמש דקות לפני שבוחנים אותם באמצעות מיקרוסקופ הפוך. נבג מייצג של שני זנים שונים מוצג בתמונות אלה של תאים המוצגים באמצעות אובייקט 63X במיקרוסקופ הפוך.

ניתן לראות טטרדות עקשניות, המסומנות על ידי ראשי החצים, בתרבות הבר. אבל לא בתרבית המכילה את תאי המחיקה smk1 חסרי נבגים. נערכו השוואות בין יעילות נבגים מתאים שנבגים בצלחות מרובות בארות לבין תאים שנבגים באמצעות נפחים גדולים יותר בצלוחיות.

השימוש בצלחות מרובות בארות לא השיג את היעילות הגבוהה שנראית באופן שגרתי בעת שימוש בפרוטוקול האופייני יותר של נבגים בצלוחיות. נבגים בצלחות מרובות בארות עם אוורור נכון יכולים להשיג יעילות נבגים מספקת של יותר מ-50% עם התוצאות הטובות ביותר המתקבלות באמצעות מוט ערבוב של חמישה מילימטרים. עם זאת, בהתחשב בעלות הגבוהה של מוטות הערבוב הקטנים, היעילות המתקבלת באמצעות חרוזי זכוכית ניתנת להשוואה.

למרות שגם מוטות ערבוב של חמישה מילימטר וגם שבעה מילימטר נכנסים לבאר של צלחת של 96 רב-בארות, שימוש במוט ערבוב של שבעה מילימטר הביא ליעילות נבגית ירודה. מוט הערבוב של שבעה מילימטר בבאר נוטה לקיים אינטראקציה עם מוט ערבוב בבאר סמוכה. מניעת ערבוב נכון של הסורגים ומתן אוורור נאות לתרבות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנבג ביעילות תאי שמרים בתרבית נוזלית בפורמט 96 בארות. לאחר השליטה, ניתן להשלים תהליך זה תוך שישה ימים, אם נעשה כראוי. הליך זה יכול לשמש לסינון זנים מוטנטיים שונים, פלסמידים או מעכבי מולקולות קטנות להשפעתם על מיוזה ונבגים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו שימשה לחקר ויסות מחזור התא המיוטי וכיצד ציטוקינזיס ומיוזה משולבים בנבגים ב-Saccharomyces cerevisiae.