ניתוח מהיר של פנוטיפים היממה ארבידופסיס פרוטופלאסט טרנספקציה עם כתבת שעון פלורסנט

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לקבוע את התקופה הצירקדית בקווי Arabidopsis על ידי מדידת זוהר הנפלט מפרוטופלסטים שעברו טרנספטציה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הצירקדית, כגון אילו גנים מזינים בחזרה למנגנון שמירת הזמן עצמו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת ניתוח מהיר של התקופה הצירקדית של כל מוטציה של Arabidopsis ללא צורך ביצירת קווים טרנסגניים יציבים.

כדי להתחיל בהליך זה, סמן צלחת פטרי והוסף לה 10 מיליליטר תמיסת אנזים מעוקרת מסוננת. מקבעים ארבע רצועות של סרט חיטוי כשהצד הדביק כלפי מעלה על משטח מעבדה נקי, וסמנו את גודל צלחת הפטרי על הרצועות. אסוף תוכניות מחדר הגידול.

חותכים עלים של צמחים בני ארבעה שבועות ולוחצים את האפידרמיס העליון על סרט החיטוי, כך שמשטח האפידרמיס התחתון פונה כלפי מעלה. יש להניח רצועות של סרט דבק קסם על פני האפידרמיס התחתון. בעזרת צינור חרוטי של 15 מיליליטר, לחץ בעדינות את הרצועות על העלים, הקפד לא לרסק את רקמת העלים.

משוך בזהירות את הסרט כדי להפשיט את האפידרמיס התחתון ולחשוף את תאי המזופיל. לאחר מכן, חתכו את סרט החיטוי כך שיתאים לצלחת הפטרי, והשתמשו בפינצטה כדי להעביר את הסרט לתוך צלחת הפטרי, והציפו אותו על תמיסת האנזים, כשהעלים פונים כלפי מטה. סובב במהירות של 60 סל"ד על שייקר פלטפורמה למשך 60 דקות, במהלכן ישוחררו הפרוטופלסטים לתמיסה.

לאחר 60 דקות, השתמש בפינצטה כדי להסיר ולהשליך את רצועות סרט החיטוי. בעזרת קצה פיפטה רחב, פיפטה את התמיסה המכילה את הפרוטופלסטים לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הפרוטופלסטים ב-100 ג'י למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והוציאו את הסופרנטנט בזהירות, מכיוון שהכדור רופף מאוד.

הוסף 10 מיליליטר תמיסת W5 לפרוטופלסטים, והשעיה מחדש על ידי סיבוב עדין של הצינור. הסר כמות גדולה של פרוטופלסטים לספירה. הניחו את הפרוטופלסטים על קרח למשך 30 עד 60 דקות.

בזמן שהפרוטופלסטים נמצאים על קרח, העריכו את התשואה על ידי ספירת פרוטופלסטים בהמוציטומטר. אוספים את הפרוטופלסטים על ידי צנטריפוגה ב-100 ג'י למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט בזהירות, מכיוון שהכדור רופף מאוד.

לבסוף, השעו מחדש את הפרוטופלסטים בתמיסת MMg לריכוז של 500,000 פרוטופלסטים למיליליטר. התחל את ההליך להעברת פרוטופלסט על ידי הוספת עשרה מיקרוליטר של פלסמיד מדווח לצינור חרוטי של 15 מיליליטר, ואחריו 400 מיקרוליטר של פרוטופלסטים. הוסף נפח אחד של פוליאתילן גליקול, או תמיסת PEG, וערבב על ידי היפוך הצינור בעדינות 12 פעמים כדי להעביר את הפרוטופלסטים.

יש לדגור במשך שמונה עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. יש לדגור את הפרוטופלסטים מספיק זמן כדי להבטיח טרנספקציה יעילה, אך לא יותר מדי זמן מכיוון שהדבר יפחית את כדאיותם. לאחר מכן, יש לדלל את תערובת ה-DNA PEG של הפרוטופלסט בארבעה נפחים של תמיסת W5, ולערבב על ידי היפוך עדין שש פעמים.

אוספים את הפרוטופלסטים המועברים על ידי צנטריפוגה ב-100 ג'י למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה, שוב בזהירות רבה מכיוון שהכדור רופף מאוד. השעו מחדש את הפרוטופלסטים ב-1,250 מיקרוליטר של תמיסת הדמיה.

הפרוטופלסטים צריכים להיות מושעים די בקלות, מה שמצביע על כך שהם שלמים לאחר הטרנספקציה. יש להקצות 200 מיקרוליטר לבאר לשש בארות משוכפלות של צלחת של 96 בארות, ולמלא כל באר ריקה בתמיסת W5. אטום את הצלחת במכסה שקוף דבק המתאים להדמיה זוהרת.

כדי לצלם את הפרוטופלסטים, העבר את הצלחת בעלת 96 הבארות לכל מערך הדמיה זוהר המתאים להדמיית צמחים. החלף את מכסה הדבק על הצלחת 10 עד 15 דקות לאחר ההעברה כדי למנוע עיבוי והפרשי לחץ בין הבארות. התחל לצלם.

קרא את הצלחת כל 45 דקות במשך חמישה ימים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, נתח את תוצאות הזוהר באמצעות תוכנת ניתוח כלשהי, למשל, מערכת התוכנה לניתוח מקצבים ביולוגיים. פרוטופלסטים מזופילים שבודדו על ידי פרוטוקול זה מוצגים בתמונה זו בהגדלה של פי 200.

פרופלסטים הם ארבידופסיס מסוג בר והמוטנט cca1/lhy הועברו וצולמו באור קבוע על קורא צלחות במשך חמישה ימים. כצפוי, תקופת הריצה החופשית של ביטוי גנים מבוקר שעון מתקצרת במוטציה זו. לעומת זאת, תקופת התנודות הצירקדיות בפרוטופלסטים של מוטנט ztl מתארכת.

בפרוטופלסטים המבטאים יתר על המידה CCA1, לא היו תנודות בביטוי מבנה המדווח מכיוון שביטוי יתר של CCA1 מוביל להפרעות קצב. תרשים עמודות זה מציג את הערכות התקופה הצירקדית המבוססות על עקבות זוהר בפרוטופלסטים מסוג הבר והשעון. תקופות צירקדיות אלה עולות בקנה אחד עם נתונים שפורסמו מצמחים שלמים תוך שימוש בגישות טרנסגניות גוזלות זמן.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בצמחים בריאים ולטפל בפרוטופלסטים בזהירות מכיוון שהם שבירים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד, להעביר ולדמות פרוטופלסטים של Arabidopsis.

כיום ניתן ליישם טכניקות אלה על כל קו מוטנטי, או אפילו לשנות אותן כדי לדמות פרוטופלסטים של מיני צמחים אחרים.