יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת אירועי תעתוע וסיעת של שלפוחיות (vesicular trafficking) במסלול האנדוציטוזה בתאים חיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הובלת השלפוחיות, כגון כיצד מוטציות או שינויים בביטוי חלבונים משפיעים על קצבי ויעילות אירועי ההובלה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות ישיר של תעתוע אנדוציטוזי בתאים חיים על ידי מדידת העוצמה של חלבוני מטען המסומנים בפלואורסצנציה.

לאחר הכנת התמיסות והמצעים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, זרעו שתיים עד שלוש מושבות של תאי שמרים בחמישה מיליליטר של מצע YNB, ללא רכיבי תזונה נוספים לשמירה על סלקציית הפלסמיד. גדלו את התרביות בטמפרטורה של 30 °C עם ניעור למשך 16 עד 24 שעות. כสาม שעות לפני הדימות, מדדו את ה-OD 600 של כל תרבית לילה.

לאחר מכן, הכינו דילולים של חמישה מיליליטר במדד OD 600 של 0.35 עד 0.4 במצע YNB, ללא רכיבי תזונה נוספים לתחזוקת הפלסמיד, וגדלו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עם ניעור למשך שלוש שעות. במהלך הדגירה,בצעו שיווי temperatur של תא הסביבה של המיקרוסקופ או של הבמה המחוממת ל-30 degrees Celsius. לאחר הכנת פלטת זכוכית בת שמונה בארות שעברה טיפול ושל שקופית תא (chamber slide) להדמיה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הוסיפו 200 microliters של מצע YNB ללא רכיבי תזונה נוספים לבחירת פלסמיד לכל בארה.

כאשר התרביות מוכנות, העבירו מיליליטר אחד למבחנה למיקרו-מקפיא ושקיעו את התאים ב-8,000 RPM למשך שתי דקות. לאחר מכן, הסירו 975 µL מהעל-נוזל. השעו שוב את משקע התאים בעל-נוזל שנותר.

לאחר מכן, טפטפו 2.5 µL של תמיחת התאים למרכזו של כל באר בלוח שמונה הבאארים. ביצעו פיפטינג למעלה ולמטה כדי לפזר את התאים והמתינו חמש עד 10 דקות להשקעת התאים. הניחו את שקופית התא על מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך שהגיע לטמפרטורה של 30 °C.

לאחר מכן, השתמשו בתאורה בשדה בהיר (bright field) כדי לאתר שדה של תאים. הוסיפו 50 µL של מצע YNB שחומם מראש ומכיל 100 µg/mL של methionine ל-200 µL של המצע בבאר, כדי להגיע לריכוז סופי של 20 µg/mL של methionine. המתינו שתי דקות להגעה לשיווי משקל של התאים לפני תחילת הדמיון.

מיד לפני הצילום, כוון את המיקרוסקופ למישור המוקד הרצוי. רכוש תמונות GFP בשדה בהיר או ב-DIC במרווחי זמן של 5 דקות למשך 45 עד 60 דקות. השתמש בפרמטרי רכישה זהים עבור כל התמונות בתוך סדרת הזמן.

יש לעיין בפרוטוקול הכתוב לפרטים נוספים. כמת את עוצמת הפלואורסצנציה של תאים בודדים בכל נקודת זמן והבע את הערכים כאחוז מעוצמת ההתחלה של התמונה הראשונה. לאחר ייצוא התמונות בהתאם לפרוטוקול הכתוב ב-ImageJ, פתח את הקבצים בתפריט הקבצים באמצעות אפשרות הפתיחה (Open).

השתמשו בתמונת הפלואורסצנציה לצורך כימות ובתמונת השדה המואר (bright field) או ב-DIC כייחוס לזיהוי מיקום התאים. השמיעו תאים מתים, אם קיימים, אשר נראים כהים יותר מתאים חיים בצפייה ב-DIC ומראים פלואורסצנציה עצמית בערוץ ה-GFP. עבור תמונות עם רקע לא אחיד, בחרו בתפריט העיבוד (Process) את אלגוריתם הפחתת הרקע (background subtraction) ובחרו בהגדרת ברירת המחדל.

לאחר רכישת התמונות, חשוב לבצע חיסור רקע לפני ההמשך להליך הכמותיות. שלב זה חשוב במיוחד מכיוון שאות הרקע עלול אחרת להסוות או להחליש הבדלים בין דגימות. באמצעות כלי הבחירה החופשית, סמנו את מתאר התא תוך הקפדה על הכללת התא כולו וצמצום השטח מחוץ לתא ככל האפשר.

לאחר מכן, תחת תפריט Analyze, השתמשו בפונקציית set measurements כדי למדוד את השטח (area), הצפיפות המשולבת (integrated density) וערך האפור הממוצע (mean gray value). פתחו את מנהל ה-ROI על ידי לחיצה על Analyze ולאחר מכן על Tools. בחלון מנהל ה-ROI, לחצו על כפתור Add כדי להזין את האזור המודגש כ-ROI חדש.

חזור על פעולות התוואי והמדידה עבור שאר התאים בתמונה, למעט תאים מתים או תאים הנוגעים לשולי התמונה. שמור את ה-ROIs שנבחרו כקובץ zip על ידי לחיצה על כפתור המדידה (measure), שיציג את הערכים שנמדדו בחלון חדש. לאחר מכן, לחץ על כפתור "עוד" (more) וייצא את כל המדידות לגיליון אלקטרוני או לתוכנה לניתוח סטטיסטי.

החדירו שתי עד שלוש מושבות של תאי שמרים ל-0.5 מיליליטר של מצע YNB, ללא רכיבים תזונתיים נוספים לתחזוקת ברירת הפלסמיד. גדלו את התאים על גלגל סיבוב בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות. הוסיפו מיליליטר אחד של מצע YNB ללא רכיבים תזונתיים נוספים לתחזוקת הפלסמיד וגדלו למשך שלוש שעות נוספות.

לאחר מכן, העבירו מיליליטר אחד של תאים לכל אחת משתי מבחנות בעלות תחתית עגולה בנפח חמישה מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 0.25 מיליליטר של מצע YNB Met למבחנה הראשונה ו-0.25 מיליליטר של מצע YNB המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר של methionine למבחנה השנייה, כדי להגיע לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם למיליליטר. עבור מספר רב של דגימות, פזרו את הוספת ה-methionine כדי לאפשר זמן לניתוח העובדות.

ציטומטר הזרימה שלנו יכול למדוד עד 40 דגימות בריצה אחת. אנו מוסיפים מתיונין בקבוצות. שמונה דגימות בכל חמש דקות.

פעולה זו מבטיחה שכל הדגימות יימדדו בין 45 ל-50 דקות לאחר הוספת המתיונין. דגרו את התאים למשך 45 דקות. לאחר מכן, נתחו את התאים באמצעות ציטומטריית זרימה, כאשר תבחרו בפיזור קדמי (forward scatter או FS) כמדד לגודל התאים, ותמפו את עוצמת הפלואורסצנציה מהזרימה דרך מסנן FITC כמדד להפנימה של המטען.

במהלך הדגירה שתימשך 45 דקות, השתמשו בכפתורי ההזזה כדי לכוונן את המתח של ערוצי ה-FS וה-FITC, במטרה למטב את הגילוי עבור טווח הגדלים ועוצמת הפלואורסצנציה של תאי השמרים שבהם נעשה שימוש. מדדו את ה-FS ואת עוצמת הפלואורסצנציה עבור 10,000 תאים מכל תנאי. באמצעות הגדרת קצב זרימה גבוה, צרו תרשים פיזור של FS מול עוצמת הפלואורסצנציה על ידי לחיצה על "הוסף גרף" (add graph).

לאחר מכן, בחרו ב-FITC עבור ציר ה-x וב-FS עבור ציר ה-y והציגו גרף של 1000 נקודות. באמצעות פונקציית ה-gate ובמצב Met מסוג wild type, הגדירו gate אנכי כך שבערך 5% מהתאים הזוהרים ביותר יימצאו מימין ל-gate. השתמשו ב-gating זה עבור כל שאר התנאים בניסוי.

כפי שמוצג כאן, ביצעו דימוי רצף (time-lapse) של תאים במרווחי זמן של חמש דקות, בנוכחות או בהיעדר methionine, כדי לעקוב אחר הפנימה (internalization) של Mup1 המסומן ב-GFP או ב-fluorine וכן אחר שינויים בفلורסצנציה. כצפוי, Mup1 המסומן ב-GFP וב-fluorine נשאר בממברנת הפלזמה בהיעדר methionine. לעומת זאת, תאים שדוממו בנוכחות methionine הראו התמעטות הדרגתית של האות הפלורסצנטי מפני השטח של התא, ממצא העולה בקנה אחד עם פנימה של המטען.

עם זאת, קינטיקת איבוד הפלואורסצנציה בנוכחות מתיונין הייתה מושהית בתאי Mup1 GFP בהשוואה לתאי pHlourin Mup1. תרשימי פיזור אלו משווים את עוצמת הפלואורסצנציה של תאי פרא (wild-type) או תאי delta ENTH1 ארבעה, בנוכחות או בהיעדר מתיונין, לאחר החלת שער אנכי. 4% מתאי הפרא שעובדו עם Met נמצאו בצדו הימני של השער, המתאים לתאים הזוהרים ביותר באוכלוסייה, בעוד ש-65% מתאי הפרא שלא עובדו נמצאו בתוך השער.

לעומת זאת, בארבעת תאי ה-delta ENTH1 לא נראה הבדל בחלוקה בין תאים בהירים לתאים עמומים, ממצא התואם פגם באנדוציטוזה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להגדיר זמני התחלה מדורגים במידה ומבצעים ניסויים במקביל, כדי שניתן יהיה לאסוף את נתוני נקודת הסיום לאחר אותו זמן טיפול עבור כל הדגימות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון סריקות גנטיות של פלורסצנציה (floral genetic screens) כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אילו גורמים חדשים תורמים לתעתוע וסיעת של שלפוחיות (vesicular trafficking). לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ה-vesicular trafficking לבחון היבטים של שחיקת אנדוזומים, כמו גם נתיב חומצי ובלתי תלוי קלתירין שהתגלה לאחרונה בשמרים מנבתים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן השימוש במטענים מסוג florent כדי לכמת אירועי אנדוציטוזה בתאים חיים.