יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת אירועי סחר שלפוחית במסלול האנדוציטי של תאים חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסחר בשלפוחית, כגון כיצד מוטציה או שינויים בביטוי החלבון משפיעים על שיעורי ויעילות אירועי הסחר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות ישיר של סחר אנדוציטי ותאים חיים על ידי מדידת עוצמת חלבוני מטען מתויגים פלואורסצנטית.

לאחר הכנת תמיסות ומדיה על פי פרוטוקול הטקסט, יש לחסן שתיים עד שלוש מושבות של תאי שמרים בחמישה מיליליטר של מדיום YNB, חסרים חומרים מזינים נוספים לשמירה על בחירת הפלסמיד. מגדלים את התרבויות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך 16 עד 24 שעות. כשלוש שעות לפני ההדמיה, מדוד את ה-OD 600 של כל תרבית לילה.

לאחר מכן הכינו חמישה דילולים של מיליליטר ב-OD 600 של 0.35 עד 0.4 במדיום YNB, חסרים חומרים מזינים נוספים לתחזוקת פלסמיד וגדלו ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול במשך שלוש שעות. במהלך הדגירה, יש לאזן מראש את תא הסביבה של המיקרוסקופים או את השלב המחומם ל-30 מעלות צלזיוס. לאחר הכנת סיר זכוכית שטופל בשמונה בארות ושקופית תא להדמיה על פי פרוטוקול הטקסט, יש להוסיף לכל באר 200 מיקרוליטר של מדיום YNB חסר חומרים מזינים נוספים לבחירת פלזמה.

כאשר התרביות מוכנות, העבירו מיליליטר אחד לצינור מיקרו-מקרר וגלו את התאים ב-8,000 סל"ד למשך שתי דקות. לאחר מכן הסר 975 מיקרוליטר של הסופרנטנט. השעו מחדש את כדור התא בסופרנטנט שנותר.

לאחר מכן זרוק 2.5 מיקרוליטר של מתלה התא למרכז כל באר של צלחת שמונה הבארות. פיפטה למעלה ולמטה כדי לפזר את התאים ולאפשר לתאים להתיישב במשך חמש עד 10 דקות. הנח את שקופית החדר על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מאוזן ל-30 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, השתמש בתאורת שדה בהיר כדי לאתר שדה תאים. הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום YNB מחומם מראש המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר מתיונין ל-200 מיקרוליטר של מדיום בבאר כדי לקבל ריכוז מתיונין סופי של 20 מיקרוגרם למיליליטר. אפשר לתאים להתייצב במשך שתי דקות לפני תחילת ההדמיה.

ואז מיד לפני ההדמיה, התאם את המיקרוסקופ למישור המוקד הרצוי. רכוש GFP בתמונות שדה בהיר או DIC במרווחים של 5 דקות למשך 45 עד 60 דקות. שימוש בפרמטרי רכישה זהים עבור כל התמונות בסדרת זמן.

עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים. כמת את עוצמת הקרינה של תאים בודדים בכל נקודת זמן ובטא ערכים כאחוז מהעוצמה ההתחלתית של התמונה הראשונה. לאחר ייצוא תמונות לפי פרוטוקול הטקסט בתמונה j, פתח את הקבצים בתפריט הקובץ באמצעות האפשרות פתח.

השתמש בתמונת הקרינה לכימות ובתמונת השדה הבהיר או DIC כהתייחסות לזיהוי מיקום התאים. אל תכלול תאים מתים של הווה שנראים כהים יותר מתאים חיים כאשר הם נראים על ידי DIC ו-autofluoresce תחת ערוץ GFP. לתמונות עם רקע לא אחיד בתפריט 'תהליך', בחרו באלגוריתם חיסור הרקע ובחרו בקביעת ברירת המחדל.

לאחר רכישת התמונות חשוב לבצע חיסור רקע לפני שתמשיך בהליך הכמות. שלב זה חשוב במיוחד מכיוון שאות רקע עלול אחרת להסוות או להפחית את ההבדלים בין הדגימות. בעזרת כלי הבחירה ביד חופשית, שרטט תא והקפד לכלול את התא כולו אך שטח קטן ככל האפשר מחוץ לתא.

לאחר מכן, תחת תפריט ניתוח, השתמש בפונקציית המדידות שנקבעה כדי למדוד את השטח, הצפיפות המשולבת וערך האפור הממוצע. פתח את מנהל ה-ROI על ידי לחיצה על נתח ולאחר מכן על כלים. בחלון מנהל החזר ההשקעה, לחץ על כפתור הוספה כדי להזין את האזור המודגש כהחזר ROI חדש.

חזרו על קווי המתאר וביצוע המדידה של התאים הנותרים בתמונה, לא כולל תאים מתים או תאים הנוגעים בקצה התמונה. שמור את החזר ה-ROI שנבחר כקובץ zip על ידי לחיצה על כפתור המדידה שיציג את הערכים הנמדדים בחלון חדש. לאחר מכן לחץ על כפתור עוד וייצא את כל המדידות לגיליון אלקטרוני או לתוכנת ניתוח סטטיסטי.

לחסן שתיים עד שלוש מושבות של תאי שמרים ו-0.5 מיליליטר של מדיום YNB, חסרים חומרים מזינים נוספים לשמירה על בחירת הפלסמיד. גדל תאים על תוף רולר בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות. הוסף מיליליטר אחד של מדיום YNB חסר חומרים מזינים נוספים לתחזוקת פלסמיד וגדל במשך שלוש שעות נוספות.

לאחר מכן, העבירו מיליליטר אחד של תאים לכל אחד משני צינורות תחתונים עגולים של חמישה מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 0.25 מיליליטר של מדיום YNB Met לצינור הראשון ו-0.25 מיליליטר של מדיום YNB המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר מתיונין לצינור השני לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם למיליליטר. עבור מספר רב של דגימות, יש להגדיל את הוספת המתיונין כדי להתאים את הזמן לניתוח עובדות.

ציטומטר הזרימה שלנו יכול למדוד עד 40 דגימות בכל ריצה. אנו מוסיפים מתיונין בקבוצות. שמונה דגימות כל חמש דקות.

זה מבטיח שכל הדגימות נמדדות בין 45 ל-50 דקות לאחר הוספת מתיונין. דגרו על התאים למשך 45 דקות. לאחר מכן נתח את התאים על ידי ציטומטריית זרימה, בחר פיזור קדימה או FS כמדד לגודל התא ומפה עוצמת פלואורסצנטית זורמת אחת ממסנן FITC כמדד להפנמת מטען.

במהלך הדגירה של 45 דקות, השתמש בלחצני המחוון כדי לכוונן את המתח של ערוצי FS ו-FITC כדי לייעל את הזיהוי עבור טווח הגודל ועוצמת הקרינה של תאי השמרים המשמשים. מדוד FS ועוצמת הקרינה עבור 10,000 תאים מכל מצב. באמצעות הגדרת קצב הזרימה הגבוה, צור תרשים פיזור של FS כנגד עוצמת הקרינה על ידי לחיצה על הוסף גרף.

לאחר מכן בחר FITC עבור ציר ה- x ו- FS עבור ציר ה- y וגרף 1000 נקודות. באמצעות פונקציית השער ותנאי Met מהסוג הפראי, הקצה שער אנכי כך שכ- 5% מהתאים הבהירים ביותר ייפלו מימין לשער. השתמש בשער זה עבור כל התנאים האחרים בניסוי.

כפי שמוצג כאן, הדמיית זמן-lapse של תאים בוצעה במרווחי זמן של חמש דקות בהיעדר או נוכחות של מתיונין כדי לנטר הפנמת MUP1 מתויגת GFP או פלואור ושינויים בקרינה. כצפוי, GFP ו-Mup1 מתויג פלואור נשאר בקרום הפלזמה בהיעדר מתיונין. לעומת זאת, תאים שצולמו בנוכחות מתיונין, הראו דלדול מתקדם של האות הפלואורסצנטי משטח התא בהתאם להפנמת המטען.

עם זאת, הקינטיקה של הקרינה שאבדה בנוכחות מתיונין התעכבה בתאי Mup1 GFP בהשוואה לתאי pHlourin Mup1. תרשימי פיזור אלה משווים את עוצמת הקרינה של תאי ENTH1 מסוג בר או ארבעה דלתא בנוכחות או היעדר מתיונין לאחר החלת שער אנכי. 4% מתאי ה-Met מסוג הבר היו כלולים בצד ימין של השער המתאים לתאים הבהירים ביותר באוכלוסייה, בעוד ש-65% מתאי הפרא שלא טופלו היו כלולים בשער.

לעומת זאת, ארבעת תאי דלתא ENTH1 לא הראו הבדל בהתפלגות התאים הבהירים לעומת התאים העמומים, בהתאם לפגם באנדוציטוזיס. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור לזעזע את זמני ההתחלה מביצוע ניסויים בו זמנית, כך שניתן יהיה לאסוף את נתוני נקודת הקצה לאחר אותו זמן טיפול עבור כל הדגימות.

בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות גנטיות פרחוניות על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אילו גורמים חדשים תורמים לסחר בשלפוחית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסחר בשלפוחית לחקור היבטים של שחיקת אנדוזום כמו גם מסלול עצמאי וחומצי שהתגלה לאחרונה בשמרים ניצנים. לאחר צפייה בסרטון זה אתם אמורים להבין היטב כיצד להשתמש במטענים מסוג פלורנט כדי לכמת אירועים אנדוציטיים בתאים חיים.