המטרה הכללית של ניסוי זה היא לבחון את ההשלכות על שלמות התאים האנדותליאליים והחדירות שלהם בעקבות אינטראקציה עם תאי T מופעלים. שיטה זו מסייעת במענה על שאלות מפתח בתחום הנוירואימונולוגיה, כגון כיצד משפיעה האינטראקציה הישירה בין תאי T לתאים אנדותליאליים על שלמות החדירות ומחסום הדם-מוח. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה אוטומטית ובזמן אמת של תפקוד המחסום בעת מודולציה ממוקדת של האינטראקציה בין תאי T לתאים אנדותליאליים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהפרעות אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), מכיוון שהיא מספקת תובנה לגבי פריצת מחסום הדם-מוח המתווכת על ידי תאי T, שלב קריטי בפתוגנזה של מחלות אלו. שיטה זו מתמקדת בתכונות מחסום הדם-מוח של חולדה במהלך EAE, אך היא יכולה להיות מיושמת גם למודלים של מחסום דם-מוח של עכבר או בן אדם, וכן למחקרים של הפרעות אוטואימוניות אחרות של מערכת העצבים המרכזית.

בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להיתקל בקשיים בשל בעיות אפשריות בתזמון האופטימלי של שילוב תרביות ראשוניות של תאי אנדותל והפעלת תאי T. פיתחנו את השיטה הזו לראשונה כאשר ביקשנו לחקור את השפעותיהם של רמות שונות של הפעלת תאי T על תכונות מחסום הדם-מוח במהלך EAE, מודל חיות לטרשת נפיקה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שלמידת הקמתו של תרבית משותפת (co-culture) של תאי T ותאי אנדותל היא מורכבת, שכן שונות ראשונית ב-T בין בארות עלולה להוביל להצגות שגויות של התוצאות בהמשך.

כדי להתחיל בפרוצדורה זו, ביום החמישי לאחר בידוד MBMEC, יש לצפות מראש את התא-הכנסה (inserts) המאפשרים חדירות ב-80 µL של תמיסת ציפוי MBMEC לכל תא-הכנסה. יש להדגיר אותם בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך שלוש שעות. לאחר הסרת תמיסת הציפוי של MBMEC מהתאי-הכנסה, יש לשטוף את תאי ה-MBMEC על ידי הוספה של 2 mL של PBS בטמפרטורת החדר לכל באר, ושאיבה שלו לאחר דקה אחת; לאחר מכן יש לחזור על פעולה זו פעם נוספת.

בשלב הבא, הוסיפו 0.05% Trypsin EDTA בנפח של 300 µL לבאר ודגרו למשך חמש עד עשר דקות. לאחר מכן, הוסיפו 2 mL של מצע MBMEC לכל באר כדי לעצור את תהליך ה-trypsinization. לאחר מכן, העבירו את התאים שנאספו לפספורת צנטריפוגה של 15 mL וצנטריפגו את הדגימה במהירות של 700 ×g למשך שמונה דקות בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר שמונה דקות, השליכו את העילוי והשעיקו מחדש את התאים ב-1 milliliter של מצע MBMEC ללא puromycin. לספירת התאים, ערבבו 90 µL של 0.04% trypan blue. באמצעות 10 µL של תמיסת תאים, העבירו בפיפטה 10 µL מהתערובת אל החלל שבין זכוכית הכיסוי להמוציטומטר.

בשלב הבא, זרעו 2×10⁴ תאים לכל תאית (insert). הוסיפו 810 µL של מצע MBMEC לתא התחתון של כל באר והניחו את הפלטה עם התאיות באינקובטור עד למועד ביצוע מדידת ה-TEER. כדי לעבות תאי T חיוביים ל-CD4, צפו מראש פלטת 96 באערים בעלת תחתית עגולה בנוגדן anti-mouse CD3 מטוהר בריכוז סופי רצוי למשך שלוש שעות ב-37 °C.

לאחר בידוד תאי ה-T, שטפו את הפלטה המצופה מראש פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, הוסיפו נוגדן anti-CD28 מטוהר לתאי ה-T המבודדים בריכוז סופי רצוי וערבבו היטב. לאחר מכן, הניחו את תאי ה-T והשאירו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים עד שלושה ימים.

להקמת מדידת TEER, הניחו את מודול 24 הבארות של מכשיר ה-TEER תחת תא המגירה (laminar flow hood). הסירו את המכסים והניחו בעזרת פינצטה את התאים (inserts) המכילים MBMECs בתוך המכשיר. לאחר מכן, העבירו בפיפט 810 µL של מצע טרי למדור התחתון של בארות המודול, באופן זהיר, בין התא לדופן של בארת המודול.

לאחר מכן, סגרו את המכסים והכניסו את המכשיר לאינקובטור. חברו את המכשיר למחשב. לאחר מכן, הפעילו את בקר המכשיר ופתחו את התוכנה.

בחלון הקופץ, בחר ב-"New Measurement", סמן את תיבת "Check show TER" ואת תיבת "show Ccl". לאחר מכן, לחץ על start. עם השלמת המדידה הראשונה, בחר ב-"check all wells" בלשונית Results כדי לראות את כל ערכי ה-TEER וה-Ccl.

לאחר מכן, שמרו את הקובץ. בשלב הבא, בחרו את נקודת הזמן לביצוע תרבית משותפת של MBMECs עם T cells כאשר ה-Ccl יציב ונמוך מ-1 µF/cm² וה-TEER הגיע לרמתו המקסימלית. בחנו בקפידה את ערכי ה-TEER וה-Ccl המוחלטים והשמיטו את הבארים שבהן MBMECs לא פיתחו שכבות מונושכבה מספיק סמיכות (confluent) על ידי ביטול הסימון של בארים אלו.

קבצו את שאר הבארות על ידי לחיצה ימנית על הבארות ובחירה ב-"add well to new average well". תנו שם בחלון הצף ובצעו את הפעולה עבור כל הבארות האינדיבידואליות שעלייכן להיות מקובצות. לאחר מכן, בדקו את כל הבארות הממוצעות כדי לוודא שלכולן יש את אותם תנאי התחלה לפני התרבית המשולבת (co-culture). בלשונית הניסוי (experiment), לחצו על pause.

נתק את המכשיר והוצא אותו מהאינקובטור. לאחר מכן, הסר את המכסים תחת מ 빠르게 זרימה למינרית. לאחר מכן, הסר חלק מהתווך מהמבנה המוכנס (insert) בתא העליון.

הוסיפו תאי T ל-MBMECs על ידי פיפטציה זהירה של 150 µL מתווך. לאחר מכן, חברו מחדש את המכשיר ולחצו על resume measurement. לאחר 24 שעות, לחצו על stop בלשונית הניסוי ושמרו את הקובץ.

מוצג כאן המורפולוגיה בצורת כישוף בצביעה אימונופלוורסצנטית של PECAM-1 ו-Cldn-5 חמישה ימים לאחר בידוד MBMEC. להלן ערכי ה-TEER וה-Ccl לפני ואחרי חלוקה לקבוצות של בארות בודדות טרם הוספת תאי T. העקומה הכחולה אינה משמשת לניסוי מאחר ש-MBMECs בבאר זו לא פיתחו TEER גבוה כפי שקרה בבארות אחרות.

בניסוי זה, עשרו לגרות 35 עד 55 תאי T ספציפיים חיוביים ל-CD4 באופן תלוי-אנטיגן למשך חמישה ימים. תאי T נאיביים וציטוקינים פרו-דלקתיים, interferon gamma ו-TNF-alpha, שימשו כביקורת שלילית וחיובית, בהתאמה. בניסוי זה, תאי T גורו על ידי כמות זהה של נוגדי CD3 ו-CD28, ואלו שהותקבלו בתרבית למשך שלושה ימים הראו נטייה גבוהה יותר לפריצת מחסום בהשוואה לתאי T שהותקבלו בתרבית למשך יומיים בלבד.

התוצאות המוצגות כאן מראות כי תאי T מעוררים, אך לא התמלילים שלהם, גרמו לנזק משמעותי ל-MBMECs, מה שמעיד על כך שהמגע הישיר בין תאי T ל-MBMECs הוא קריטי להפרת המחסום. מאידך, הוספת מעכב granzyme b שתיים לתרבית תאי T שיקמה את שלמות ה-MBMEC במידה רבה יותר, מה שמצביע על המולקולה הציטוליטית כשחקנית חשובה בגרימת נזק ל-MBMEC ובירידה העקבית ב-TEER. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע ניסוי זה בתוך 12 ימים אם הוא מבוצע כראוי. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור לבחור את נקודת הזמן הנכונה להקמת התרבית המשולבת (co-culture) של תאי T ותאי אנדותל.

בעקבות הליך זה ניתן להשתמש בבדיקות אחרות, כגון מיקרוסקופיה של אימונופלואורסנציה, ציטומטריה זרימה (flow cytometry) ובדיקות הסתברות. זאת כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד אינטראקציה זו משפיעה על ביטוי מולקולות הצומת הדוקה (tight junction), על חדירות ועל היקף הגירת תאי T? לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירו-אימונולוגיה לחקור הפרעות אוטואימוניות של ה-CNS בעכברים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את ההשפעות הישירות בין תאי T מופעלים לבין תאים אנדותליאליים בכל הנוגע לשלמות ולחדירות של מחסום הדם-מוח.