Name: במבחנה דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: חקור את השפעת תאי T מופעלים על שלמות תאי אנדותל וחדירות מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת הערכה אוטומטית של פונקציית המחסום ותורמת להבנת מנגנוני הפרעות אוטואימוניות במערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אניקה Engbers ופרנק Kurth לקבלת התמיכה הטכנית המעולה שלהם ד&quot;ר מרקוס שפר (nanoAnalytics GmbH) לדיונים מועילים לגבי מדידות TEER. עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), A03 פרויקט SFB1009 כדי HW ו LK, CRC TR128, פרויקטי A08; Z1 ו- B01 כדי LK ו HW, ואת המרכז הבינתחומי לחקר קליני (פקולטה לרפואה של מינסטר) מספר מענק Kl2 / 2015/14 עד LK.

ל-I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl ו-L. Klotz אין מה לחשוף. H.-J. Galla הוא יועץ מדעי של nanoAnalytics GmbH, יצרנית מוניטור התאים האוטומטי.

כמה שלבים של הפרוטוקול המתואר חיוניים עבור ניסוי מוצלח. במהלך הבידוד MBMEC הראשונית ותרבות, חשוב כי העבודה נעשית בתנאים סטריליים ככל האפשר, כדי למנוע את הזיהום של תרבית תאים עם נבגי פטריות או חיידקים. על מנת לקבל תרבות טהורה של ECS, מומלץ להשתמש במצע המכיל puromycin עבור שלושת הימים הראשונים, המאפשר הישרדות של ECS, אבל לא סוגי תאים אחרים (במיוחד pericytes) 41,42. עוד צעד קריטי, כי ראוי לתשומת לב מיוחדת הוא זיהוי של נקודת הזמן הנכונה להוספת תאי T מראש הופעלו. במהלך 48 הש...

מחסום דם-המוח מפריד בין המחזור המערכתי ממערכת העצבים המרכזית (CNS) 1 - 3. הוא מספק מכשול פיזי מעכב את התנועה החופשית של תאים ואת דיפוזיה של מולקולות מסיסות במים מגן על המוח מפני פתוגנים ואפשרות חומרים מזיקים. בנוסף תפקוד המחסום שלה, BBB מאפשרת אספקה ​​של חמצן וחומרים מזינים את המוח parenchyma, אשר מבטיח תפקוד תקין של רקמות עצביות. תכונות פעילות של BBB מוסדרות מאוד על ידי המרכיבים התאיים ו acellular שלה, עם ECS מאוד מיוחדת להיות האלמנט המבני העיקרי שלה. ECS של BBB מאופיינת על ידי הנוכחות של צומת חזק (TJ) מתחמים, חוסר fenestrations, פעילות pinocytic נמוכה מאוד, ואת מנגנוני הובלה פעילים באופן קבוע. רכיבים אחרים של BBB קרום המרתף EC, pericytes הטבעה האנדותל, הרגליים בסוף astrocytic ו = נקוב הקשוריםקרום במרתף enchymal גם לתרום לפיתוח, תחזוקה ותפקוד של BBB 2,4 - 6, ויחד עם נוירונים microglia, מהווים את יחידת העצבים וכלי הדם (NVU), המאפשר תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית 7 - 9. במגוון מחלות נוירולוגיות, כגון ניווניות, מחלות דלקתיות או זיהומיות, הפונקציה של BBB נפגעת 2,5,10. חוסר וויסות של TJ מתחמי מנגנוני הובלה מולקולרי מוביל גדל חדירות BBB, extravasation לויקוציטים, דלקת ופגיעה עצבית. על מנת ללמוד נכסים BBB בתנאים pathophysiological כאלה, שונים במבחנה מודלים BBB הוקמו 9,11,12. יחד הם סיפקו תובנות רבות ערך את השינויים של מחסום שלמות, חדירות וכן מנגנוני הובלה. מודלים אלה מעסיקים תאי אנדותל של אדם, עכבר, חולדה, חזירי או בהמוצא כבש 13 - 18; תאי אנדותל ראשוני או שורות תאים בתרבית או כמו monoculture או יחד עם pericytes ו / או האסטרוציטים כדי לחקות באופן הדוק יותר את BBB in vivo 19 - 25. בשנים האחרונות, מדידת ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) הפכה לכלי מקובל להעריך נכסי מכשול אנדותל 26,27. TEER משקף את עכבת שטף היונים על פני בשכבת תא הירידה שלה מספקת מדד רגיש של שלמות מחסום אנדותל שנפרץ ומכאן חדירות מוגברת. מערכות המדידה TEER שונים פותחו, כולל אפיתל Voltohmmeter (EVOM), חישה עכבה Cell-המצע חשמלי (ECIS), וניתוח התא בזמן אמת 15,28 - 30. TEER משקף את התנגדות שטף היון בין ECS הסמוכים (מסלול paracellular) והוא ביחס ישרמחסום שלמות. הספקטרוסקופיה עכבת 27,31, עכבה הכוללת מורכבת (Z) נמדדה, אשר מספקת מידע נוסף על שלמות המחסום ידי מדידת Ccl. Ccl מתייחס נוכחי קיבולי דרך קרום תא (מסלול transcellular): שכבת התאים מתנהגת כמו קבלים במעגל השווה החשמלי, הפרדת האישומים משני צידי הממברנה ואת עומדת ביחס הפוך על שלמות המכשול. כאשר גדל על מוסיף חדיר, ECS לדבוק, להתרבות על פני קרום microporous. זה מתנגד זרם קיבולי הרקע של הכנס (שבעצמו מתנהג כמו קבלים) ומוביל לירידת הקיבול עד שהוא מגיע לרמה המינימאלית שלה. זה ואחריו הקמת TJ מתחמים כי חותם מן החלל בין ECS הסמוך. זה מגביל את שטף היון דרך מסלול paracellular, ו TEER מגדילה עד שהוא מגיע לרמה שלה. בתנאים דלקתיים, אולם endotheliמחסום אל נפגע: TEER יורדת ככל TJ קומפלקסים לקבל שיבש Ccl מתחזקת ככל רכיב הקיבולים של הכנס עולה שוב. מדידת TEER שלנו עושה שימוש במערכת תא ניטור 32 אוטומטית: מסקנה היא עיקרון ספקטרוסקופיה עכבה ומרחיב הבקשות הקודמות שלה. כאן אנו מתארים מודל BBB במבחנה המאפשר חקר תכונותיהם המחסום, כולל האינטראקציה של האנדותל מוח עם תאי חיסון; בפרט תאי T מופעלים. תנאי pathophysiological כאלה הם נצפו מחלות אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית, כגון טרשת נפוצה ודלקת encephalomyelitis אוטואימוניות הניסוי במודל חיה שלה 33 - 37. כאן, צעד חיוני הוא הגלגול של encephalitogenic, תאי T ספציפי-המיאלין ברחבי BBB. זה ואחריו מחדש שלהם במרחב perivascular וכניסת parenchyma המוח, שם הם מגייסים תאי חיסון אחרים ואותידלקת diate ו demyelination עוקבת 1,35,38. עם זאת, מנגנונים מולקולריים של האינטראקציה בין תאי T כגון ותאי האנדותל, המרכיבים העיקריים של BBB, אינם מובנים היטב. הפרוטוקול שלנו שואף למלא את הפער הזה ולתת תובנה חדשות על ההשלכות על תאי האנדותל (כלומר, שלמות מחסום וחדירות) במגע הישיר שלהם גומלין מורכב עם תאי T מופעלים. הפרוטוקול המתואר כאן עושה שימוש בתאי אנדותל כלי הדם במוח העכבר העיקרי, גדל כמו בשכבה על מוסיף חדיר עם ממברנות microporous. תאי האנדותל הם שיתוף תרבותי עם תאי CD4 + T, אשר ניתן המופעל מראש או polyclonally או בצורה אנטיגן ספציפי. עמית תרבות MBMECs עם המופעל מראש, אבל לא נאיבי בתאי T גורם לירידה TEER וגידול Ccl, אשר מספק מדד כמותי של הפרעה בתפקוד מחסום MBMEC. הטכניקהפולשני הוא: היא משתמשת מובנהית במקום אלקטרודות מקל, אשר למנוע הפרעה עיקרית של monolayer EC; ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תפקוד מחסום ללא שימוש סמני תא. זה גורם מדידה רציפה באופן אוטומטי ומאפשר הערכה עצמאית של שני פרמטרים מחסומים (TEER ו CCL) בו זמנית לאורך זמן. השיטה היא גם רגיש מספיק כדי להבחין בין רמות שונות של הפעלת תא T ואפקטים של תאי T כזה על ECS. ניתן להשתמש בו במגוון רחב של מבחנים תפקודיים: ציטוקינים שונים ו / או כמוקינים מעורבים בתהליכים דלקתיים ניתן להוסיף גם את התרבות המשותפת של MBMECs ותאי T; נוגדנים חוסמים נגד מולקולות הידבקות התא משני האיחוד האירופי או בצד T-cell יכול לשמש; ומעכבים של סמנים הפעלה תא T או נכסי cytolytic שלהם ניתן להוסיף במהלך יחול תאי T או שיתוף התרבות שלהם עם ECS. Assay הוא שימושי גם עבור גלגול T-cellמבחנים, כפי שהוא יכול לשמש בקרת איכות של שלמות monolayer MBMEC לפני התוספת של תאי T. כל זה הופך שיטה זו כלי תכליתי ואמין ללמוד את BBB במבחנה, תוך שימת דגש על ההשפעה של תאי T מופעלים על שלמות monolayer EC. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת להבנת המנגנונים של שיבוש BBB בפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה במודל חיה שלה EAE, שבו תגובתי עצמית, תאי T encephalitogenic לחצות את BBB ולגרום דלקת ונזק עצבי.

<table><tbody><tr><td>cellZscope</td><td>nanoAnalytics GmbH</td><td>www.nanoanalytics.com</td><td>כולל: מודול תא 24 בארות, בקר, מחשב עם תוכנת cellZscope v2.2.2&nbsp;</td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>Thermo Scientific</td><td>www.thermoscientific.com</td><td>SORVALL RC 6+; רוטור F21S-8x50y; עבור</td></tr><tr><td>ציטומטר זרימת בידוד MBMEC</td><td>בקמן קולטר</td><td>www.beckmancoulter.com</td><td>לניתוח הגירה של תאי T</td></tr><tr><td>תוכנת FlowJo7.6.5 Tree</td><td>Star</td><td>www.flowjo.com</td><td>לניתוח גלגול תאי</td></tr><tr><td>T צינורות צנטריפוגה של אוק רידג', PC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 מ"ל; לבידוד MBMEC</td></tr><tr><td>מוסיף קרום Transwell - גודל נקבוביות 0.4 ומיקרו; m</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>למדידת TEER כקריאה העיקרית</td></tr><tr><td>מוסיף קרום Transwell - גודל נקבוביות 3 ומיקרו; m</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>למדידת TEER כבקרת איכות לפני בדיקת הגירה של תאי T לוחית</td></tr><tr><td>תרבית תאים 24 בארות</td><td>Greiner</td><td>650 180</td><td>תחתית שטוחה; עבור תרבית MBMEC</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 96 בארות</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>תחתית עגולה; עבור תרבית תאים חיסוניים</td></tr><tr><td>מפריד QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>לבידוד תאי T ותאי B; תומך בבידוד תאי T ותאי B; תומך עמודות MACS LS</td></tr><tr><td>מפריד OctoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>לבידוד תאים דנדריטיים; תומך בעמודות MACS MS</td></tr><tr><td>תא ספירת נויבאואר</td><td>Marienfeld</td><td>MF-0640010</td><td>לספירת תאים</td></tr><tr><td>מסננת תאים, 70 ומיקרו; m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>לבידוד תאים חיסוניים</td></tr><tr><td>מסננת תאים, 40 ומיקרו; m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>לבידוד תאי חיסון</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>לבידוד תאי חיסון</td></tr><tr><td>עמודות הפרדה MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>לבידוד תאי T ותאי B</td></tr><tr><td>עמודות הפרדה MACS MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>לבידוד תאים דנדריטיים</td></tr><tr><td>עכבר CD4 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td>עבור CD4+ בידוד תאי T</td></tr><tr><td>עכבר CD19 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-201</td><td>לבידוד תאי B</td></tr><tr><td>עכבר CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>לבידוד תאים דנדריטיים</td></tr><tr><td>קולגן מסוג IV משליה אנושית</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>לתמיסת ציפוי MBMEC</td></tr><tr><td>פיברונקטין מ פלזמת בקר</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>לתמיסת ציפוי MBMEC</td></tr><tr><td>קולגנאז 2 (CSL2)</td> <td>וורת'ינגטון</td><td>LS004176</td><td>לבידוד MBMEC</td></tr><tr><td>קולגנאז/דיספאז (C/D)</td> <td>Roche</td><td>11097113001</td><td>לבידוד MBMEC</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>לבידוד MBMEC</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>F7524</td><td>לבידוד MBMEC</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>אמרסקו</td><td>0332-100G</td><td>לבידוד MBMEC</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644-1L</td><td>לבידוד MBMEC</td></tr><tr><td>DMEM (+ GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>לבידוד MBMEC ומדיום תרבית MBMEC</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>סיגמא</td><td>P4333</td><td>לבידוד MBMEC ומדיום תרבית MBMEC</td></tr><tr><td>חוצץ פוספט תמיסת מלח (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>עבור MBMEC ובידוד תאי חיסון</td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא</td><td>H3393</td><td>עבור מדיום תרבית MBMEC</td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי אנושי (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>עבור מדיום תרבית MBMEC</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>עבור מדיום תרבית MBMEC; רק בשלושת הימים הראשונים</td></tr><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>לקצירת MBMECs</td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג IA</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td>לבידוד תאים דנדריטיים</td></tr><tr><td>תמיסת טריפן בלו, 0.4%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>לספירת תאים</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>לבידוד תאי חיסון</td></tr><tr><td>IMDM + 1% L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td>למדיום תרבית תאי T</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE04-418Q</td><td>מגן מפני אור; למדיום תרבית תאי B</td></tr> <tr><td>ובטא;-מרקפטואתנול</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>למדיום תרבית תאי B</td></tr><tr><td>L-גלוטמין (100x גלוטמקס)</td> <td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>לעכבר בינוני תרבית תאי B</td></tr><tr><td>MOG35&mdash; 55 </תת>פפטיד</td><td>Biotrend</td><td>BP0328</td><td>להפעלת תאי T ספציפיים לאנטיגן</td></tr><tr><td>מטוהר נגד עכבר CD3 Ab</td><td>BioLegend</td><td>100302</td><td>שיבוט 145-2C11; להפעלת תאי T פוליקלונליים</td></tr><tr><td>מטוהר NA/LE נגד עכבר CD28 Ab</td><td>BD Pharmingen</td><td>553294</td><td>שיבוט 37.51; להפעלת תאי T רב-שבטיים</td></tr><tr><td>רקומביננטי עכברי IFN-&gamma;</td><td>PeproTech</td><td>315-05</td><td>לבדיקות הגירה של תאי T</td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים TNF-&alpha;</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td>לבדיקות התמרה של תאי T</td></tr> NA<tr><td>/LE מטוהר נגד עכברים IFN-&gamma; נוגדן</td><td>BD Biosciences</td><td>554408</td><td>שיבוט XMG1.2; ריכוז סופי מומלץ: 20 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>מעכב גרנזים B II</td><td>Calbiochem</td><td>368055</td><td>ריכוז סופי מומלץ: 10 ומיקרו; </td></tr><tr><td>נוגדן CD4 נגד עכבר M PE</td><td>Biolegend</td><td>116005</td><td>שיבוט RM4-4; לניתוח הגירה של תאי T</td></tr></tbody></table>

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות t cell-אנדותל אינטראקציה תא

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

פירוק מחסום הדם-מוח (BBB) הוא שלב קריטי בהתפתחות מחלות אוטואימוניות כגון טרשת נפוצה (MS) ודלקת המוח האוטואימונית הניסיונית (EAE). תהליך זה מאופיין בהעברה של תאי T מופעלים על פני תאי אנדותל במוח (ECs), המרכיבים העיקריים של ה-BBB. עם זאת, ההשלכות על תפקוד EC במוח על אינטראקציה עם תאי T כאלה אינן ידועות ברובן. כאן אנו מתארים בדיקה המאפשרת הערכה של תפקוד EC מיקרו-וסקולרי ראשוני במוח העכבר (MBMEC) ושלמות המחסום במהלך האינטראקציה עם תאי T לאורך זמן. הבדיקה עושה שימוש בספקטרוסקופיה של תאי עכבה, כלי רב עוצמה לחקר שלמות וחדירות EC חד-שכבתית, על ידי מדידת שינויים בהתנגדות החשמלית הטרנסאנדותל (TEER) ובקיבול שכבת התא (Ccl). במגע ישיר עם ECs, תאי T מגורים אך לא נאיביים מסוגלים לגרום לתפקוד לקוי של EC חד-שכבתי, כפי שמוצג על ידי ירידה ב-TEER ועלייה ב-Ccl. הבדיקה מתעדת שינויים בשלמות EC חד-שכבתי בצורה רציפה ואוטומטית. הוא רגיש מספיק כדי להבחין בין עוצמות שונות של גירויים ורמות שונות של הפעלת תאי T והוא מאפשר לחקור את ההשלכות של אפנון ממוקד של אינטראקציה בין תאי T ל-EC באמצעות מגוון רחב של חומרים כגון נוגדנים, ריאגנטים פרמקולוגיים וציטוקינים. הטכניקה יכולה לשמש גם כבקרת איכות לשלמות EC במבחני הגירה של תאי T במבחנה. יישומים אלה הופכים אותו לכלי רב-תכליתי לחקר תכונות BBB בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים.

איור 1 מספק סקירה כללית של המודל במבחנה BBB לשמש כדי לחקור את האינטראקציה בין תאי T ותאי האנדותל. הניסוי מורכב משלושה שלבים עיקריים. הצעד הראשון הוא הבדידות של MBMECs ראשית ממנהל בקורטקס המוח, ותרבותם במשך חמישה ימים. כשהם מגיעים למפגש בצלחת תרבית תאים, MBMECs הוא trypsinized ו reseeded על מוסיף חדיר, אשר ממוקמים אז מכשיר TEER. TEER ו Ccl של MBMECs נמדדים בצורה רציפה פיקוח על פני תקופה של שלושה עד חמישה ימים. בינתיים, תאי ...

כאן, אנו מתארים מודל עכברי במבחנה של מחסום הדם-מוח העושה שימוש בספקטרוסקופיה של תאי עכבה, תוך התמקדות בהשלכות על שלמות תאי האנדותל וחדירות באינטראקציה עם תאי T מופעלים.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לבחון את ההשלכות על שלמות התאים האנדותליאליים והחדירות שלהם בעקבות אינטראקציה עם תאי T מופעלים. שיטה זו מסייעת במענה על שאלות מפתח בתחום הנוירואימונולוגיה, כגון כיצד משפיעה האינטראקציה הישירה בין תאי T לתאים אנדותליאליים על שלמות החדירות ומחסום הדם-מוח. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה אוטומטית ובזמן אמת של תפקוד המחסום בעת מודולציה ממוקדת של האינטראקציה בין תאי T לתאים אנדותליאליים.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהפרעות אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), מכיוון שהיא מספקת תובנה לגבי פריצת מחסום הדם-מוח המתווכת על ידי תאי T, שלב קריטי בפתוגנזה של מחלות אלו. שיטה זו מתמקדת בתכונות מחסום הדם-מוח של חולדה במהלך EAE, אך היא יכולה להיות מיושמת גם למודלים של מחסום דם-מוח של עכבר או בן אדם, וכן למחקרים של הפרעות אוטואימוניות אחרות של מערכת העצבים המרכזית.בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להיתקל בקשיים בשל בעיות אפשריות בתזמון האופטימלי של שילוב תרביות ראשוניות של תאי אנדותל והפעלת תאי T. פיתחנו את השיטה הזו לראשונה כאשר ביקשנו לחקור את השפעותיהם של רמות שונות של הפעלת תאי T על תכונות מחסום הדם-מוח במהלך EAE, מודל חיות לטרשת נפיקה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שלמידת הקמתו של תרבית משותפת (co-culture) של תאי T ותאי אנדותל היא מורכבת, שכן שונות ראשונית ב-T בין בארות עלולה להוביל להצגות שגויות של התוצאות בהמשך.כדי להתחיל בפרוצדורה זו, ביום החמישי לאחר בידוד MBMEC, יש לצפות מראש את התא-הכנסה (inserts) המאפשרים חדירות ב-80 µL של תמיסת ציפוי MBMEC לכל תא-הכנסה. יש להדגיר אותם בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך שלוש שעות. לאחר הסרת תמיסת הציפוי של MBMEC מהתאי-הכנסה, יש לשטוף את תאי ה-MBMEC על ידי הוספה של 2 mL של PBS בטמפרטורת החדר לכל באר, ושאיבה שלו לאחר דקה אחת; לאחר מכן יש לחזור על פעולה זו פעם נוספת.בשלב הבא, הוסיפו 0.05% Trypsin EDTA בנפח של 300 µL לבאר ודגרו למשך חמש עד עשר דקות. לאחר מכן, הוסיפו 2 mL של מצע MBMEC לכל באר כדי לעצור את תהליך ה-trypsinization. לאחר מכן, העבירו את התאים שנאספו לפספורת צנטריפוגה של 15 mL וצנטריפגו את הדגימה במהירות של 700 ×g למשך שמונה דקות בטמפרטורה של 4 °C.לאחר שמונה דקות, השליכו את העילוי והשעיקו מחדש את התאים ב-1 milliliter של מצע MBMEC ללא puromycin. לספירת התאים, ערבבו 90 µL של 0.04% trypan blue. באמצעות 10 µL של תמיסת תאים, העבירו בפיפטה 10 µL מהתערובת אל החלל שבין זכוכית הכיסוי להמוציטומטר.בשלב הבא, זרעו 2×10⁴ תאים לכל תאית (insert). הוסיפו 810 µL של מצע MBMEC לתא התחתון של כל באר והניחו את הפלטה עם התאיות באינקובטור עד למועד ביצוע מדידת ה-TEER. כדי לעבות תאי T חיוביים ל-CD4, צפו מראש פלטת 96 באערים בעלת תחתית עגולה בנוגדן anti-mouse CD3 מטוהר בריכוז סופי רצוי למשך שלוש שעות ב-37 °C.לאחר בידוד תאי ה-T, שטפו את הפלטה המצופה מראש פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, הוסיפו נוגדן anti-CD28 מטוהר לתאי ה-T המבודדים בריכוז סופי רצוי וערבבו היטב. לאחר מכן, הניחו את תאי ה-T והשאירו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים עד שלושה ימים.להקמת מדידת TEER, הניחו את מודול 24 הבארות של מכשיר ה-TEER תחת תא המגירה (laminar flow hood). הסירו את המכסים והניחו בעזרת פינצטה את התאים (inserts) המכילים MBMECs בתוך המכשיר. לאחר מכן, העבירו בפיפט 810 µL של מצע טרי למדור התחתון של בארות המודול, באופן זהיר, בין התא לדופן של בארת המודול.לאחר מכן, סגרו את המכסים והכניסו את המכשיר לאינקובטור. חברו את המכשיר למחשב. לאחר מכן, הפעילו את בקר המכשיר ופתחו את התוכנה.בחלון הקופץ, בחר ב-"New Measurement", סמן את תיבת "Check show TER" ואת תיבת "show Ccl". לאחר מכן, לחץ על start. עם השלמת המדידה הראשונה, בחר ב-"check all wells" בלשונית Results כדי לראות את כל ערכי ה-TEER וה-Ccl.לאחר מכן, שמרו את הקובץ. בשלב הבא, בחרו את נקודת הזמן לביצוע תרבית משותפת של MBMECs עם T cells כאשר ה-Ccl יציב ונמוך מ-1 µF/cm² וה-TEER הגיע לרמתו המקסימלית. בחנו בקפידה את ערכי ה-TEER וה-Ccl המוחלטים והשמיטו את הבארים שבהן MBMECs לא פיתחו שכבות מונושכבה מספיק סמיכות (confluent) על ידי ביטול הסימון של בארים אלו.קבצו את שאר הבארות על ידי לחיצה ימנית על הבארות ובחירה ב-"add well to new average well". תנו שם בחלון הצף ובצעו את הפעולה עבור כל הבארות האינדיבידואליות שעלייכן להיות מקובצות. לאחר מכן, בדקו את כל הבארות הממוצעות כדי לוודא שלכולן יש את אותם תנאי התחלה לפני התרבית המשולבת (co-culture). בלשונית הניסוי (experiment), לחצו על pause.נתק את המכשיר והוצא אותו מהאינקובטור. לאחר מכן, הסר את המכסים תחת מ 빠르게 זרימה למינרית. לאחר מכן, הסר חלק מהתווך מהמבנה המוכנס (insert) בתא העליון.הוסיפו תאי T ל-MBMECs על ידי פיפטציה זהירה של 150 µL מתווך. לאחר מכן, חברו מחדש את המכשיר ולחצו על resume measurement. לאחר 24 שעות, לחצו על stop בלשונית הניסוי ושמרו את הקובץ.מוצג כאן המורפולוגיה בצורת כישוף בצביעה אימונופלוורסצנטית של PECAM-1 ו-Cldn-5 חמישה ימים לאחר בידוד MBMEC. להלן ערכי ה-TEER וה-Ccl לפני ואחרי חלוקה לקבוצות של בארות בודדות טרם הוספת תאי T. העקומה הכחולה אינה משמשת לניסוי מאחר ש-MBMECs בבאר זו לא פיתחו TEER גבוה כפי שקרה בבארות אחרות.בניסוי זה, עשרו לגרות 35 עד 55 תאי T ספציפיים חיוביים ל-CD4 באופן תלוי-אנטיגן למשך חמישה ימים. תאי T נאיביים וציטוקינים פרו-דלקתיים, interferon gamma ו-TNF-alpha, שימשו כביקורת שלילית וחיובית, בהתאמה. בניסוי זה, תאי T גורו על ידי כמות זהה של נוגדי CD3 ו-CD28, ואלו שהותקבלו בתרבית למשך שלושה ימים הראו נטייה גבוהה יותר לפריצת מחסום בהשוואה לתאי T שהותקבלו בתרבית למשך יומיים בלבד.התוצאות המוצגות כאן מראות כי תאי T מעוררים, אך לא התמלילים שלהם, גרמו לנזק משמעותי ל-MBMECs, מה שמעיד על כך שהמגע הישיר בין תאי T ל-MBMECs הוא קריטי להפרת המחסום. מאידך, הוספת מעכב granzyme b שתיים לתרבית תאי T שיקמה את שלמות ה-MBMEC במידה רבה יותר, מה שמצביע על המולקולה הציטוליטית כשחקנית חשובה בגרימת נזק ל-MBMEC ובירידה העקבית ב-TEER. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע ניסוי זה בתוך 12 ימים אם הוא מבוצע כראוי. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור לבחור את נקודת הזמן הנכונה להקמת התרבית המשולבת (co-culture) של תאי T ותאי אנדותל.בעקבות הליך זה ניתן להשתמש בבדיקות אחרות, כגון מיקרוסקופיה של אימונופלואורסנציה, ציטומטריה זרימה (flow cytometry) ובדיקות הסתברות. זאת כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד אינטראקציה זו משפיעה על ביטוי מולקולות הצומת הדוקה (tight junction), על חדירות ועל היקף הגירת תאי T? לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירו-אימונולוגיה לחקור הפרעות אוטואימוניות של ה-CNS בעכברים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את ההשפעות הישירות בין תאי T מופעלים לבין תאים אנדותליאליים בכל הנוגע לשלמות ולחדירות של מחסום הדם-מוח.

an-vitro-model-blood-brain-barrier-using-impedance-spectroscopy-focus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים שיטה להערכת התנגדות חשמלית טרנסאנדותל (TEER) בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח עכבר במבחנה. ערך TEER גבוה מצביע על צמתים שלמים של תאי אנדותל, בעוד שתוספת של תאי T מופעלים מורידה את ערך ה-TEER, ומשקפת שיבוש של מחסום הצומת.

הערכת התנגדות חשמלית טרנסאנדותל במודל מחסום דם-מוח במבחנה

סרטון זה מדגים מודל מבחנה לחקר פתוגנים החוצים את מחסום הדם-מוח (BBB). תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים, המבטאים צמתים הדוקים, יוצרים שכבת אנדותל בחדר העליון, בעוד נוירונים, אסטרוציטים ומיקרוגליה מייצגים את פרנכימת המוח בחדר התחתון, המופרדת על ידי קרום נקבובי. זיהום בנגיף במודל BBB מחקה את הפתוגן העובר מהדם למוח. עם החדרת נגיף נוירוטרופי, הוא חוצה את ה-BBB באמצעות טרנסציטוזיס, מדביק תאים עצביים, משכפל ומשחרר צאצאים ויראליים, ומדגים פלישה עצבית מוצלחת.

מודל מבחנה לחקר חציית פתוגן של מחסום הדם-מוח וזיהום בתאי מוח

הקמת מודלים האנושיים של מחסום דם המוח (BBB) ​​יכולה להועיל למחקר לתנאי מוח הקשורים לכישלון BBB. אנו מתארים כאן טכניקה משופרת להכנת מודל BBB מגע, המאפשר coculturing של האסטרוציטים אנושיים ותאי האנדותל במוח בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לאמת את שחזור של מודל במבחנה BBB מעורב syngeneic חולדה שיתוף תרבות של תאים והאסטרוציטים אנדותל. Monolayer תא אנדותל הציג Teer גבוה וחדירות LY נמוכות. ביטוי של חלבונים ספציפיים TJ, תגובות פונקציונליות לדלקת ופונקציונליות של מובילים וקולטנים הוערכו.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

כאן, אנו מתארים מודל מחסום דם-מוח אנושי המאפשר לחקור גלגול לימפוציטים למערכת העצבים המרכזית במבחנה.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

פרוטוקול זה מתאר שיטה להקמת מחסום דם-מוח אנושי (BBB) במודל מבחנה . תאי האנדותל והפריציטים נזרעים בכל צד של מסנן הכנסה (תא דם), ואסטרוציטים נזרעים בבאר התחתונה (תא המוח). המודל שאפיין שימש לניסויים בהובלת ננו-חלקיקים.

מערכת תאי תרבית משולשת המדגימה את מחסום הדם-מוח האנושי

דוח זה מספק פרוטוקולים להרכבה, תרבית תאים ובדיקות על פלטפורמת μSiM לבניית מודלים של מחסום דם-מוח.

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

למחסום הדם-מוח (BBB) יש תפקיד מכריע בשמירה על סביבת מוח יציבה ובריאה. תפקוד לקוי של BBB קשור למחלות נוירולוגיות רבות. פיתחנו מודל תלת-ממדי, הנגזר מתאי גזע של BBB כדי לחקור פתולוגיה של כלי דם במוח, שלמות BBB, וכיצד BBB משתנה על ידי גנטיקה ומחלות.

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

פרוטוקול זה מתאר מודל אמין ויעיל במבחנה של מחסום הדם במוח. השיטה משתמשת בתאי אנדותל של כלי דם מוחיים בעכבר bend.3 ומודדת התנגדות חשמלית טרנסממברנלית.

רישום תקינות תפקודית של מחסום ב-bend.3 תאי אנדותל וסקולריים באמצעות זיהוי התנגדות חשמלית טרנסאנדותל

כאן אנו מדגימים את הטכניקה של שימוש בחיישנים ביולוגיים מבוססי עכבה: ECIS ו- cellZscope, למדידת חוזק מחסום אנדותל במוח. אנו מפרטים את ההכנה והטכניקה של הוספת גירויים שונים למודל in vitro של אנדותל המוח. אנו מודדים, רושמים ונותנים ניתוח מייצג של הממצאים.

מדידת שינויים בשלמות מחסום האנדותל במוח באמצעות שני חיישנים ביולוגיים מבוססי עכבה בתגובה לתאים סרטניים וציטוקינים

חקור את השפעת תאי T מופעלים על שלמות תאי אנדותל וחדירות מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת הערכה אוטומטית של פונקציית המחסום ותורמת להבנת מנגנוני הפרעות אוטואימוניות במערכת העצבים המרכזית.

גלה סרטונים נוספים