את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולתכנת מחדש תאי מי שפיר בעכברים באמצעות מערכת טרנספוזון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מבוצעת בקלות. במסגרת טיפולית, ניתן להתמיין בין תאים מעוברי מחלות אנושיות לתאים מעניינים לבדיקת תרופות או הנדסת רקמות, על מנת להכין דרך אחרת לטיפול ספציפי למטופל לפני הלידה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתכנות. מערכת הטרנספוזון יעילה בסוגי תאים שונים. זה מתאים יותר לגישה קלינית ביחס לווקטורים נגיפיים ומאפשר ייצור של תאי IPS נטולי אוקסינו.

כדי להתחיל בבידוד, נקו את דופן הבטן של הסכר באמצעות 70 אחוז אתנול. בעזרת מספריים, בצע לפרוטומיה בקו האמצע, וחתך את אורך דופן הבטן כדי לקבל גישה לחלל הבטן. השתמש במלקחיים כדי לחשוף את הרחם ולאחר מכן כרת אותו באמצעות מספריים.

מעבירים את הרחם לכלי 100 מילימטר מלא ב-1xPBS סטרילי ושומרים על קרח. הניחו את המנה מתחת לסטריאומיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 והחזיקו את הרחם בעזרת מלקחיים תוך הסרת דופן הרחם בעזרת מספריים, תוך הקפדה על מניעת פגיעה בקרומי העובר. אוספים את העוברים לכלי 100 מילימטר מלא ב-1XPBS סטרילי ומניחים על קרח.

תפסו את השליה של עובר אחד בעזרת המלקחיים העדינים והעבירו אותה לכלי נקי של 100 מילימטר. כאן, הסר בזהירות את שק החלמון. לשבש את מי השפיר באמצעות המלקחיים ובאמצעות מזרק אינסולין, לאסוף 30 מיקרוליטר מי שפיר.

העבירו את הנוזל לבקבוקון חרוטי של 15 מיליליטר. חזור על תהליך זה עבור כל עובר, ואסף את הנוזל לאותו בקבוקון בכל פעם. לאחר מכן, שטפו כל עובר עם 1XPBS סטרילי בתוספת סרום בקר עוברי של אחוז אחד ואספו אותו לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר יחד עם מי השפיר.

צנטריפוגה את הצינור ב -145 פעמים G למשך חמש דקות ואז מתחת למכסה זרימה למינרית, הסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים הגלולים בשני מיליליטר של מדיום תרבית מי שפיר. קח צלחת שש בארות מצופה ג'לטין בנקודת אפס המכילה פיברובלסטים עובריים של עכברים שטופלו במיומיצין-C או MEF ואז זרע שני מיליליטר של תאים על הצלחת.

לטפח את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני, ולהחליף את המדיום כל יומיים. המשך בתרבית במשך שבעה ימים עד שהתאים מוכנים לטרנספקציה. כדי להתחיל בטרנספקציה, בצינור מיקרו-צנטריפוגה של נקודה אחת וחמישה מיליג'ר, מערבבים מיקרוגרם אחד של פלסמיד טרנספוזון עם נקודת אפס חמישה מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי טרנספוזאז ואפס נקודה חמש מיקרוגרם של פלסמיד טרנס-אקטיבטור טטרציקלין הפוך.

מדללים ל -100 מיקרוליטר באמצעות d-man. הוסף שמונה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה המכיל את ה-DNA. דגרו על תערובת זו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לוקחים את צלחת שש הבארות עם תאי AF של עכבר, מוסיפים 100 מיקרוליטר מתערובת ה-DNA של חומר הטרנספקציה לבאר, ומפיצים על ידי מערבולת עדינה עם נפח סופי של שני מיליליטר לבאר. השאירו תאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוזי פחמן דו חמצני. למחרת, הסר את מדיום התרבית ולאחר מכן האכילו כל באר תאים בשני מיליליטר של מדיום iPS AF טרי בתוספת נקודה וחמישה מיקרוגרם למיליליטר דוקסיציקלין כדי לגרום לביטוי הגורמים של יאמאנאקה.

האכילו את התאים מדי יום במדיום טרי המכיל דוקס ללא מעבר מנקודה זו והלאה. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ הפלורסנט תוך 24 שעות מהטיפול הראשון בדוקסיצילצין כדי לחפש ביטוי mCherry כלשהו ומדי יום מנקודה זו ואילך להיווצרות מושבה. לאחר שנצפתה היווצרות מושבה, בחר מושבות בודדות לתוך 50 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים.

לאחר מכן, העבירו אותם ברצף לבארות נפרדות של צלחת תרבית רקמה של 96 בארות עם MEF שטופל במיטומיצין c. למחרת, הוסיפו 50 מיקרוליטר טריפסין לכל באר ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לפרק את המושבות לתאים בודדים. לאחר הדגירה, פיפטה את הנוזל למעלה ולמטה כדי לפרק עוד יותר את המושבות.

העבירו 50 מיקרוליטר מתערובת תאי הטריפסין לבאר חדשה המכילה MEF מושבת ולאחר מכן החזירו את התאים לאינקובטור. כאשר התאים מגיעים למפגש של 60 עד 70 אחוזים, פצלו אותם לבאר חדשה של צלחת של 24 בארות ולאחר מכן המשיכו בדגירה בטמפרטורת החדר. ברגע שהתאים הללו מגיעים למפגש של 60 עד 70 אחוזים, הפכו את התאים אחד או שניים לשתי בארות, אחת המכילה דוקסיציקלין ואחת בלי כדי לוודא שגם המושבות יגדלו בהיעדר דוקסיציקלין.

המשך לשמור על מושבות ה- IPS AF והמדיום העצמאי של דוקסיציקלין על MEF מומת ב -37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוז פחמן דו חמצני. החלף את המדיום מדי יום עד שהתאים מוכנים לצביעה, הדמיה ומיצוי RNA. כאן, התאים החיוביים של מי שפיר בעכבר המושרה על ידי דוקסיציקלין מבטאים את סמני הצדר הנדרשים כדי לאשר תכנות מחדש מוצלח.

ניתוח RTPCR באמצעות תאי R1 ES כביקורת הראה ביטוי של סמני הצדר המושרים בנוכחות או היעדר דוקסיציקלין. הביטוי של גן משק הבית, בטא 2 מיקרוגלובולין, נצפה גם בכל שלושת סוגי התאים. טרטומות שבודדו מעכברים שהוזרקו עם התאים הפלורופופוטנטיים המושרים היו מוכתמים במערכת החיסון.

זיהוי חלבון אלפא עוברי, אקטין שריר חלק אלפא ובטא שלוש טובולין במסות מאשר התמיינות תאים לכל שלוש שכבות הנבט, אקטודרם, מזודרם ואנדודרם. יתר על כן, ניתוח RTPCR של גופים עובריים במבחנה ותאי טרטומה in vivo מאשר את הביטוי של גנים סמנים ספציפיים לשכבת הנבט עבור המזודרם, האנדודרם והאקטודרם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולתכנת מחדש תאי מי שפיר בעכברים.

זהו הליך פשוט ובטוח שניתן ליישם גם על תאי מי שפיר אנושיים מדגימה המתקבלת מאבחונים שגרתיים או ניתוחים קיסריים.