לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית Intravital בריאה עם חלון הדמיה מיוצב אבק

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיה מולטיפוטונית לביצוע הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה של תא בודד של הריאה השלמה בזמן אמת באמצעות חלון הדמיה מיוצב ואקום.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבצע הדמיה ארוכת טווח, ברזולוציה גבוהה, של תא בודד של הריאה השלמה באמצעות חלון הדמיה מיוצב ואקום. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר הסרטן; כגון, אילו אינטראקציות מאובטחות בין סטרומה לתאי גידול במהלך השלבים המוקדמים ביותר של גרורות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמיין באופן תיאורטי את הריאה החיה והשלמה ברזולוציה של תא בודד עד 12 שעות.

התחל בקשירת תפר באורך של שלושה סנטימטרים של 2-0 לצנתר קנה הנשימה, רבע סנטימטר מעל התותב, עם קשר כפול. לאחר מכן מרחו משחת עיניים על עיניו של עכבר מורדם והשתמשו בקרם הסרת שיער כדי להסיר את השיער מהצד השמאלי של החיה מקו האמצע של החזה לרבע הגב ומבית השחי ממש מתחת לכלוב הצלעות. נקו את כל עודפי הקרם ועיקרו את העור החשוף עם אתנול 70%.

לאחר מכן, צנרור את החיה. וקשרו את התפר 2-0 סביב החוטם, מתחת לשיניים הקדמיות. העבר את בעל החיים לאזור הניתוח, הקפד לא להוציא את הצנתרים, והפעל את מכונת ההנשמה.

חבר את מכונת ההנשמה לצנתר קנה הנשימה. לאחר מכן הדביקו את הקטטר לחוטם ואת הגפה הקדמית השמאלית לקטטר. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטה בבוהן, השתמש במספריים חדים כדי להסיר סנטימטר מרובע אחד של עור מעל דופן החזה השמאלית.

הרם את כרית השומן של החלב וצרוב את כל כלי הדם החשופים. לאחר מכן, כרתו את כרית השומן והסירו את שכבת השריר עד לכלוב הצלעות, והקפידו לא לחתוך את וריד בית השחי בבסיס הגפה הקדמית. השתמש במלקחיים כדי להרים את הצלע השישית.

לאחר מכן, החזיקו את המספריים החדים בזווית רדודה של חמש מעלות, חתכו את הצלע ליד קצה הפתח בעור. הסר ארבע צלעות רצופות כדי להרחיב את הפתח בדופן החזה, ולחשוף את כל אונת הריאה. לאחר מכן העבר בזהירות את העכבר לשלב הדמיית המיקרוסקופ.

כשהוואקום כבוי, מלא את החדר הפנימי של חלון הוואקום ב-PBS. הפוך את העכבר ומקם את הריאה החשופה מעל חלון כיסוי הדמיית הוואקום. לאט, הפעל את הוואקום.

הניחו רתמת ריסון, עשויה נייר טישו מקופל לשניים, פעמיים על חזהו של העכבר והדביקו את הרתמה לצלחת הבמה. לאחר מכן חבר אוקסימטר דופק לכף החיה. לאחר מכן הנח את החדר הסביבתי על הבמה והדליק את החום כדי לשמור על העכבר בטמפרטורה פיזיולוגית.

כאשר החיה נמצאת במקומה, הבא את עדשת הצמצם המספרי של 25 על 95 ליד החלקת הכיסוי. במצב אפיפלואורסצנטי, צפו בתעלת הפיצי והביאו את רקמת הריאה למיקוד. לאחר מכן, טען מזרק סטרילי עם 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי הגידול, הסר את המזרק של PBS מצנתר וריד הזנב וחבר את מזרק תאי הגידול.

הזרקו לאט את תאי הגידול לווריד הזנב. לאחר מכן חבר מחדש את מזרק PBS לצנתר וריד הזנב ואתר את תאי הגידול בכל רקמת הריאה באמצעות המיקרוסקופ האוקולרי. כעת החלף את מזרק ה-PBS במזרק עמוס ב-100 מיקרוליטר דקסטרן רודמין והזריק לאט את הדקסטרן לעכבר דרך קטטר הזנב.

עקוב אחר מתן הדקסטרן עם שטיפה של 50 מיקרוליטר, סטרילית, PBS. לאחר מכן השג תמונות בכל אחד ממיקומי תאי הגידול שאותרו בעבר כדי לדמיין את הזרימה והשלמות של כלי הדם. עשרים וארבע שעות לאחר ההזרקה, ניתן לדמיין תאי גידול בודדים מקיימים אינטראקציה עם מקרופאגים ומונוציטים בתוך כלי הדם.

יציבות ההדמיה היא כזו שניתן לרכוש ערימות Z עוקבות של השדה וליצור שחזור תלת מימדי. כאן, מוצג פסיפס של חמישה על חמישה של שדות הדמיה, המכסה שדה ראייה של 890 מיקרון, מעל 200 וחמש דקות, ב-15 מיקרון מתחת לפני השטח של הריאה של נגע גרורתי בודד, 12 יום לאחר ההזרקה. למרות שדה הראייה הגדול, הרזולוציה הגבוהה של המסגרות הבסיסיות, המרכיבות את הפסיפס, מאפשרת ללכוד אירועים תת-תאיים, כגון מיטוזה של תא בודד, כפי שמעידה הפרדה כרומוזומלית.

הזרקה תוך-וסקולרית של משקל מולקולרי גבוה, המסומן באופן פלואורסצנטי, מביאה לתיוג לומן כלי הדם; אם כי, אריתרוציטים ולויקוציטים במחזור ללא תווית יכולים לחסום את הדקסטרן. בנימים הקטנים של הריאה, חסימה זו גורמת להבהוב של אות הדקסטרן ולאובדן הגדרה בגבולות כלי הדם. היציבות המרחבית הגבוהה, המסופקת על ידי פרוטוקול זה, מאפשרת מיצוע זמן של תעלת הדם ללא טשטוש, ובכך משחזרת את החסימות הזמניות.

לאחר מכן ניתן להניח את ערוצי האותות האחרים על כלי הדם כדי לספק תצוגה ברורה של גבולות כלי השיט. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשעה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להקפיד לא לחתוך כלי דם גדולים מבלי לצרוב אותם תחילה ולהימנע מלגעת ברקמת הריאה כלל.

לאחר הליך זה, ניתן לדמיין את השלבים המוקדמים ביותר של התפשטות והתפשטות תאי הגידול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הדמיה תוך חיונית בריאה השלמה עם חלון הדמיה מיוצב ואקום. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסוי שלך.