לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית Intravital בריאה עם חלון הדמיה מיוצב אבק
6 באוקטובר 2016
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיה מולטיפוטונית לביצוע הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה של תא בודד של הריאה השלמה בזמן אמת באמצעות חלון הדמיה מיוצב ואקום.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבצע דימות של תא בודד ברזולוציה גבוהה ובטווח זמן ממושך של ריאה שלמה, באמצעות חלון דימות מיוצב בוואקום. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות בתחום חקר הסרטן; למשל, אילו אינטראקציות נוצרות בין הסטרומה לתאי הגידול במהלך השלבים המוקדמים ביותר של גרורות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן, תיאורטית, להדגים ריאה חיה ושלמה ברזולוציה של תא בודד למשך עד 12 שעות.
התחילו בקשירת קטע של 3 אינץ' של תפר 2-0 לקטטר קנה הנשימה, רבע אינץ' מעל התושבת (bushing), באמצעות קשר כפול. לאחר מכן, מרחו משחת עיניים בעיניו של עכבר מורדם והשתמשו בקרם להסרת שיער כדי להסיר את הפרווה מהצד השמאלי של בעל החיים, מקו האמצע של החזה ועד לרבע הגב, ומהבית השחי ועד לשטח שמתחת לכלוב הצלעות. נקו שאריות של קרם ועקרו את העור החשוף באמצעות 70% ethanol.
בשלב הבא, בצעו אינטובציה לבעל החיים. קשרו תפר 2-0 מסביב לחרטום, מתחת לשיניים הקדמיות. העבירו את בעל החיים לאזור הניתוח, תוך הקפדה על אי-הוצאה של הקטטרים, והפעילו את מכשיר ההנשמה.
חברו את מכשיר ההנשמה לקטטר הקנה. לאחר מכן, הדביקו בעזרת סרט הדבקה את הקטטר לאף ואת הגפה הקדמית השמאלית לקטטר. לאחר אישור היעדר תגובה לצביטה בבוהן, השתמשו במספריים חדים כדי להסיר סנטימטר רבוע אחד של עור מעל דופן החזה השמאלית.
הרימו את רקמת השומן של העטרה (mammary fat pad) וצרובו כל כלי דם חשוף. לאחר מכן, כרטו את רקמת השומן והסירו את שכבת השריר עד לכלוב הצלעות, תוך הקפדה שלא לחתוך את הווריד האקסילרי (axillary vein) בבסיס הגפה הקדמית. השתמשו בפינצטה כדי להרים את הצלע השישית.
לאחר מכן, תוך החזקת המספריים החדים בזווית רדודה של חמישה מעלות, גזרו את הצלע סמוך לקצה הפתח בעור. הסירו ארבע צלעות רצופות כדי להרחיב את הפתח בדופן בית החזה, ובכך לחשוף את כל אונה של הריאה. לאחר מכן, העבירו בזהירות את העכבר אל במה הצילום של המיקרוסקופ.
כאשר הוואקום כבוי, מלאו את התא הפנימי של חלון הוואקום ב-PBS. הפכו את העכבר והמיקמו את הריאה החשופה מעל חלון כיסוי הדמיית הוואקום. הפעילו את הוואקום באיטיות.
מקמו רתמת ריסון, העשויה מנייר רקמה מקופל לחצי, פעמיים על חזהו של העכבר והדביקו את הרתמה ללוח הבמה. לאחר מכן, חברו מד פולס-אוקסימטר לכף רגלו של בעל החיים. לאחר מכן, הניחו את תא הסביבה על הבמה והפעילו את החימום כדי לשמור על העכבר בטמפרטורה פיזיולוגית.
כאשר בעל החיים נמצא במנח המתאים, קרבו את עדשת האובייקטיב בעלת מפתח מספרי של 25 by 95 אל לוחית הכיסוי. במצב אפיפלוורסצנציה, צפו בערוץ ה-fitzy והביאו את רקמת הריאה למיקוד. לאחר מכן, מלאו מזרק סטרילי ב-100 µl של תרחיף תאי גידול, הסירו את המזרק עם ה-PBS מקתטר וריד הזנב, וחברו את המזרק עם תאי הגידול.
החדירו לאט את תאי הגידול לווריד הזנב. לאחר מכן, חברו מחדש את מזרק ה-PBS לקטטר של וריד הזנב ואתרו את תאי הגידול ברחבי רקמת הריאה באמצעות העדשה של המיקרוסקופ. כעת החליפו את מזרק ה-PBS במזרק טעון ב-100 microliters של rhodamine dextran והחדירו לאט את ה-dextran לעכבר דרך קטטר הזנב.
בצעו לאחר מתן הדקסטראן שטיפה של 50 µL ב-PBS סטרילי. לאחר מכן, השגיחו תמונות בכל אחד ממיקומי תאי הגידול שזוהו קודם לכן כדי להמחיש את הזרימה ואת שלמות כלי הדם. עשרים וארבע שעות לאחר ההזרקה, ניתן להמחיש תאי גידול בודדים המקימים אינטראקציה עם מקרופגים ומונוציטים בתוך כלי הדם.
יציבות הדימות מאפשרת רכישה של Z-stacks עוקבים של השדה ויצירה של שחזור תלת-ממדי. כאן מוצג פסיפס של חמישה על חמישה שדות דימות, המכסים שדה ראייה של 890 micron, לאורך 205 דקות, בעומק של 15 microns מתחת לפני השטח של ריאה של נגע גרורתי בודד, 12 ימים לאחר ההזרקה. למרות שדה הראייה הרחב, הרזולוציה הגבוהה של הפריימים הבסיסיים המרכיבים את הפסיפס מאפשרת ללכוד אירועים סוב-תאיים, כגון מיטוזה של תא בודד, כפי שמעידה הפרדת הכרומוזומים.
הזרקה תוך-כלית של דקסטראן בעל משקל מולקולרי גבוה המסומן פלואורסצנטית, גורמת לסימון של הלומן הוסקולרי; עם זאת, כדוריות דם אדומות וכדוריות דם לבנות זורמות שאינן מסומנות עלולות לחסום את הדקסטראן. בנימי הריאה הקטנים, חסימה זו גורמת להבהוב של אות הדקסטראן ולאובדן ההגדרה של גבולות כלי הדם. היציבות המרחבית הגבוהה, המסופקת על ידי פרוטוקול זה, מאפשרת מיצוע זמני של תעלת הדם ללא טשטוש, ובכך משחזרת את החסימות הזמניות.
ניתן להשכיב את ערוצי האותים האחרים על גבי כלי הדם כדי לספק מבט ברור של גבולות כלי הדם. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בכשעה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להיזהר שלא לחתוך כלי דם גדולים ללא צריבה מוקדמת, ולהימנע מכל מגע עם רקמת הריאה.
בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להדמיות את השלבים המוקדמים ביותר של הפצה ושגשוג של תאי גידול. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע דימיון אינטרה-ויטלי (in vivo) בריאה שלמה באמצעות חלון דמיון מיוצב בוואקום. תודה לצפייתכם ובהצלחה בניסוי שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיית מולטי-פוטון לביצוע הדמיה רחוקה-טווח ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים בריאה שלמה בזמן אמת, באמצעות חלון הדמיה מיוצב בוואקום. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במחקר הסרטן בנוגע לאינטראקציות בין הסטרומה לתאי הגידול במהלך גרורות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- חקר הסרטן
רקע
- דימות ארוך-טווח של רקמות חיות הוא חיוני להבנת אינטראקציות תאיות.
- מיקרוסקופיית מולטי-פוטון מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה.
- טכניקה זו יכולה להמחיש את הריאה השלמה ברזולוציה של תא בודד.
- הבנת הגסטזיס חיונית לפיתוח טיפולים בסרטן.
מטרת המחקר
- להדמיות של אינטראקציות בין תאי סטרומה לתאי גידול.
- לשיפור ההבנה של השלבים המוקדמים של גרורות.
- לספק שיטה לדימות ארוך טווח של רקמת ריאה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרוסקופיה רב-פוטונית לצילום.
- שימוש בחלון צילום מיוצב בוואקום.
- הכנת מודל העכבר לצילום.
- מתן חומרי הרדמה ומשחה לעיניים לשם רווחת בעלי החיים.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של הריאה השלמה למשך עד 12 שעות.
- השגת תמונות ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים.
- תובנות לגבי אינטראקציות תאיות במהלך גרורות.
- הדגמה של יעילות השיטה בדימוי חי.
מסקנות
- שיטה זו מספקת כלי רב-עוצמה למחקר הסרטן.
- דימות לטווח ארוך יכול לחשוף תהליכים ביולוגיים קריטיים.
- מחקרים נוספים יכולים להתבסס על טכניקה זו כדי להפיק תובנות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימיון תוך-חי (intravital imaging) ארוך טווח של ריאה שלמה מאפשר תצפית ישירה על אירועים מטאסטטיים מוקדמים ברזולוציה של תא בודד, ובכך נסגר פער קריטי במחקרים פרה-קליניים של סרטן. יכולת זו תומכת בהסרת סיכונים מנגנונית (mechanistic de-risking) באמצעות ויזואליזציה של אינטראקציות בין הגידול לסביבתו (tumor-stroma) ודינמיקה וסקולרית בהקשר פיזיולוגי רלוונטי. תובנות אלו משפרות את תיקוף המטרות ואת הביטחון החזוי בתהליכי גילוי תרופות אונקולוגיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של אינטראקציות של תאי גידול בזמן אמת עם רכיבי הסטרומה במהלך תחילת הגסטזיס.
- ערך תפעולי: מספק תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על פנוטיפים תאיים ברקמה שלמה.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי מניעים מולקולריים מרכזיים של השתגרה מוקדמת של תאי גידול (metastatic seeding).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות של אינטראקציות בין תאים, דינמיקה של ממברנות ופרפוזיה לצורך כיול הבדיקה.
- ערך תפעולי: קובע תנאי דימות הדירים לאורך 12 שעות, המאפשרים הערכה עקבית של השפעת תרכובות.
- יכולת הרחבה: מסייע בהכנת מערכות ביולוגיות מאושרות עבור זרימות עבודה של סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאימות פרה-קליני על ידי שמירה על רלוונטיות פיזיולוגית במהלך תצפיות ארוכות טווח.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע עבור קריטריוני התקדמות באמצעות ויזואליזציה של אירועים תת-תאיים, כגון מיטוזה ושלמות כלי דם.
- הלימה של ביומרקרים: מאפשר התאמה בין פנוטיפים של דימות לבין ביומרקרים תרגומיים פוטנציאליים של פוטנציאל גרורתי.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת נתונים כמותיים ודינמיים על תהליכים מטאסטטיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת האינטראקציות בין תאי הסטרומה לתאי הגידול הקובעות את ההישרדות והצמיחה המוקדמות.
- סריקה: מספק תנאים סטנדרטיים המוכנים לבדיקה, עם מדדים כמותיים וסקולריים-תאיים לצורך סריקת תרכובות.
- אנליזה: מאפשר מיצוע זמני ושחזור תלת-ממדי להפקת אותות כלי דם יציבים ודינמיקה תת-תאית לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: שומר על שלמות מערכת רלוונטית למחלה משלב הגילוי ועד לשלבים הפרה-קליניים, ובכך תומך בתצפיות התואמות לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימוג תוך-חי (intravital imaging) הניתנת לשימוש חוזר בפרויקטים של אונקולוגיה הדורשים מודלים של גרורות בריאות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במודלים של גרורות באמצעות ויזואליזציה ישירה וארוכת טווח של אינטראקציות תאיות.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה באמצעות חלון מיוצב בוואקום ובקרות סביבתיות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) על ידי אספקת תובנות מוקדמות וניבויות לגבי כשירות גרורית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף של מועמדים מותאם סיכון, בהתבסס על השפעות אנטי-מטסטטיות שנצפו ברקמה שלמה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים תוך-חיים (intravital surgery), מיקרוסקופיה רב-פוטונית ועיבוד תמונה לשחזור כלי דם.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל חלון דימות מיוצב בוואקום, תא סביבתי ועדשות בעלות NA גבוה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי הניתוח, הדימות והניתוח כדי להבטיח תוצאות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הפרוטוקול למודלים של גידולים אחרים או לרקעים גנטיים שונים.
- מוגבל בשל המורכבות הטכנית של ניתוחי חזה והצורך בגישה מדויקת לכלי דם ובייצוב הריאות.
