צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הקלטת מהדק תיקון של תא שלם מנוירונים פנימיים ברשתית בתכשיר רשתית העכבר השטוח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה של הרשתית כגון מגוון הנוירונים, הקשרים הסינפטיים שלהם בתנאים נורמליים ופתולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהחיבורים האנכיים והרוחביים נשמרים ומאפשרים ללמוד את מעגלי הרשתית עם רכיבים רוחביים גדולים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהרשתית היא רקמה דקה ועדינה שיש לטפל בה בזהירות ובסבלנות רבה. תרגול, לעומת זאת, הוא הדרך הטובה ביותר לשלוט בזה. כדי להתחיל בהליך זה, גלגל את גלגלי העכבר במגבת נייר נקייה כדי להסיר דם.

לאחר מכן, טבלו אותם בתמיסת רינגר היונקים הקרבוגן. לאחר מכן, נקב חור בלימבוס עם מחט בגודל 23 וחצה את גלגלי העיניים על ידי חיתוך לאורך הלימבוס עם מספריים מיקרו. לאחר מכן, הסר את הקרנית והעדשה בעזרת מלקחיים עדינים.

להרכבה שלמה של הרשתית, קלף בעדינות את כל הרשתית מהאפיתל הפיגמנטי בעזרת מלקחיים עדינים ובצע ארבעה חתכים אורתוגונליים של 1.5 עד 2 מילימטר מהקצה לכיוון ראש עצב הראייה. לאחר מכן, טבלו קרום ניטרוצלולוזה מנוקב לתוך הכלי וגררו בעדינות את הרשתית מעליו כשצד ה- GCL כלפי מעלה. לאחר מכן, הנח את ראש עצב הראייה לתוך החור המרכזי בעת הכנת רשתית שלמה.

לאחר מכן, העבירו את הממברנה עם הרשתית לכלי נקי אחר. משטחים בעדינות את הרשתית כצלב מלטזי בעזרת מברשת צבע עדינה ומניחים את כל ארבעת הקצוות מעל החורים. כתם את קרום הניטרוצלולוזה בפיסת נייר פילטר יבש והסר את הזגוגית והקרום המגביל הפנימי בעזרת מלקחיים ומברשת צבע.

ודא שכל קצוות הרשתית מחוברים במלואם לממברנה לפני העברת המכלול לתא ההקלטה עם החלקת כיסוי זכוכית אטומה בתחתית. אבטח את הממברנה להחלקת הכיסוי עם שומן ואקום והרטיב את הרשתית עם התמיסה החיצונית. היזהר לא ללכוד בועות אוויר מתחת למכלול.

לאחר מכן, הנח את החדר על הבמה של מיקרוסקופ זקוף. שופע את החדר בתמיסה חיצונית קרבוגן של 34 מעלות צלזיוס בקצב של כשלושה מיליליטר לדקה. בדוק תחילה את הרשתית תחת עדשה סובייקטיבית פי 10.

לאחר מכן, השתמש בעדשת טבילה במים פי 60 כדי לראות נוירונים GCL ו-INL תחת DIC והגדרת האפיפלואורסצנט. כדי להמחיש את tdTomato המבטא SACs, השתמש במקור אור LED לבן בשילוב עם מסנן עירור של 554 ננומטר ומסנן פליטה של 581 ננומטר. בהליך זה, סנן את התמיסה הפנימית דרך מסנן מזרק לתוך חוט המילוי החוזר המותאם אישית.

לאחר מכן, הכנס את החוט למיקרופיפטה שזה עתה נשלפה והוציא את התמיסה הפנימית ליד הקצה עד שהתמיסה מכסה את חוט האלקטרודה הכסופה ליותר מחמישה מילימטרים. לאחר מכן, הדק את המיקרופיפטה על מחזיק אלקטרודה עם משיכת יניקה שדרכה ניתן לכוונן את הלחץ בתוך האלקטרודה על ידי דחיפה או משיכה של הבוכנה של צינור מחובר, מזרק פלסטיק של 10 מיליליטר. לאחר מכן, אתר את הפיפטה מתחת למטרה והורד אותה לכ-100 מיקרומטר מעל הרשתית.

במצב העוקב הנוכחי, השתמש בקיזוז DC כדי לאפס את נפח ה-DC העומדtagאות המתח. מדוד את התנגדות הפיפטה במצב המהדק הנוכחי על ידי הזרקת זרמי גל מרובעים במשרעת קבועה דרך הפיפטה בזמן שהיא באמבטיה. נטרל את ההבדל על ידי סיבוב כפתור Raccess והשתמש בקריאה עליו כדי לחשב את התנגדות הפיפטה.

לאחר מכן, הביאו לאט את האלקטרודה לכ-10 מיקרומטר מעל הרשתית. הפעל לחץ חיובי על האלקטרודה. לאחר מכן, צפו בהשתקפות משתנה ליד קצה הפיפטה כשהיא מתקרבת לרשתית.

במהירות אך בעדינות, הכניסו את הפיפטה לתוך ה-GCL והפחיתו את הלחץ החיובי באופן מיידי. הזיזו את הפיפטה לעבר נוירון מסומן והימנעו ממגע עם נוירונים אחרים, כלי דם וכפות רגליים של תאי מולר. הפעל לחץ חיובי יותר, במידת הצורך, כדי למנוע סתימת אלקטרודות.

לאחר מכן, מקם את קצה הפיפטה ליד תא העצב המסומן עד שנראה גומה. לאחר מכן, שחררו את הלחץ החיובי ואפשרו לקרום הפלזמה לקפוץ בחזרה אל קצה הפיפטה. החל זרמים שליליים של 20 עד 120 פיקואמפ על הפיפטה כדי לסייע ביצירת חותם ג'יגה-אום.

חשוב לאפשר לקרום התא להתאושש לאחר שחרור הלחץ החיובי מכיוון שאטימה מצוינת שנוצרת באופן טבעי בין הממברנה לפתח הפיפטה חשובה לשימור מורפולוגיה של התא לאחר ההקלטה. במידת הצורך, הפעל יניקה עדינה כדי למשוך את קרום הפלזמה לתוך הפיפטה. המתן חמש דקות לאחר היווצרות האיטום כדי לקרוע את קרום התא על מנת לאפשר פינוי של התמיסה הפנימית שנשפכה על ידי היתוך על.

לאחר שהממברנה נקרעה, ובמצב מהדק הנוכחי, הפעל את איזון הגשר והתאם אותו באמצעות כפתור Raccess. רשום את הזרמים הפוסט-סינפטיים המעוררים והמעכבים במצב מהדק המתח על ידי החזקת התא בפוטנציאל היפוך. לאחר ההקלטה, הסר בעדינות את הפיפטה מהסומה.

העבירו את המכלול מהתא לכלי נקי. לאחר מכן, נתק וחבר מחדש את הרשתית על קרום ניטרוצלולוזה שטוח אחר מבלי לנקב חורים כדי להבטיח שטוחות הרשתית במהלך הקיבוע. הרקמה מוכנה כעת לצביעה.

תמונות אלה מראות כי ניתן לזהות באופן אמין תאים כולינרגיים הן ב-GCL והן ב-INL על ידי פלואורסצנטיות tdTomato ולכוון לרישום מהדק תיקון של תא שלם תחת DIC. ניתן לחשוף את התנודה של פוטנציאל הממברנה שלהם על ידי הקלטת מהדק זרם, והתנודה המונעת על ידי הזרמים הסינפטיים המעכבים והמעוררים מתגלה על ידי החזקת התאים באפס מילי-וולט ושלילי 75 מילי-וולט בהתאמה בתנאי מהדק המתח. כאן, אפיון היסטולוגי לאחר הוק של תאים מתועדים מצביע על המורפולוגיה הדנדריטית האופיינית ל-SAC ורמות הריבוד ב-IPL.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאבטח את מכלול קרום הרשתית בתא ההקלטה ולהתייבש מבלי ללכוד בועות אוויר מתחתיו בצורה הדוקה ועדינה כדי לספק דגימה הניתנת להקלטה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הקלטות מהדק תיקון כפול על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם התנודות של תאי המטרה המרובים מונעות על ידי אותם מנגנונים סינפטיים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה של הרשתית לחקור את הסינכרוניות של התנודה בין נוירוני רשתית שכנים ברשתית מנוונת של קולטני אור.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להסיר הומור זגוגי ולהכין תושבת שטוחה ברשתית להקלטת מהדק תיקון ממוקדת בקנה מידה מלא מנוירונים פנימיים ברשתית.