Name: צמד תיקון הקלטה של תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: למדו לבצע הקלטת patch clamp בתאי עצב הרשתית בעכברים בשיטת הכנה שטוחה. שיטה זו מאפשרת חקר מעגלים סינפטיים ומגוון נוירונים תוך שימור הקשרים האנכיים והאופקיים ברשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג'ונג ג'אנג ושין גואן על הסיוע הטכני. אנו מודים לד"ר רורי מק'קוויסטון מאוניברסיטת וירג'יניה קומונוולת' על הקמת מתקן מהדק התיקון הראשון שלנו ועצות לגבי הליכים ניסיוניים. אנו מודים לד"ר סמואל וו על הצעות להקלטת מהדק מתח. העבודה נתמכת על ידי מענקי NIH EY013811, EY022228 ומענק ליבה של חזון EY002520. C-KC הוא יו"ר קרן מחקר הרשתית ע"ש אליס ר. מקפירסון במכללת ביילור לרפואה.

אישור אתי - נהלים הקשורים בנושאי בעלי חיים בוצעו בהתאם לכללים וההתקנות של ה- National Institutes of הנחיות בריאות חיות מחקר, כפי שאושר על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי ועדת השימוש של ביילור לרפואה. חיצוני 1. ופתרונות פנימיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתמיסת רינגר היונק במהלך דיסקציה רשתית כפתרון החיצוני הקלטת אלקטרו שלאחר מכן. הכן את הפתרון של יונקי רינגר מ 10x פתרון מניות (ללא סידן) ביום ההקלטה, ולהוסיף CaCl 2 טיפה חכמה לאחר 15 דקות של carbogenation (95% O 2, 5% CO 2). הפתרון 1x הסופי מכיל (מ&quot;מ): 120 NaCl, KCl 5, 25 NaHCO 3, 0.8 Na 2 4 HPO, 0.1 לאא 2 4 PO, 2 CaCl 2, 1 MgSO 4 ו -10 D- גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשני פתרונות פנימיים לאפיין תנודות SAC. מִבְחָןהתועלת של פתרונות מוכנים מראש הצמד תיקון הקלטות ממושך כל תא על RGCs עכבר בוגר ולאחסן את אצוות מאומת 500 aliquots μl ב -20 ° C עד השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקלטת תנודה פוטנציאל הממברנה, להשתמש בפתרון פנימי מבוסס אשלגן המכיל (מ&quot;מ): 125 K-גלוקונאט, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0.5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES ו -0.2% biocytin (w / v). התאם ל- pH 7.3 עם KOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקלטת מעוררים וזרמים postsynaptic מעכבות, להשתמש בפתרון פנימי מבוססי צזיום המכיל (מ&quot;מ): 100 Cs-methanesulfonate, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0.5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES ו -0.2% biocytin ( w / v). התאם ל- pH 7.3 עם CsOH. </li></ol></li></ol> 2. הכנה לקראת יום הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין קרום nitrocellulose עם חורים פתוחים, באופן ידני אגרוף הממברנה עם אגרופן אישית עשוי מחט מזרק קהה 16 G ולשטח קרום בין שני לוחות זכוכית נקי. במשך מותקן בכלהר הרשתית, לעשות חור מרכזי 0.2 מ&quot;מ קוטר ולהקיף אותו ב -4 חורים גדולים כי הם 1-1.2 מ&quot;מ קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע נימה מילוי חוזר אישית לטעינת פתרון פנימי לתוך אלקטרודות, להמיס קצה פיפטה 10 μl באמצע בעדינות להאריך את החלק נמס עד שהוא מתקרר ומתקשה. רק לפני השימוש, השתמש סכין גילוח נקי לקצץ הנימה עד שהוא מעט יותר מאשר טפטפות התיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך טפטפות תיקון ב חולץ לתכנות מ שפופרת זכוכית בורוסיליקט עם נימה פנימית. לייצר את micropipettes ביום הניסוי ולהשתמש בהם מיד. הערה: לקבלת צקי הקלטה, אנו משתמשים בהגדרה החולצת הבאה: חום: 484; למשוך: 0; מהירות: 25; זמן השהיה: 1; לחץ: 400 וערך הרמפה של 462. את OD ומזהה של צינורות בורוסיליקט הם 1.65 מ&quot;מ ו -1.0 מ&quot;מ, בהתאמה. התנגדות של טפטפות היא 10-14 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת hr לפני קציר רקמות, להפשיר צינור של פתרון פנימי ידי שאקיng זה על מערבולת עבור&gt; 30 דק &#39;. </li></ol> 3. רשתית Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה על ידי isoflurane 4% חמצן עד שבעל החיים מאבדים את היענות קמצוץ בוהן. להקריב את החיה על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים שתי העיניים את עצבי הראייה ב 1-2 מ&quot;מ הרחק ראשי עצב הראייה עם איריס מספריים ישר הצביע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלגלים את העיניים על מגבת נייר נקייה להסיר דם ואז לטבול אותם הפתרון של carbogenated יונקים רינגר. פאנץ חור על לימבוס עם מחט 23 G ולחצות את העיניים על ידי חיתוך לאורך לימבוס עם מספריים מיקרו. הסר את הקרנית ואת העדשה באמצעות מלקחיים בסדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת ברשתית כל הר, לקלף בעדינות הרשתית כולה את האפיתל פיגמנט עם מלקחיים בסדר ולעשות ארבעה חתכים 1.5-2 מ&quot;מ מאונך מהקצה כלפי ראש עצב הראייה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול קרום nitrocellulose אגרוף לתוך צלחת ובעדינות לגרור את הרשתית על זה עםפונה כלפי מעלה GCL. מניח את ראש עצב הראייה לתוך החור במרכז בעת הכנת רשתית כל הר. מעבירים את הממברנה עם הרשתית לעוד צלחת נקייה. בעדינות לשטח את הרשתית עם מברשת צבע עדינה להיראות כמו כלאה מלטזית ולהניח את כל ארבעת קצוות על החורים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חלק של הרשתית הוא לבחון בכל פעם, לחתוך כל עיינית מוכן משלב 3.3 לתוך 3-4 חתיכות עם סכין גילוח עם האפיתל פיגמנט נשאר מחובר. הגנו על חתיכות בשימוש מן האור בתמיסה carbogenated חיצוניים ולהשתמש בהם בתוך 12 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם הממברנה nitrocellulose עם פיסת נייר סינון יבש להסיר את קרום הגבלת זגוגי והפנימי עם מלקחי מברשת צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי כל קצות הרשתית מחוברים באופן מלא על הקרום לפני העברת ההרכבה לתוך תא ההקלטה עם תלוש כיסוי זכוכית אטום בתחתית. אבטח את הממברנה עם ואקום גריז כדי להחליק את המכסה ואת rehydratדואר הרשתית עם הפתרון החיצוני. היזהר שלא מלכודת כל בועות אוויר מתחת ההרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התא לבמה של מיקרוסקופ זקוף. Perfuse את החדר עם חם (34-35 מעלות צלזיוס) פתרון חיצוני carbogenated בשיעור של ~ 3 מ&quot;ל לדקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הרשתית תחת עדשה אובייקטיבי 10x הראשון, ולאחר מכן להשתמש עדשת מים טבילה 60x לראות נוירונים GCL ו INL תחת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) ו / או epifluorescence. כדי להמחיש שקי להביע tdTomato, השתמש לבן LED מקור אור בשילוב עם מסנן עירור של 554 ננומטר מסנן פליטה של ​​581 ננומטר. </li></ol> 4. הקלטת Whole-cell צמד תיקון מ רשתית שטוח ההר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון הפנימי דרך פילטר מזרק לתוך נימת המילוי החוזרת המותאם אישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הנימה לתוך micropipette טרי משך לוותר על הפתרון הפנימי סמוכים לקצה עד הפתרון מכסה חוט האלקטרודה הכסף עבור&gt;5 מ&quot;מ. הדקו את micropipette על בעל אלקטרודה עם מוט שאיבה, שדרכו הלחץ בתוך האלקטרודה יכול להיות מותאם על ידי לדחוף או למשוך את הבוכנה של מזרק פלסטיק 10 מ&quot;ל צינור המחובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא פיפטה תחת המטרה להפיל אותו ~ 100 מיקרומטר מעל הרשתית. על פי מצב-חסיד הנוכחי (אני = 0), השתמש לקזז DC לאפס את האות מתח DC עומד. מדוד את התנגדות פיפטה תחת המהדק הנוכחי (אני קלאמפ) מצב על ידי הזרקת זרמי גל מרובע משרעת קבוע דרך פיפטה בזמן שהוא באמבטיה ולנטרל את ההבדל על ידי סיבוב ידית Raccess. השתמש קריאה על הידית Raccess לחשב התנגדות פיפטה ידי חוק אוהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט מביאים את האלקטרודה אל ~ 10 מיקרומטר מעל הרשתית. החל לחץ חיובי אל האלקטרודה. צפה שינוי ההשתקפות ליד קץ פיפטה כפי שהוא מתקרב הרשתית. במהירות אבל להכריח פיפטה בעדינות לתוך GCL ולהפחית את pressu החיוביתמחדש מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את פיפטה לעבר נוירון שכותרתו. הימנע פניית נוירונים אחרים, כלי דם endfeet של תאי מולר. החל יותר לחץ חיובי אם הדבר יידרש כדי למנוע סתימת האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את קצה פיפטה ליד קו האמצע של נוירון שכותרתו עד גומה גלויה. שחרר את הלחץ החיובי ולאפשר קרום הפלזמה להתאושש על קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 20 עד 120 PA זרמים שליליים אל פיפטה לעזור היווצרות חותם גיגה אוהם. למרוח שאיבה עדינה במידת הצורך למשוך את קרום התא אל פיפטה. מתן 5 דקות לאחר היווצרות חותמת כדי לקרוע את קרום התא. הדבר זה מאפשר הפתרון הפנימי נשפך להיות מסומן על ידי superfusion. לקרוע את הקרום על ידי שאיבה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קרע הקרום ובעוד במצב מהדק הנוכחי, לעבור על איזון גשר לערוך אותו באמצעות ידית Raccess. הערה: עבור תאים קטנים כמו SAC, נדרשת התאמה קלה בלבד, אם בכלל. Alternatively, מעורר שיא זרמי postsynaptic מעכבים במצב מהדק מתח (קלאמפ V) על ידי לחיצה על תא פוטנציאלי היפוך של כלוריד (סביב -75 mV) ו גלוטמט (סביב 0 mV), בהתאמה. בדוק ולשנות את מיקום פיפטה במידת הצורך כדי להתאים הרשתית מזדמנים ו / או להיסחף micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקליט פוטנציאל הממברנה או שינוי הנוכחי לפני, במהלך ואחרי טיפול תרופתי, להכין חוסמי הסינפטי (למשל, CNQX, AP5, picrotoxin, tubocurarine, וכו &#39;) ווסתים ערוץ (למשל, flupirtine, דופמין, חומצה meclofenamic, וכו&#39;) טריים על יום הניסוי ממניות קפוא. לדלל את התרופות עם הפתרון של carbogenated רינגר. וליישמם באופן יצווה באמצעות זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההקלטה, להסיר את פיפטה בעדינות סומה. מעבירים את הרכבה מהאולם אל צלחת נקייה. ניתוק מחדש לצרף את הרשתית על עוד קרום nitrocellulose בברוטליות ללא חול אגרוףes כדי להבטיח שטיחות רשתית במהלך קיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הרשתית על ידי טבילה אותו paraformaldehyde 4% למשך 30 דקות ב RT. הסר את הרשתית מן הקרום nitrocellulose ולשטוף אותו בהרחבה עם 1x PBS. לחשוף את המורפולוגיה של התאים שרשמה O / מכתים N עם streptavidin צבען מצומדות מדולל 1x PBS עם 0.4% Triton X-100 ב 4 ° C 14. הר הרשתית במדיום antifade ולבחון תאים רשמו באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקה. הערה: נהלים מעורבים paraformaldehyde, אשר תנודתי רעילה, צריכים להתנהל בתא טיוטת בטיחות. </li></ol>

<ol><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+bursting+of+AII+amacrine+cells+underlies+oscillations+in+the+rd1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina.</a> J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).</li>
<li>Gregg, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nyctalopin+expression+in+retinal+bipolar+cells+restores+visual+function+in+a+mouse+model+of+complete+X-linked+congenital+stationary+night+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness.</a> J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).</li>
<li>Hellmer, C. B., Ichinose, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+light-evoked+postsynaptic+responses+in+neurons+in+dark-adapted%2C+mouse+retinal+slice+preparations+using+patch+clamp+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques.</a> J Vis Exp. (96), (2015).</li>
<li>Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+dendritic+branching+in+direction+selective+retinal+ganglion+cells+in+nob1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).</li>
<li>Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+membrane+potential+fluctuations+of+cholinergic+amacrine+cells+in+mice+lacking+ERG+b-waves%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).</li>
<li>Demas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+maintain+eye-specific+segregation+in+nob%2C+a+mutant+with+abnormally+patterned+retinal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity.</a> Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).</li>
<li>Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Retinal+Oscillation+Mechanism+in+an+Autosomal+Dominant+Photoreceptor+Degeneration+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model.</a> Front Cell Neurosci. 9, 513(2015).</li>
<li>Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neural+oscillator+in+the+degenerating+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina.</a> J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).</li>
<li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+spontaneous+ganglion+cell+spike+activity+in+animal+models+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa.</a> J Ophthalmol. , (2011).</li>
<li>Stasheff, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+sustained+spontaneous+hyperactivity+and+temporary+preservation+of+OFF+responses+in+ganglion+cells+of+the+retinal+degeneration+%28rd1%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse.</a> J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).</li>
<li>Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+spontaneous+activity+in+the+degenerating+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of spontaneous activity in the degenerating retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 277(2015).</li>
<li>Trenholm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+oscillatory+activity+arising+within+the+electrically+coupled+AII+amacrine-ON+cone+bipolar+cell+network+is+driven+by+voltage-gated+Na%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels.</a> J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).</li>
<li>Chen, C. K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+changes+in+displaced+cholinergic+amacrine+cells+lacking+Gbeta5%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).</li>
<li>O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+physiological+properties+of+cat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells.</a> J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unconventional+Glutamatergic+Circuit+in+the+Retina+Formed+by+vGluT3+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells.</a> Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).</li>
<li>Hoggarth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+wiring+of+distinct+amacrine+cells+in+the+directionally+selective+retinal+circuit+permits+independent+coding+of+direction+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size.</a> Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).</li>
<li>Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+oscillations+drive+correlated+spiking+of+ON+and+OFF+ganglion+cells+in+the+rd1+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (1), e86253(2014).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+phosphorylation+of+Cx36+gap+junctions+in+the+AII+amacrine+cells+of+RD+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 390(2015).</li>
<li>Enoki, R., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+horizontally+sliced+preparation+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method of horizontally sliced preparation of the retina.</a> Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).</li>
<li>Akrouh, A., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+function+of+three+VIP-expressing+amacrine+cell+types+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina.</a> J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מעבדות רבות הקליטו מתא עצב GCL בדירת הר הכנה 15-18, אך ההליכים שלנו מאפשרים הקלטה מתא עצב INL. הרינו להדגיש מספר צעדים חיוניים להקלטות שגרה מוצלחות. רעננויות השטיחות של הרשתית חשובות חודר אותו עם טפטפת הקלטה. בהקשר זה, את הקובץ המצורף האיתן של הרשתית אל קרום nitrocellulose אגרוף הוא מעל לכל מושגת על ידי קליטה חולפת של פתרון ואחריו להחזרת נוזלים בזמן (שלב 3.4-3.6). במהלך תקופה קצרה זו, בדרך כלל פחות מ -...

כחלק נגיש בקלות של מערכת העצבים המרכזית, הרשתית הייתה במשך עשרות שנים מודל שימושי במחקרים במדעי המוח. סימון גנטי של נוירונים איפשר אפיון מפורט של קשרים סינפטיים ברשתית. עם מתודולוגיות רבות זמינות לבחינת תפקוד ומורפולוגיה של נוירונים ברשתית, טכניקת הקלטת מהדק התיקון הייתה חיונית להבנתנו הנוכחית של אותות המועברים אנכית ברשתית. אותות אלה מקורם בספיגת פוטונים בקולטני אור ונשלחים למרכזי הראייה במוח באמצעות זינוק של תאי גנגליון רשתית (RGCs). למרות גוף ידע גדול שנצבר עד כה, המגוון העצבי ברשתית של יונקים כלי דם נותר בלתי פתור וחוסם את ההערכה המלאה של מעגלי הרשתית המשרתים ראייה תקינה. הסיבה לכך היא שרוב ההקלטות בוצעו על פרוסות רשתית כדי להחליף את שלמות המעגל הרוחבי בגישה לנוירונים פרוקסימליים יותר ברשתית1-3. כדי לקבל תמונה מקיפה על האופן שבו הרשתית מחשבת אותות חזותיים, רצוי אפוא לתעד נוירונים בתושבות שטוחות שבהן קשרים רוחביים, גדולים וקטנים, עשויים להישמר טוב יותר.
 כאשר העברה סינפטית מקולטני אור לתאים דו-קוטביים נקטעת עקב מסלול איתות של קולטן גלוטמט מטבוטרופי פגום 6 (mGluR6) בתאים דו-קוטבייםדה-פולריזציה 4-6 או פשוט כתוצאה מאובדן קולטני אור ברשתית מנוונת7-10, RGCs רבים מציגים פעילויות תנודתיות. תנודות אלו מקורן במספר מקורות, אולם זה הכרוך בצימוד צומת פער בין תאי AII amacrine (AII-ACs) ותאים דו-קוטביים של חרוט דה-פולריזציה (DCBCs) קיבל את מירב תשומת הלב ולכן הוא מובן בצורה הטובה ביותר1,7,11. מצאנו מקור נוסף, שנמשך תחת מצור פרמקולוגי של רשת AII-AC/DCBC הנ"ל ומניע תנודות של SACs מסוג OFF בעכברי RhoΔCTA ו-Nob עם רשתית נטולת אפרנטיות7,8,12. כאן אנו מפרטים את הפרוטוקול שלנו להכנת תושבות שטוחות ברשתית להקלטת נוירונים INL. גישה זו משתמשת בקווי עכבר מסחריים (מלאי Jax מס' 006410 ו-007905) כדי לסמן נוירונים ברשתית כולינרגית על ידי ביטוי חלבון פלואורסצנטי (tdTomato) הניתן לזיהוי במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד באופטיקה משפרת ניגודיות. כמה תוצאות ניסיוניות שהושגו באמצעות גישה זו דווחו בעבר4,5,7,13.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי שלב קבוע עם DIC</td><td>Olympus</td><td>BX51-WI</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטורים</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>מגבר מהדק תיקון</td><td>A-M System</td><td>ממיר AM2400</td><td></td></tr><tr><td>AD מכשיר</td><td>לאומי</td><td>NI-USB-6221</td><td></td></tr><tr><td>בקר חימום</td><td>Warner Instrument</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>מוטבע תנור חימום</td><td>Warner Instrument</td><td>SC-20</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Rainin</td><td>Dynamax</td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטה</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>צינור זכוכית עם נימה</td><td>King Precision Glass</td><td>ממריץ מותאם אישית</td><td></td></tr><tr><td></td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>K-גלוקונאט</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Mg</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cs-methanesulfonate</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>Nalgene</td><td>171</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>Rainin</td><td></td><td></td>17013002</tr><tr><td>10 &mu; l קצה פיפטה</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-130RL</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-488</td><td>ThermoFisher</td><td>S-11223</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza</td><td>17-517Q</td><td></td></tr></tbody></table>

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר deafferentated רשתית העכבר

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

הרשתית היונקת היא רקמה שכבתית מורכבת סוגי נוירונים מרובים. כדי להבין כיצד חזותי אותות מעובדים בתוך הרשת הסינפטי המורכבת שלה, הקלטות אלקטרו משמשות לעתים קרובות כדי ללמוד קשרים בין נוירונים בודדים. יש לנו אופטימיזציה הכנה שטוח הר עבור צמד תיקון הקלטה של ​​נוירונים מסומנים גנטי בשני GCL (שכבת תא גנגליון) ו INL (שכבת גרעין פנימית) של רשתית עכבר. נוירונים INL הקלטה שטוח mounts הוא מועדף על פרוסות בגלל קשרים אנכיים וצידית נשמרים בתצורה לשעבר, המאפשר מעגלי רשתית עם רכיבים לרוחב גדולים כדי להיחקר. השתמשנו בהליך זה כדי להשוות תשובות של נוירונים-שותפה מראים רשתית כגון תאי amacrine מספרים כולינרגית (צקים).

קלטות נציג וחוץ צקי OFF-סוג של רשתית עכבר deafferentated מוצגות באיור 1. תאים כולינרגית בשני GCL ו INL ניתן לזהות באופן אמין על ידי קרינת tdTomato וממוקדת להקלטת מהדק תיקון כל תא תחת DIC (איור 1 א) לחשוף תנודה של הפוטנציאלים הממברנה שלהם (עקבות למעלה) ואת הזרמים סינפטיים המניעים אותם (עקבות תחתונות, איור 1B). זרמים סינפטיים מעכבים ו מעוררים מתגלים על ידי החזקת התאים ב 0 mV ו -75 mV, בהתאמה, בתנאים ...

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע הקלטת תיקון מהדק כל תא על נוירונים ברשתית מן הכנת שטוח הר.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע הקלטת patch clamp של תא שלם (whole-cell) מנוירונים ברשתית הפנימית בהכנה של רשתית עכבר בשיטת flat-mount. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה של הרשתית, כגון גיוון הנוירונים וקשריהם הסינפטיים בתנאים נורמליים ופתולוגיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהקשרים האנכיים והצדדיים נשמרים, מה שמאפשר לחקור מעגלי רשתית בעלי רכיבים צדדיים נרחבים.באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יעניו קשיים, מכיוון שהרשתית היא רקמה דקה ועדינה שיש לטפל בה בזהירות רבה ובסבלנות. עם זאת, תרגול הוא הדרך הטובה ביותר לשלוט בה. כדי להתחיל בהליך זה, גלגלו את עיני העכבר בנייר סופג נקי כדי להסיר שאריות דם.לאחר מכן, טבול אותם בתמיסת רינגר (Ringer) לממיפריים המוגבשת בקרבוגן. לאחר מכן, פנקר חור בלימבוס באמצעות מחט במידה 23 וחלק את גלגל העין לשניים על ידי חיתוך לאורך הלימבוס עם מספרי מיקרו. לאחר מכן, הסר את הקרנייה ואת העדשה באמצעות פינצטה עדינה.עבור דגימה של רשתית במלואה (whole-mount), קלפו בעדינות את הרשתית כולה מהאפיתל הפיגמנטי באמצעות פינצטה עדינה, ובצעו ארבעה חתכים מאונכים באורך של 1.5 עד שני מילימטרים מהדופן לכיוון ראש העצב האופטי. לאחר מכן, טבלו ממבנה של ניטרוצלולוז מחורר בתוך הצלחת וגררו בעדינות את הרשתית מעליו, כאשר צד ה-GCL פונה מעלה. לאחר מכן, מקמו את ראש העצב האופטי בחור המרכזי בעת הכנת רשתית במלואה.לאחר מכן, העבירו את הממברנה עם הרשתית לצלוחית נקייה אחרת. שטחו בעדינות את הרשתית לצורת צלב מלטזי באמצעות מכחול צבע עדין, והניחו את ארבעת הקצוות מעל החורים. ספגו את ממברנת הנייטרוצלולוז בעזרת פיסת נייר סינון יבש, והסִירו את הזגוגית ואת ממברנת הגבלה הפנימית באמצעות פינצטה ומכחול צבע.וודאו שכל קצוות הרשתית מודבקים באופן מלא לממברנה לפני העברת המערכת לתא ההקלטה עם כיסוי זכוכית אטום בתחתית. הדביקו את הממברנה לכיסוי הזכוכית באמצעות גריז ואקום והחזירו את הרשתית למצב הידרטציה באמצעות התמיסה החיצונית. היזהרו שלא לכלוא בועות אוויר תחת המערכת.שלב הבא, הניחו את התא על המשטח של מיקרוסקופ אנכי. זרימו לתא תמיסה חיצונית מחומצנת בקרבוגן בטמפרטורה של 34 °C בקצב של כ-3 mL לדקה. בחנו תחילה את הרשתית תחת עדשה אובייקטיבית של 10x.לאחר מכן, השתמש בעדשת טבילה במים 60x כדי לצפות בנוירונים של ה-GCL וה-INL תחת DIC ובהגדרת אפי-פלואורסצנציה. כדי להדגים SACs המבטאים tdTomato, השתמש במקור אור LED לבן בשילוב עם מסנן עירור של 554 nanometers ומסנן פליטה של 581 nanometers. בהליך זה, סנן את התמיסה הפנימית דרך מסנן מזרק לתוך פילמנט המילוי האחורי (backfill filament) המותאם אישית.לאחר מכן, הכניסו את הסיב לתוך מיקרופיפטה שנמשכה לאחרונה והנפיקו את התמיסה הפנימית קרוב לקצה עד שהתמיסה תכסה את תיל אלקטרודת הכסף לאורך יותר מחמישה מילימטרים. לאחר מכן, הדקו את המיקרופיפטה על תומך אלקטרודה באמצעות שאיבה, שדרכה ניתן לכוון את הלחץ בתוך האלקטרודה על ידי דחיפה או משיכה של בוכנת מזרק פלסטיק של 10 milliliter המחובר אליה. לאחר מכן, מקמו את הפיפטה מתחת לעדשה והורידו אותה למרחק של כ-100 micrometers מעל הרשתית.במצב מעקב אחרי זרם (follower mode), השתמש בהסטה של ה-DC (DC offset) כדי לאפס את אות מתח ה-DC העומד. מדוד את התנגדות הפיפטה במצב סגירת זרם (current clamp mode) על ידי הזרקה של זרמי גל ריבועי בעוצמה קבועה דרך הפיפטה בעודה באמבטיה. נטרל את ההפרש באמצעות סיבוב כפתור ה-Raccess והשתמש בערך המופיע עליו כדי לחשב את התנגדות הפיפטה.לאחר מכן, קרבו באיטיות את האלקטרודה למרחק של כ-10 micrometers מעל הרשתית. הפילו לחץ חיובי על האלקטרודה. לאחר מכן, עקבו אחר השינוי בהשתקפות סמוך לקצה הפיפטה בעודו מתקרב לרשתית.החדירו את הפפטה במהירות אך בעדינות אל ה-GCL והפחיתו מיד את הלחץ החיובי. הזיזו את הפפטה לעבר נוירון מסומן והימנעו ממגע עם נוירונים אחרים, כלי דם ורגליים סופיות של תאי Muller. הפעילו לחץ חיובי נוסף, במידת הצורך, כדי למנוע סתימה של האלקטרודה.בשלב הבא, מקמו את קצה הפ pipette בקרבת הנוירון המסומן עד שייראה שקע (dimple). לאחר מכן, שחררו את הלחץ החיובי ואפשרו לממברנה הפלזמית לקפוץ בחזרה אל קצה ה-pipette. עשו שימוש בזרמים שליליים של 20 עד 120 picoamps ב-pipette כדי לסייע ביצירת חסימה מסוג gigaohm seal.מתן אפשרות לממברנת התא לחזור למצבה לאחר שחרור הלחץ החיובי הוא חשוב, כיוון שאיטום מצוין הנוצר באופן טבעי בין הממברנה לפתח הפ pipette חיוני לשימור מורפולוגיית התא לאחר ההקלטה. במידת הצורך, יש להפעיל שאיבה עדינה כדי למשוך את ממבננת הפלזמה אל תוך ה-pipette. המתן חמש דקות לאחר היווצרות האיטום לפני קרע של ממברנת התא, כדי לאפשר את סילוק התמיסה הפנימית שנשפכה באמצעות superfusion.לאחר קרע הממברנה ובזמן שהמערכת נמצאת במצב clamp של זרם (current clamp), הפעילו את איזון הגשר (bridge balance) וכוון אותו באמצעות כפתור ה-Raccess. רשמו את זרמי הפוסט-סינפטיים המעוררים והמעכבים במצב clamp של מתח (voltage clamp) על ידי החזקת התא בפוטנציאלי היפוך. לאחר ההקלטה, הוציאו בעדינות את הפפיתה מהסומה.העבירו את המכלול מהתא לצלחון נקי. לאחר מכן, הסירו והצמידו מחדש את הרשתית לממברנת ניטרוצלולוז שטוחה אחרת, ללא נקב, כדי להבטיח את שטוחו של הרקמה במהלך הקיבוע. הרקמה מוכנה כעת לצביעה.תמונות אלו מראות שניתן לזהות באופן מהימן תאי כולינרגיים הן ב-GCL והן ב-INL באמצעות פלואורסצנציית tdTomato, ולבצע להם הקלטת whole-cell patch clamp תחת DIC. ניתן לחשוף את התנודות של פוטנציאל הממברנה שלהם באמצעות הקלטת current clamp, ואת התנודות המונעות על ידי זרמים סינפטיים מעכבים ומעוררים ניתן לחשוף על ידי החזקת התאים ב-0 millivolts וב-75 millivolts שליליים, בהתאמה, תחת תנאי voltage clamp. כאן, אפיון היסטולוגי של התאים המוקלטים לאחר השחיקה מעיד על המורפולוגיה הדנדריטית הטיפוסית של SAC ועל רמות השכבה ב-IPL.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לקבע את מכלול ממברנת הרשתית בתא ההקלטה ולבצע רהידרציה באופן הדוק ועדין, ללא כליאת בועות אוויר תחתיה, כדי לספק דגימה שניתן להקליט. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון הקלטות dual-patch clamp, על מנת לענות על שאלות נוספות, למשל האם התנודות של תאי מטרה מרובים מונחות על ידי אותם מנגנונים סינפטיים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה של הרשתית לחקור את סנכרון התנודות בין נוירוני רשתית סמוכים ברשתיות עם דגנרציה של פטורצפטורים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן הסרת ההומור ויטראלי והכנת דגימה שטוחה של הרשתית (retinal flat-mount) לצורך הקלטת patch clamp מקיפה וממוקדת מנוירונים של השכבה הפנימית ברשתית.

patch-clamp-recording-starburst-amacrine-cells-flat-mount-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

מאמר זה מתאר את ההקלטה של ​​תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

סרטון זה מדגים טכניקת מהדק טלאי של תא שלם להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה. פיפטת זכוכית דקה עם אלקטרודה משמשת להתקרבות לתאים אמקריניים מתפוצצים בכוכבים (SACs) בתוך הרשתית. לאחר יצירת חותם, היניקה מוחלת כדי לקרוע את הממברנה וליצור את תצורת מהדק טלאי התא כולו. לבסוף, זרימת היונים דרך קולטני SAC סינפטיים נמדדת באמצעות התצורה.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה

סרטון זה מדגים הקלטה של תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בהכנת פרוסת רקמת רשתית עכבר מותאמת כהה. פרוסת הרשתית ממוקמת בתא הקלטה, ופיפטת הקלטה משמשת ליצירת רצף חשמלי עם תא גנגליון רשתית. פולסי אור מוחלים כדי ליצור פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים בתאי הגנגליון, אשר נרשמים על ידי פיפטה.

תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בתאי עצב של פרוסות רשתית עכבר

מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

נדגים כיצד להכין פרוסות רשתית מעין העכבר ולתעד תגובות אור בתאי עצב ברשתית. ההליך כולו מתנהל בתנאים מותאמים לחושך.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

למדו לבצע הקלטת patch clamp בתאי עצב הרשתית בעכברים בשיטת הכנה שטוחה. שיטה זו מאפשרת חקר מעגלים סינפטיים ומגוון נוירונים תוך שימור הקשרים האנכיים והאופקיים ברשתית.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

גלה סרטונים נוספים

צמד תיקון הקלטה של תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר