In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג'ל עכבר

המטרה הכוללת של בדיקת ג'ל מטריצת in-vivo זו היא לחקור את האינטראקציה של תאי אנדותל עם טפילים. בדיקת מטריג'ל זו נועדה לעזור לחוקרים לחקור את השלבים העיקריים באנדרוגנזה. זה גם יאפשר זיהוי של מסלולי איתות האחראים לשלבים מרכזיים ביצירת כלי דם כמו גם גנים שתפקודם הלקוי יכול להוביל להפרעות בכלי הדם ולסטיות אחרות של אנדרוגנזה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לנו לחקור את היווצרות כלי הדם in vivo המערבת הן תאי אנדותל והן תאי התמיכה שלהם, פריציטים. כדי להתחיל, גדל תרביות תאי אנדותל וטפילים אנושיים על צלחות של 100 מילימטר עם 10 מיליליטר של המדיה המתאימה. החלף את המדיה כל יומיים-שלושה עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%.

על מנת להכין את תמיסת ג'ל המטריקס לערבוב עם התאים, יש להפשיר מלאי של ג'ל מטריקס למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכינו 1.5 מיליליטר לאחסון בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס לטווח ארוך, או בארבע מעלות צלזיוס עד שבועיים. כל תקע ניסיוני ידרוש 200 מיקרוליטר ג'ל מטריקס.

אז צינור מלא אחד יכול לספק שישה תקעים עם עודף של 25%. הכן כל מנה נדרשת לשימוש על ידי הוספת 15 מיקרוליטר של מלאי בטא-FGF מופשר פי 100. מערבבים את הבטא-FGF לתמיסה על ידי פיפטה, ואז מדגרים על קרח לפחות 30 דקות לפני הוספת התאים.

בשלב זה, יש לקרר כמה מזרקי אינסולין בגודל 28 סמ"ק עבור הזריקות. כדי לאסוף את התאים מצלחות התרבית, הסר את המדיה ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS. לאחר הסרת ה- PBS, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת טריפסין והחזיר את הצלחות לחממה למשך דקה.

לאחר מכן, פיפטה שני מיליליטר של אמצעי תרבית מעל הצלחות כדי לנתק את התאים ולאסוף את המדיום לצינור של 15 מיליליטר. כעת, בדוק את ריכוז האוספים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, הכינו כמויות של תאים בצינורות של 15 מיליליטר.

שילוב של מיליון תאי אנדותל ו-200,000 טפילים משמש כאן עבור קבוצת הניסוי. לאחר מכן, צנטריפוגה את התא ב-400 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף את הנפח המחושב של ג'ל מטריצה לגלולת התא, וערבב עם פיפטינג עדין כך שלא ייווצר קצף, מכיוון שלא ניתן להזריק בועות אוויר.

כעת שמרו את התכשירים על הקרח עד שהעכברים מוכנים להזרקה. לאחר הרדמת עכבר באיזופלורן, ואישור המצב המורדם בצביטה בבוהן, חבר את העכבר למערכת שאינה נושמת מחדש המספקת איזופלורן והנח אותו על כרית החימום, כשהצד הגחוני כלפי מטה. כעת הסר כסנטימטר מרובע של שיער משני האזורים האחוריים הצדדיים.

לאחר מכן, נגב את העור החשוף באמצעות 70% אלכוהול. לאחר מכן, טען מיליליטר אחד מתמיסת התא המוכנה למזרק צונן, המספיק לארבעה תקעים. כדי לבצע זריקה, הרם את העור האחורי כדי לאתר את החלל התת עורי.

לאחר מכן יש להזריק לאט 200 מיקרוליטר באופן שווה לחלל התת עורי האחורי של כלוב הצלעות, ולהסיר לאט את המחט כדי למנוע דליפה. לאחר ההזרקה תיווצר בליטה במקום. נגב את המקום באלכוהול, ואז מתאר את הבליטה בטוש קבוע כך שניתן יהיה למצוא אותה מאוחר יותר.

לאחר מכן, חזור על הליך ההזרקה בצד השני של העכבר. הקפד להזריק את כל התאים תוך שלוש דקות או שהם יתחילו להיצמד למזרק. שלב ההזרקה הוא קריטי כדי להצליח כדי להבטיח שפקק ג'ל המטריצה ייווצר בין שכבות העור והשריר כך שהפקק ישמור על צורה טובה והוא לא יתפזר.

לפני שתמשיך להזריק את העכבר הבא, תן לעכבר המוזרק להישאר על כרית החום למשך דקה כדי לתת למטריצה זמן לג'ל. לאחר המתת חסד, הגדר את העכבר על שלב ההפעלה. לאחר הסרת שיער שצמח מחדש מאתר ההזרקה, מצא את קווי הסמן המזהים את מיקום התקע.

לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים עדינים, בצע חתך לאורך הגבול המסומן של הפקק, בניצב לעור ודרך השריר שמתחתיו. חותכים בזהירות סביב שולי הגבול המסומן. לאחר מכן הסר את התקע, והשאיר אותו דחוס בין שכבות העור והשרירים.

שטפו מיד את הפקק בכוס קטנה של PBS כדי להסיר את הדם. לאחר מכן, הנח את כל התקע בצינור של 50 מיליליטר עם 25 מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד. תן לו להתייצב בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות ללא כל תסיסה.

למחרת, העבירו את התקעים ל -25 מיליליטר של אתנול 70% למשך 24 שעות. לאחר מכן, המשך בהטמעת פרפין. קטעי פקקים המכילים תאי אנדותל בלבד מראים שחלק מכלי הדם אינם מתמלאים בדם המארח לאחר 14 יום in vivo.

לעומת זאת, תקעים המכילים גם תאי אנדותל וגם טפילים, מציגים כלי דם רבים לאחר 14 יום in vivo. לתקעים אלה יש תאים חיוביים לצביעת אקטין בשריר חלק, הנראים באדום, מיד בסמוך לתאי אנדותל חיוביים CD31, הנראים בירוק. לכן, טפילים עשויים למלא תפקיד משמעותי ביצירת כלי דם מתהווים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם את טכניקת in-vivo העוצמתית הזו כדי לחקור היווצרות כלי דם בשימוש בסוגי תאים מרובים. טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים לחקור נושאים שונים של ביולוגיה של כלי דם במודלים של עכברים. בעקבות הליך זה, ניתן להפעיל גם שיטות אחרות, כגון PCR כמותי ואימונובלטינג מערבי כדי לענות על שאלות נוספות כגון שינויים בביטוי גנים ופרוטאומיקה.

טכניקה רבת עוצמה זו תאפשר לחוקר לחקור in-vivo כיצד תאי אנדותל וטפילים מתקשרים במהלך היווצרות כלי הדם. וזה שלב מפתח באנדרוגנזה. טכניקה רבת עוצמה זו תאפשר לחוקר גם לחקור אינטראקציות תא-תא אחרות הרלוונטיות להבנת מחלות כלי דם כגון יתר לחץ דם ריאתי, בין היתר.