Name: In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס גל עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: חקור אינטראקציות אנדותל-פריציט אנושיות בחי בעכבר באמצעות מבחן plug מטריקס ג'ל. שיטה זו מאפשרת זיהוי מסלולי מעבר אותות ביצירת כלי דם וגנים הקשורים להפרעות כלי דם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ד"ר ק. יואן נתמך על ידי מענק פיתוח מדענים של איגוד הלב האמריקאי (15SDG25710448) ופרס הוכחת הרעיון של האגודה ליתר לחץ דם ריאתי (SPO121940). ד"ר ו. דה חסוס פרז נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה מקרן רוברט ווד ג'ונסון, פרס NIH K08 HL105884-01, פרס האגודה ליתר לחץ דם ריאתי, פרס מחקר ביו-רפואי מאיגוד הריאות האמריקאי ומחקר תרגומי ורפואה יישומית פרס מאוניברסיטת סטנפורד.

<ol><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li>
<li>Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pericytes+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of pericytes in angiogenesis.</a> Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).</li>
<li>Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).</li>
<li>Liu, Y., Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-specific+activation+of+Src+and+Rho+initiates+capillary+morphogenesis+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells.</a> FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).</li>
<li>Grant, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+endothelial+cells+with+a+laminin+A+chain+peptide+%28SIKVAV%29+in+vitro+and+induction+of+angiogenic+behavior+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo.</a> J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).</li>
<li>Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+modulation+of+endothelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta+depends+upon+the+composition+and+organization+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix.</a> J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).</li>
<li>Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+10-day-old+chick+embryo+model+for+studying+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).</li>
<li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+pathway+is+required+for+pericyte+recruitment+during+pulmonary+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis.</a> Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).</li>
<li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).</li>
<li>Chen, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pericytes+for+ischemic+heart+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human pericytes for ischemic heart repair.</a> Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).</li>
<li>Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+blood+vessels%2C+endothelial+cells%2C+and+vascular+pericytes+in+insulin+secretion+and+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action.</a> Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).</li>
<li>Ricard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+pericyte+coverage+mediated+by+endothelial-derived+fibroblast+growth+factor-2+and+interleukin-6+is+a+source+of+smooth+muscle-like+cells+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).</li>
<li>Buchwalow, I. B., Bocker, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchwalow%2C+IB+%22Immunohistochemistry%3A+Basics+and+Methods%22">Immunohistochemistry: Basics and Methods</a>. , 1-153 (2010).</li>
<li>Tata, D. A., Anderson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+investigation+of+capillary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the investigation of capillary structure.</a> J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).</li>
</ol>

לא צורפו אינטרסים פיננסיים מתחרים.

את assay תקע ג&#39;ל מטריקס הוכיחה להיות שיטה נוחה וחזקה כדי להעריך ויסות הגנים ב אנגיוגנזה, תרכובות angiogenic ו antiangiogenic in vivo, וכדי להשלים בדיקות במבחנה. כאן אנו מתארים בפרוטרוט assay תקע ג&#39;ל מטריקס הרומן של אנגיוגנזה אדם שחוקר את האינטראקציה בין תאי האנדותל pericytes במהלך היווצרות כלי. ישנם כמה צעדים רומן וביקורתיים בפרוטוקול זה. תאי מעבר נמוך (מעבר 1 - 4) תמיד יהיו בעדיפות בגלל...

אנגיוגנזה הוא התהליך שבו כלי דם חדשים נוצרים מרשת וסקולרית קיים 1 והוא במוקד מחקר המתמשך על פני תחומים רבים, החל התפתחות תקינה למחלות. תהליך דינאמי זה כרוך ההתפשטות וההגירה של תאי האנדותל (EC) וגיוס pericytes לבנות צינור כלי דם כי היא מכוונת כלפי האתר שצריך העברת חמצן וחומרי הזנה 2. כדי ללמוד את התהליך הזה דורש assay דינמית לא פחות, והכי חשוב אחד שיכול לשחזר את הטבע תלת ממדי של היווצרות צינור. במבחנת מבחני מטריקס 3D פותחו כדי לתת מענה לצורך הזה עבדו היטב על מנת לאפשר לחוקרים לקבוע את הצעדים הבדידים במרחב ובזמן שבו אנגיוגנזה מתקיים 3, 4, 5, 6. עם זאת, מודלים מטריקס במבחנה 3D אלה מוגבלים ללימוד כלי הלא perfusedד ולכן הם חסרים רכיבים קריטיים רלוונטיים לתהליך אנגיוגנזה (למשל, במחזור צמיחה וגורם מעכבים, מתח טבעי / כוחות לרוחב מיטת כלי הדם) ולא מצליח לדמות את הסביבה המורכבת נוכח רקמת חיים. כדי לטפל מגבלה זו, כמה in vivo מבחני אנגיוגנזה פותחו 7, כולל assay תקע מטריקס ג&#39;ל אשר יהיה המוקד של הדו&quot;ח שלנו 8, 9. את assay תקע ג&#39;ל מטריקס הוא assay אנגיוגנזה ומבוסס in vivo שמושך חוקר כפי שהוא מספק פלטפורמה יציבה על מנת לבחון את התפקידים של תאים וחומרים שונים אנגיוגנזה. ג&#39;ל מטריקס הוא פתרון קרום במרתף זמין מסחרי כי מופרש על ידי Engelbreth-הולם-הנחיל (EHS) שורת תאי סרקומה עכבר מבצרת לחומר דמוי ג&#39;ל על 37 מעלות צלזיוס. הג&#39;ל מטריקס ניתן לערבב עם תאים ו / או חומרים, כגון גורמי גדילה, ו Injected מתחת לעור לתוך העכבר. מארח ECS יפלוש התקע למעלה מ -14 ימים, יוצר רשת כלי דם, ולהפוך להיות perfused עם של דם המארח. נכון להיום, מבחני תקע ג&#39;ל מטריקס התמקדו אך ורק על חקר התנהגות תא האנדותל במהלך אנגיוגנזה, עם זאת, למיטב ידיעתנו לא נעשה מאמץ עדיין לקבוע אם assay זה יכול לשמש כדי תאי האנדותל שיתוף תרבות pericytes ללמוד כיצד סוגי תאים אלה שני אינטראקציה במהלך אנגיוגנזה. באופן ספציפי, הבנת הקשר בין ECS ו pericytes היא בעל ערך לחקר מחלות שבו אובדן כלי דם הוא פתולוגי, כולל איסכמיה כלי דם ומחלות היקפיות וסקולרית 10, 11, 12. כאן אנו מתארים פרוטוקול מציג pericytes נגזרות האנושיות לתערובת ג&#39;ל מטריקס יחד עם ECS האדם גורם גדילה פיברובלסטים (bFGF). תערובת זו לאחר מכן ניתן מוזרק מתחת לעור in את dorsum של עכברי SCID כדי לאפשר היווצרות של מצופית מתפקד במלואה, pericyte, כלי היברידי. הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד להכין אטמי ג&#39;ל מטריקס המכילים ECS אדם עם או בלי pericytes האנוש, שם לעכברי SCID וכיצד לנתח את הסעיפים היסטולוגית עבור נקודות קצה אנגיוגנזה קריטיות.

<table><tbody><tr><td>PBS (מי מלח עם חוצץ פוספט)</td><td>קורנינג</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% טריפסין/0.53 מ"מ ערכת</td><td>EDTA Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Media (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>כוללת מדיה, תוסף גדילה EC ופניצילין/סטרפטומיצין, כל אחד מסופק בנפח המתאים לערבוב קל</td></tr><tr><td>ערכת Pericyte Media (PM) Sciencell</td><td></td><td>1201</td><td>כולל מדיה, תוסף גידול פריציטים ופניצילין/סטרפטומיצין, כל אחד מהם מסופק בנפח המתאים לערבוב קל</td></tr><tr><td>של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים אנושיים ראשוניים</td><td>יוזמת פריצת דרך יתר לחץ דם ריאתי</td> סוג תאים זה זמין גם מסחרית.<td></td><td> תאים המשמשים במעבר 1-4</td></tr><tr><td>פריציטים ריאתיים אנושיים ראשוניים</td><td>יוזמת פריצת דרך יתר לחץ דם ריאתי</td> סוג תאים זה אינו זמין מסחרית, אך פריציטים במוח כן.<td></td><td> תאים המשמשים במעבר 1-4</td></tr><tr><td>bFGF (גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי)</td> תמיסת מלאי <td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>היא 50 &mu; גרם/מ"ל ב-0.1% BSA ב-PBS, ב-50 &mu; l ומאוחסן ב -20 מעלות</td></tr><tr><td>מטריג'ל מטריצת קרום מרתף</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 גרם 1 סמ"ק מזרק אינסלואין</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>עכברי SCID (כשל חיסוני משולב חמור)</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>5557</td><td>NOD. זן נוקאאוט גמא SCID IL2R הוא הזן הטוב ביותר; גיל 4-6 שבועות</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה, סטרילי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות עליונים עם בורג, סטרילי</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>PAP עט</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>קרם הסרת שיער Nair</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD31 נוגדן ראשוני</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B4737</td><td>פתרון עבודה הוא 1:50</td></tr><tr><td>אנטי-אנושי אקטין שריר חלק CY3 נוגדן פלואורסצנטי ראשוני</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>פתרון עבודה הוא 1:300</td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב עז; 488/ירוק</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>פתרון עבודה הוא 1:250</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI</td><td>solution Cell איתות</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>מס' 1.5 החלקות כיסוי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ציטראט 10x</td><td>Millipore</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיות עדינות במיוחד</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>פורמלין (פרפורמלדהיד)</td> <td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>קלטות טישו</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay plug מטריקס ג&#39;ל עכבר

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

אנגיוגנזה היא התהליך שבו נוצרים כלי דם חדשים מכלי דם קיימים. צמיחת כלי דם חדשים דורשת התפשטות מתואמת של תאי אנדותל, נדידה ויישור ליצירת מבנים צינוריים ואחריהם גיוס פריציטים כדי לספק תמיכה בציורי קיר ולהקל על התבגרות כלי הדם. גישות תרבית תאים במבחנה הנוכחיות אינן יכולות לשחזר באופן מלא את הסביבה הביולוגית המורכבת שבה תאי אנדותל ופריציטים מתקשרים לייצור כלי דם פונקציונליים. אנו מציגים יישום חדשני של בדיקת תקע ג'ל מטריצת in vivo לחקר אינטראקציות אנדותל-פריציטים ויצירת כלי דם פונקציונליים באמצעות עכברי מוטציה משולבת חמורה של כשל חיסוני (SCID). בקצרה, ג'ל מטריקס מעורבב עם תמיסה המכילה תאי אנדותל עם או בלי פריציטים ואחריו הזרקה לחלק האחורי של עכברי SCID מורדמים. לאחר 14 יום, פקקי ג'ל המטריצה מוסרים, קבועים ונחתכים לניתוח היסטולוגי. ניתן לכמת ולהשוות את האורך, המספר, הגודל וההיקף של כיסוי פריציטים של כלי דם בוגרים (המוגדר על ידי נוכחות של כדוריות דם אדומות בלומן) בין קבוצות ניסוי באמצעות פלטפורמות סטטיסטיות מסחריות. מעבר לשימוש בו כבדיקת אנגיוגנזה, ניתן להשתמש בבדיקת תקע ג'ל מטריקס זו לביצוע מחקרים גנטיים וכפלטפורמה לגילוי תרופות. לסיכום, פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים להשלים את מבחני המבחנה הזמינים לחקר אינטראקציות אנדותל-פריציטים ואת הרלוונטיות שלהם לאנגיוגנזה מערכתית או ריאתית.

נציג צביעת H &amp; E ו- immunofluorescent סעיפי תקע ג&#39;ל מטריקס מוצגת באיור 2. חלקים מן EC רק תקעים להציג כמה כלים כי הם בעיקר לא perfused עם דם (איור 2 צד ימין למעלה, חיצים שחורים) ואילו תקעים המכילים גם ECS ו pericytes להציג כמה perfused כלי בקטרים ​​גדולים וכיסוי pericyte המלא, כפי שמעידים מכתים SMA חיובית מיד בסמוך ECS CD31 חיובי. התוצאות מראות כי pericytes לשחק תפקיד משמעותי היווצרות כלי דם המתהווה וכי תהלי...

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות אנדותל-pericyte אדם העכבר באמצעות וריאציה של assay אנגיוגנזה תקע ג&#39;ל מטריקס.

In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג&#39;ל עכבר

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

המטרה הכוללת של בדיקת ג'ל המטריקס in-vivo זו היא לבחון את האינטראקציה של תאי אנדותל עם טפילים. בדיקת המטריג'ל (matrigel) זו נועדה לסייע לחוקרים ללמוד את השלבים העיקריים באנדרוגנזה. היא תאפשר גם את זיהוי נתיבי השסונוי האחראים לשלבים מרכזיים ביצירת כלי דם, וכן גנים ששיבוש בתפקודם עלול להוביל להפרעות וסקולריות ולהשתבשויות אחרות באנדרוגנזה.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לחקור את היווצרות כלי הדם in-vivo, תוך מעורבות של תאי אנדותל ותאי התמיכה שלהם, הפריציטים. לתחילת העבודה, גדלו תרביות של תאי אנדותל ותאי פריציטים אנושיים בצלחות של 100 מילימטר עם 10 מיליליטר מהמדיה המתאימה. החליפו את המדיה מדי יומיים עד שלושה ימים עד שהתאים יגיעו ל-80% confluency.על מנת להכין את תמיסת ה-matrix gel לערבוב עם התאים, יש להפשיר מלאי של matrix gel למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. לאחר מכן, יש להכין אליקוטות של 1.5 mL לאחסון ארוך טווח בטמפרטורה של 20°C-, או בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים. כל פלאג (plug) ניסויי ידרוש 200 µL של matrix gel.לפיכך, מבחנה אחת של מלאי יכולה לספק שישה פלאגים עם עודף של 25%. הכינו כל אליקווט נדרש לשימוש על ידי הוספת 15 µl של מלאי 100x של beta-FGF שהופשר. ערבבו את ה-beta-FGF בתמיסה באמצעות פיפטור, ולאחר מכן הדגירו על קרח למשך 30 דקות לפחות לפני הוספת התאים.בשלב זה, קררו מספר מזרקי אינסולין של 1cc בכיסוי 28-gauge לצורך ההזרקות. כדי לאסוף את התאים מלוחיות התרבית, הסירו את המצע ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS. לאחר הסרת ה-PBS, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת trypsin והחזירו את הלוחיות לאינקובטור למשך דקה אחת.לאחר מכן, העבירו בפיפט שני מיליליטר של מצע גידול על הצלחות כדי להפריד את התאים ואספו את המצע לשפופרת של 15 מיליליטר. כעת, בדקו את ריכוז הדגימות שנאספו באמצעות המוציטומטר (hemocytometer). לאחר מכן, הכינו מנות (aliquots) של תאים בשפופרות של 15 מיליליטר.עבור קבוצת הניסוי נעשה שימוש בשילוב של מיליון תאי אנדותל ו-200,000 טפילים. לאחר מכן, סבבו את מנות התאים בצנטריפוגה ב-400g למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו את הנפח המחושב של matrix gel למשקע התאים, וערבבו באמצעות פיפוט עדין כדי למנוע היווצרות קצף, שכן לא ניתן להזריק בועות אוויר.כעת יש לשמור את התכשירי ההכנה על קרח עד שהעכברים יהיו מוכנים להזרקה. לאחר הרדמת עכבר באמצעות isoflurane, ואישור מצב ההרדמה באמצעות צביטה בכף הרגל, חברו את העכבר למערכת ללא נשימה חוזרת המספקת isoflurane והניחו אותו על פד חימום, כאשר הצד הבטני פונה כלפי מטה. כעת הסירו שערה משטח של כסנטימטר רבוע משני האזורים האחוריים הצדיים.לאחר מכן, נקה את העור החשוף באמצעות 70% alcohol. בשלב הבא, טען מיליליטר אחד של תמיסת התאים שהוכנה לתוך מזרק מקורר, כמות המספיקה לארבעה פלאגים. כדי לבצע הזרקה, הרם את העור הגבי אל מול השטח התת-עורי.לאחר מכן, הזרק באיטיות ובאופן שווה 200 microliters לחלל התת-עורי מאחורי כלוב הצלעות, והוצא את המחט באיטיות כדי למנוע דליפה. לאחר ההזרקה, תיווצר בליטה באתר ההזרקה. נקה את האתר באלכוהול, ולאחר מכן סמן את גבולות הבליטה באמצעות טוש קבוע כדי שניתן יהיה לאתר אותה מאוחר יותר.לאחר מכן, חזרו על הליך ההזרקה בצדו השני של העכבר. הקפידו להזריק את כל התאים בתוך שלוש דקות, אחרת הם יתחילו להידבק למזרק. שלב ההזרקה הוא קריטי לביצוע מדויק כדי להבטיח שפקק ג'ל המטריקס ייווצר בין שכבות העור והשריר, כך שהפקק ישמור על צורה טובה ולא יהפוך למפוזר.לפני השריץ של העכבר הבא, השאירו את העכבר המוזרק על משטח החימום למשך דקה כדי לאפשר למטריצה להתגבש. לאחר ההמתה, מקמו את העכבר על שולחן הניתוח. לאחר הסרת שיער שצמח מחדש מאזור ההזרקה, אתרו את קווי הסימון המזהים את מיקום הפלאג (plug).לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים עדינים, בצעו חתך לאורך הגבול המסומן של הפלאג (plug), בניצב לעור ועד לשריר שמתחתיו. גזרו בזהירות מסביב להיקף הגבול המסומן. לאחר מכן הוציאו את הפלאג, תוך שמירתו כשכבה דחוסה בין שכבות העור והשריר.שטפו מיד את הפקק בביקר קטן המכיל PBS כדי להסיר את הדם. לאחר מכן, העבירו את הפקק כולו לשפופרת של 50 milliliter עם 25 milliliters של 4% paraformaldehyde. השאירו את הדגימה לקיבוע בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות ללא ערבוב.למחרת, העבירו את הפקקים ל-25 milliliters של 70% ethanol למשך 24 שעות. לאחר מכן, המשיכו בטמיעה בפרפין. חתכים של פקקים המכילים תאי אנדותל בלבד מראים שחלק מהכלי הדם אינם מקבלים פרפוזיה של דם המאכסן לאחר 14 ימים in-vivo.בניגוד לכך, פלאגים המכילים הן תאי אנדותל והן טפילים, מראים כלי דם רבים המקבלים דם (perfused) לאחר 14 ימים in-vivo. פלאגים אלו מכילים תאים החיוביים לצביעת smooth muscle actin, הנראים באדום, בסמיכות מיידית לתאי אנדותל החיוביים ל-CD31, הנראים בירוק. לפיכך, ייתכן שלטפילים תפקיד משמעותי בהיווצרותם של כלי דם ראשוניים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליישם טכניקה עוצמתית זו in-vivo כדי לחקור יצירת כלי דם בשימוש בסוגי תאים מרובים. טכניקה זו תסלול את הדרך עבור חוקרים לבחון נושאים שונים של ביולוגיה וסקולרית במודלים של עכברים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע גם שיטות אחרות, כגון quantitative PCR ו-Western immunoblotting, כדי לענות על שאלות נוספות כגון שינויים בביטוי גנים ובפרוטאומיקה.טכניקה עוצמתית זו תאפשר לחוקר ללמוד in-vivo כיצד תאי אנדותל וטפילים מקיימים אינטראקציה במהלך היווצרות כלי דם, המהווה שלב מפתח באנדרוגנזה. טכניקה עוצמתית זו תאפשר לחוקר ללמוד גם אינטראקציות אחרות בין תאים הרלוונטיות להבנת מחלות וסקולריות, כגון יתר לחץ דם ריאתי, בין היתר.

in-vivo-study-human-endothelial-pericyte-interaction-using-matrix-gel

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים מתודולוגיה להעביר חוט האדם הנגזרות דם אנדותל מושבת תאים יוצרי (ECFCs) ו מח עצם שמקורם בתאי גזע mesenchymal (MSCs), מוטבע ג'ל קולגן / פיברונקטין, תת עורי לעכברים immunodeficient. שילוב זה תא / ג'ל יוצרת רשת כלי דם האדם מתחבר עם vasculature העכבר.

האדם Bioengineering רשתות כלי הדם של עכברים Immunodeficient

בסרטון זה, אנו מדגימים הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות תאי דם-אנדותל בוורידים המזנטריאליים של מודל עכבר המוזרק תוך צפקית עם lipopolysaccharide.

מיקרוסקופ תוך חיוני לניתוח אינטראקציות תאי דם-אנדותל במודל עכבר דלקתי

שכבת פני שטח glycocalyx / אנדותל האנדותל היא למד באופן אידיאלי באמצעות מיקרוסקופ intravital. מיקרוסקופיה Intravital טכני מאתגרת באיבר מרגש כגון ריאות. אנחנו מדגימים איך brightfield סימולטני ומיקרוסקופיה ניאון ניתן להשתמש כדי להעריך את עובי שכבת פני שטח האנדותל שבנע...

במדידת vivo של שכבת פני שטח האנדותל ריאתי המאוסה

כאן אנו מדווחים טכניקה ניסויית של מיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי לדמיין אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים. טכנולוגיה מיקרוסקופית זה תהיה יקרה כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של מחלת כלי דם ולבדוק סוכנים תרופתיים בתנאי pathophysiological.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

אנו מתארים בדיקת פקק מטריג'ל כדי להמחיש את הפוטנציאל האנגיוגני של מאגר של גורמים המופרשים על ידי תאים סרטניים באמצעות שתי שיטות הדמיה משלימות, אולטרסאונד ואנדומיקרוסקופיה. המטריגל, ג'ל מחקה מטריצה חוץ-תאית (ECM), משמש להחדרת גורמים אנגיוגניים למארח (עכבר) המופרשים למדיה המותנית (C.M).

פונקציונליות ניטור ומורפולוגיה של כלי דם גויס על ידי גורמים מופרשים על ידי תאים מניבי גידול בצמיחה מהיר

כדי לחקור את האינטראקציה של חיידקים עם כלי הדם תחת לחץ גזירה, מתוארים תא זרימה ומודל מיקרוסקופיה תוך-חיונית מזנטרית in vivo המאפשרים לנתח את גורמי החיידקים והמארח התורמים להידבקות כלי הדם.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

יישום פשוט זה של מיקרוסקופיה תוך-חיונית של ורידי מזנטריה בעכברים יכול לשמש במודלים שונים של דלקת כדי לצפות באינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וטסיות-לויקוציטים.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

מתנות פרוטוקול זה חרוז הרומן במבחנה assay זה יותר כראוי מודלים מתהליך ויוו הלבלוב אנגיוגנזה על-ידי שילוב pericytes. שינוי זה מאפשר וזמינותו חרוז רוצה להתרכז יותר בנאמנות באינטראקציה תאית heterotypic בין תאי אנדותל ותאים ציור קיר זה הם קריטיים עבור אנגיוגנזה.

שילוב Pericytes חרוז תא אנדותל הלבלוב Assay

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

השיטה המוצגת כאן יכולה להעריך את ההשפעה של ריאגנטים על אנגיוגנזה או חדירות כלי הדם in vivo ללא כתמים. השיטה משתמשת בהזרקת דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב כדי לדמיין ניאו-כלי דם או דליפת כלי דם.

שונה בבדיקת תקע ג'ל מטריצת Vivo למחקרי אנגיוגנזה

חקור אינטראקציות אנדותל-פריציט אנושיות בחי בעכבר באמצעות מבחן plug מטריקס ג'ל. שיטה זו מאפשרת זיהוי מסלולי מעבר אותות ביצירת כלי דם וגנים הקשורים להפרעות כלי דם.

In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג'ל עכבר

גלה סרטונים נוספים