In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג'ל עכבר

המטרה הכוללת של בדיקת ג'ל המטריקס in-vivo זו היא לבחון את האינטראקציה של תאי אנדותל עם טפילים. בדיקת המטריג'ל (matrigel) זו נועדה לסייע לחוקרים ללמוד את השלבים העיקריים באנדרוגנזה. היא תאפשר גם את זיהוי נתיבי השסונוי האחראים לשלבים מרכזיים ביצירת כלי דם, וכן גנים ששיבוש בתפקודם עלול להוביל להפרעות וסקולריות ולהשתבשויות אחרות באנדרוגנזה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לחקור את היווצרות כלי הדם in-vivo, תוך מעורבות של תאי אנדותל ותאי התמיכה שלהם, הפריציטים. לתחילת העבודה, גדלו תרביות של תאי אנדותל ותאי פריציטים אנושיים בצלחות של 100 מילימטר עם 10 מיליליטר מהמדיה המתאימה. החליפו את המדיה מדי יומיים עד שלושה ימים עד שהתאים יגיעו ל-80% confluency.

על מנת להכין את תמיסת ה-matrix gel לערבוב עם התאים, יש להפשיר מלאי של matrix gel למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. לאחר מכן, יש להכין אליקוטות של 1.5 mL לאחסון ארוך טווח בטמפרטורה של 20°C-, או בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים. כל פלאג (plug) ניסויי ידרוש 200 µL של matrix gel.

לפיכך, מבחנה אחת של מלאי יכולה לספק שישה פלאגים עם עודף של 25%. הכינו כל אליקווט נדרש לשימוש על ידי הוספת 15 µl של מלאי 100x של beta-FGF שהופשר. ערבבו את ה-beta-FGF בתמיסה באמצעות פיפטור, ולאחר מכן הדגירו על קרח למשך 30 דקות לפחות לפני הוספת התאים.

בשלב זה, קררו מספר מזרקי אינסולין של 1cc בכיסוי 28-gauge לצורך ההזרקות. כדי לאסוף את התאים מלוחיות התרבית, הסירו את המצע ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS. לאחר הסרת ה-PBS, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת trypsin והחזירו את הלוחיות לאינקובטור למשך דקה אחת.

לאחר מכן, העבירו בפיפט שני מיליליטר של מצע גידול על הצלחות כדי להפריד את התאים ואספו את המצע לשפופרת של 15 מיליליטר. כעת, בדקו את ריכוז הדגימות שנאספו באמצעות המוציטומטר (hemocytometer). לאחר מכן, הכינו מנות (aliquots) של תאים בשפופרות של 15 מיליליטר.

עבור קבוצת הניסוי נעשה שימוש בשילוב של מיליון תאי אנדותל ו-200,000 טפילים. לאחר מכן, סבבו את מנות התאים בצנטריפוגה ב-400g למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו את הנפח המחושב של matrix gel למשקע התאים, וערבבו באמצעות פיפוט עדין כדי למנוע היווצרות קצף, שכן לא ניתן להזריק בועות אוויר.

כעת יש לשמור את התכשירי ההכנה על קרח עד שהעכברים יהיו מוכנים להזרקה. לאחר הרדמת עכבר באמצעות isoflurane, ואישור מצב ההרדמה באמצעות צביטה בכף הרגל, חברו את העכבר למערכת ללא נשימה חוזרת המספקת isoflurane והניחו אותו על פד חימום, כאשר הצד הבטני פונה כלפי מטה. כעת הסירו שערה משטח של כסנטימטר רבוע משני האזורים האחוריים הצדיים.

לאחר מכן, נקה את העור החשוף באמצעות 70% alcohol. בשלב הבא, טען מיליליטר אחד של תמיסת התאים שהוכנה לתוך מזרק מקורר, כמות המספיקה לארבעה פלאגים. כדי לבצע הזרקה, הרם את העור הגבי אל מול השטח התת-עורי.

לאחר מכן, הזרק באיטיות ובאופן שווה 200 microliters לחלל התת-עורי מאחורי כלוב הצלעות, והוצא את המחט באיטיות כדי למנוע דליפה. לאחר ההזרקה, תיווצר בליטה באתר ההזרקה. נקה את האתר באלכוהול, ולאחר מכן סמן את גבולות הבליטה באמצעות טוש קבוע כדי שניתן יהיה לאתר אותה מאוחר יותר.

לאחר מכן, חזרו על הליך ההזרקה בצדו השני של העכבר. הקפידו להזריק את כל התאים בתוך שלוש דקות, אחרת הם יתחילו להידבק למזרק. שלב ההזרקה הוא קריטי לביצוע מדויק כדי להבטיח שפקק ג'ל המטריקס ייווצר בין שכבות העור והשריר, כך שהפקק ישמור על צורה טובה ולא יהפוך למפוזר.

לפני השריץ של העכבר הבא, השאירו את העכבר המוזרק על משטח החימום למשך דקה כדי לאפשר למטריצה להתגבש. לאחר ההמתה, מקמו את העכבר על שולחן הניתוח. לאחר הסרת שיער שצמח מחדש מאזור ההזרקה, אתרו את קווי הסימון המזהים את מיקום הפלאג (plug).

לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים עדינים, בצעו חתך לאורך הגבול המסומן של הפלאג (plug), בניצב לעור ועד לשריר שמתחתיו. גזרו בזהירות מסביב להיקף הגבול המסומן. לאחר מכן הוציאו את הפלאג, תוך שמירתו כשכבה דחוסה בין שכבות העור והשריר.

שטפו מיד את הפקק בביקר קטן המכיל PBS כדי להסיר את הדם. לאחר מכן, העבירו את הפקק כולו לשפופרת של 50 milliliter עם 25 milliliters של 4% paraformaldehyde. השאירו את הדגימה לקיבוע בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות ללא ערבוב.

למחרת, העבירו את הפקקים ל-25 milliliters של 70% ethanol למשך 24 שעות. לאחר מכן, המשיכו בטמיעה בפרפין. חתכים של פקקים המכילים תאי אנדותל בלבד מראים שחלק מהכלי הדם אינם מקבלים פרפוזיה של דם המאכסן לאחר 14 ימים in-vivo.

בניגוד לכך, פלאגים המכילים הן תאי אנדותל והן טפילים, מראים כלי דם רבים המקבלים דם (perfused) לאחר 14 ימים in-vivo. פלאגים אלו מכילים תאים החיוביים לצביעת smooth muscle actin, הנראים באדום, בסמיכות מיידית לתאי אנדותל החיוביים ל-CD31, הנראים בירוק. לפיכך, ייתכן שלטפילים תפקיד משמעותי בהיווצרותם של כלי דם ראשוניים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליישם טכניקה עוצמתית זו in-vivo כדי לחקור יצירת כלי דם בשימוש בסוגי תאים מרובים. טכניקה זו תסלול את הדרך עבור חוקרים לבחון נושאים שונים של ביולוגיה וסקולרית במודלים של עכברים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע גם שיטות אחרות, כגון quantitative PCR ו-Western immunoblotting, כדי לענות על שאלות נוספות כגון שינויים בביטוי גנים ובפרוטאומיקה.

טכניקה עוצמתית זו תאפשר לחוקר ללמוד in-vivo כיצד תאי אנדותל וטפילים מקיימים אינטראקציה במהלך היווצרות כלי דם, המהווה שלב מפתח באנדרוגנזה. טכניקה עוצמתית זו תאפשר לחוקר ללמוד גם אינטראקציות אחרות בין תאים הרלוונטיות להבנת מחלות וסקולריות, כגון יתר לחץ דם ריאתי, בין היתר.