ראפיד רכישת תמונות 3D באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית episcopic

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לרכוש במהירות תמונות דיגיטליות תלת מימדיות ברזולוציה גבוהה של דגימות ביולוגיות באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית באמצעות הדמיה ודינמיקה של תכונות מורפולוגיות מורכבות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא משתמשת בציוד מעבדה סטנדרטי ודורשת ניסיון קודם מינימלי.

מי שידגים את ההליך יהיה ג'ונגאנג הואנג, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לאחר דיסקציה וקיבוע של העובר כמתואר בפרוטוקול הטקסט, החלף את הקיבוע בתמיסת ניקוי, וסובב בעדינות את הדגימה על נדנדה בטמפרטורת החדר למשך שבוע עד שבועיים. בתום הדגירה מעבירים את הדגימה ל-10% פורמלין ומשאירים על הנדנדה למשך יומיים נוספים.

ביום השלישי יש לשטוף את הדגימה ב-PBS לשלוש שטיפות של חמש דקות. לאחר מכן ייבשו את הדגימות בסדרת אתנול עולה בטמפרטורת החדר, על נדנדה עדינה למשך שעתיים לכל ריכוז. לאחר התייבשות אתנול של 100%, העבירו את הדגימה לתמיסת צביעה למשך שעה, מוגנת מפני אור.

לאחר מכן, החלף את התמיסה בתמיסת מכתים טרייה לתיוג לילה של הדגימה. למחרת בבוקר, טבלו את הדגימה בתערובת נפח אחד לנפח של תמיסות חדירה וצביעה טריות שהוכנו למשך שלוש שעות לפחות על נדנדה בארבע מעלות צלזיוס. בתום הדגירה מעבירים את העובר לתמיסת הסתננות לדגירה נדנדה נוספת של שלוש שעות.

לאחר מכן החלף את הסופרנטנט בתמיסת הסתננות טרייה למשך שלושה ימים נוספים של נדנוד בארבע מעלות צלזיוס. ביום הרביעי, כוונו את העובר בתבנית הטבעה והניחו את התבנית על קרח. מערבבים את תמיסה B עם תמיסת ההסתננות ולאחר מכן טובלים בעדינות את התבנית בתמיסת הטבעה קרה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר כשלוש שעות, השתמש בקצה כדי לאשר שהתמיסה התמצקה, ודחף את הדגימה החוצה מהתבנית. חתוך כל חומר הטבעה עודף, ולאחר מכן כוון מחדש את גוש הדגימה בתבנית חדשה בכיוון צולב. לאחר מכן, הנח את כל ההתקנה על קרח במכסה אדים.

הוסף בעדינות תמיסת הטבעה לתבנית החדשה עד שהתבנית שקועה. לאחר מכן, הניחו מחזיק בלוקים על גבי התבנית. לאחר שלוש עד ארבע שעות, קלפו את תבנית ההטבעה והניחו את הבלוק מתחת למיקרוסקופ סטריאו עם תאורה אלכסונית כדי לקבוע את מיקום הדגימה בתוך הבלוק.

על פני הבלוק, סמן קווי רשת סביב הדגימה והשתמש בקווים כמדריכים לחיתוך כל חומר הטבעה עודף. כדי לדמות את הדגימה, תחילה מהדקים את הבלוק למיקרוטום, ומקבלים חתך משטח טרי של הדגימה. לאחר מכן הרכיב מיקרוסקופ זום סטריאו אופקית מול פני הבלוק של הדגימה, והפעל את המיקרוסקופ ואת המחשב הנלווה.

לאחר מכן, הפעל את תוכנת רכישת התמונות והשתמש במצב תצוגה חיה בתוכנת הדמיה כדי למקד את האופטיקה בפני הבלוק. יישר את המיקרוסקופ והמיקרוטום לפי הצורך, כך שפני הבלוק יהיו במרכז העינית. אחד השלבים הקריטיים ביותר בהליך זה הוא רכישת תמונות במיקום הבית הקבוע של המיקרוטום.

כוונן את הזום כדי לוודא שכל פני הבלוק נמצאים בתוך העינית. לאחר מכן בחר את מסנן החלבון הפלואורסצנטי הירוק. המשך לחתוך מראש את הבלוק עד להופעת רקמת הדגימה, ולמקד מחדש את התמונה לפי הצורך.

לאחר מדידה והגדרת זמן החשיפה באופן ידני, רכוש ושמור תמונות של פני הבלוק לאחר כל חיתוך טרי, ורשום את הפרמטרים החשובים לרכישת תמונה. בסיום הפעלת ההדמיה, יצא והמר את כל קובצי התמונה לפורמט JPEG, והשתמש בתוכנת עיבוד התמונה המתאימה כדי להפוך את כל התמונות המקוריות, תוך התאמת הבהירות והניגודיות של התמונות לפי הצורך. העלה את כל התמונות המעובדות לתוכנת הדמיה תלת מימדית, בהתאם להוראות.

יישרו את כל התמונות במצב אוטומטי והציגו את התוצאות התלת-ממדיות והדו-ממדיות. בתמונה מייצגת זו של מבט על פני השטח של יום עוברי 15.5 עובר עכבר מוכן ומצולם כפי שהודגם זה עתה. ניתן להבחין בתכונות המורפולוגיות המפורטות של העור, כולל רפידות השפם וזקיקי השיער המתפתחים.

חשוב לציין, הרזולוציה של תצוגת החתך הווירטואלי של דגימה עוברית של יום 15.5 שצולמה בשיטה זו דומה לקטע היסטולוגי סטנדרטי. לאחר שליטה ניתן להשלים את כל ההליך לאחר הטיפול המקדים בתמיסת הפינוי תוך שבוע אחד, אם הוא מבוצע כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תמיסת הצביעה מוגנת מפני אור בארבע מעלות במהלך שלב החדירה וההטמעה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו צביעת אבנית, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי דפוסי התפלגות ספציפיים של סוגי תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להשתמש בציוד מעבדה כדי לרכוש תמונות תלת מימד ברזולוציה גבוהה של דגימות ביולוגיות לצורך הניתוח המורפומטרי שלהן. אל תשכח שעבודה עם תמיסת קיבוע, מכתים וחדירה עלולה להיות מסוכנת ביותר, וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הפעלה במכסה אדים ולבישת כפפות בעת ביצוע הליך זה.