מדידת הקשיחות של Ex Vivo עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר את ההליכים לשימוש במיקרוסקופ כוח אטומי למדידת המודול האלסטי Ex Vivo של אבי העורקים של העכבר. שיטה זו עוזרת לענות על שאלות מפתח בתחום הביומכניקה של כלי הדם ומחלות כגון מחלות לב וכלי דם והזדקנות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא התכונות הביומכניות המאופיינות ב-AFM של דגימות ביולוגיות רכות כגון עורקים ותאים ברמת דיוק רבה ברמות Danoscale.

אני אציג את נהלי ה-AFM, וד"ר שו-לין ליו, חוקר עמית מהמעבדה שלנו, יראה כיצד לבודד אבי העורקים של עכברים. כדי להתחיל, המתת חסד של עכבר ונתח אותו עד אבי העורקים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. בעזרת זוג מלקחיים קטנים, תפסו את השומן המקיף את אבי העורקים והשתמשו במספריים קטנים כדי לחתוך בזהירות את השומן שנמצא סביב אבי העורקים.

לאחר מכן, תפסו בעדינות את אבי העורקים בעזרת מלקחיים ובצעו חתך אחד דרך הכלי בתחילת אבי העורקים העולה וחתך נוסף בסוף אבי העורקים היורד, ממש מעל אבי העורקים הבטני. העבירו את אבי העורקים המנותח לכלי בגודל 60 מילימטר המכיל PBS ללא סידן או מגנזיום. בצלחת, המשיכו לנתח את כל רקמת השומן שנותרה מאבי העורקים ולאחר מכן פתחו את אבי העורקים לאורך.

לאחר מכן, חתכו חתיכה בגודל 2 מילימטר על 4 מילימטר מאבי העורקים היורד, וחתיכה בגודל זהה מקשת אבי העורקים, לניתוח באמצעות מיקרוסקופ הכוח האטומי. הניחו את חתיכות הטישו הללו בכלי פלסטיק טרי של 60 מילימטר, ושמרו עליהן לחות בטיפת PBS. הסר בזהירות את ה-PBS מסביב לרקמה באמצעות מגבון מעבדה מבלי לגעת באבי העורקים.

ודא שהצד הלומינלי של הרקמה פונה כלפי מעלה, והשתמש בחמישה עד 10 מיקרוליטרים של דבק ציאנואקרילט כדי להדביק בעדינות כל קצה של אבי העורקים הפתוח לצלחת. זה קריטי שאבי העורקים לא יימתח במהלך תהליך זה. בסיום, בדוק שאבי העורקים המודבק אינו מקופל או צף.

לאחר ייבוש הדבק באוויר על אבי העורקים למשך 30 עד 60 שניות, הוסיפו בעדינות PBS וטבלו את הדגימה. בעזרת פינצטה, החלק בדיקת AFM סיליקון חנקתי עם קצה כדורי על מחזיק הבדיקה. לאחר מכן, אבטח היטב את מחזיק הבדיקה לתושבת ZScanner של ראש ה-AFM.

לאחר מכן, פתח את תוכנת AFM. בחר את סוג הניסוי על ידי מעבר לקטגוריית הניסוי ובחירה במצב איש קשר. לאחר מכן, עבור אל קבוצת ניסויים ובחר מצב מגע ב-Fluid, ולבסוף עבור אל ניסוי ובחר מצב מגע ב-Fluid.

לאחר בחירת אלה, לחץ על טען ניסוי. זה יפעיל את הלייזר. לאחר מכן הכינו דגימה המשמשת ליישור הלייזר כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

הנח את הדגימה על ה-AFM. מקם את נקודת הלייזר על קצה בדיקת ה-AFM, על ידי כוונון כפתורי מיקום הלייזר. לאחר מכן, השתמש בכפתורי מיקום הגלאי כדי לכוונן את מיקום דיודת הצילום עד שהערכים עבור הסטייה האנכית יהיו בין אפס לשלילי וולט אחד, והסטייה האופקית קרובה לאפס וולט.

לאחר מכן, בדוק שאות סכום הלייזר מקסימלי. במידת הצורך, כוונן מחדש את מיקום קרן הלייזר בקצה ה-AFM, ואת מיקום דיודת הצילום, כדי לקבל את אות הסכום המקסימלי. כדי להתחיל בכיול, בחר בדוק פרמטרים והגדר את הפרמטר עבור גודל סריקה לאפס.

הגדר את קצב הסריקה להרץ אחד. הגדר את הדגימה/קו ל-256, ואת נקודת ההגדרה של הסטייה ל-20 ננומטר. לאחר מכן בחר מעורבות.

לאחר שהגשושית יוצרת מגע עם פני הצלחת, לחץ על רמפה. לאחר מכן, בחר מצב מורחב בתפריט סרגל הכלים של הסריקה, והגדר את הפרמטרים כפי שמוצג כאן. בסרגל הכלים של הרמפה, בחר רציף שיפוע וקבל עקומת כוח על הצלחת.

בעקומת כוח זו, הגדר את ערוץ 1 לשגיאת סטייה על מנת לאפשר לתוכנה לשרטט את התוצאות כסטייה אנכית לעומת מיקום Z. לחץ בקצה השמאלי או הימני בעקומת הכוח וגרור את הסמן כדי להקיף אזור ליניארי של עקומת הכוח שיתאים לקו הישר. לאחר מכן, בחר רמפה בסרגל הכלים ולחץ על עדכן רגישות.

רשום את הערך הנוכחי. לאחר מכן, בחר כיול ולחץ על גלאי. קלט וערך ממוצע מחמש המדידות בתיבה רגישות סטיה.

לחץ על נסיגה פעמיים עד שלוש, כדי להרים את ראש ה-AFM ולמנוע אינטראקציה בין קצה ה-AFM לצלחת במהלך תהליך הכוונון התרמי. לאחר מכן, לחץ על כוונון תרמי בסרגל הכלים. הגדר את טווח הכוונון התרמי בין 1 ל-100 קילו-הרץ, והגדר את תיקון רגישות הסטייה ל-1.144 עבור שלוחים בצורת V, ו-1.166 עבור שלוחותיה מלבניות.

בתפריט כוונון תרמי, לחץ על רכוש נתונים כדי לקבל עקומת כוונון תרמי. לאחר מכן, מקם מקף אדום לקווים משני צידי העקומה, ובחר את דגם המתנד ההרמוני הפשוט או את לורנציאן בהתאם למתאים יותר לנתונים. לאחר מכן, לחץ על התאם נתונים ובחר חשב את אביב K כדי לשמור ערך זה.

הנח צלחת תרבית של 60 מילימטר המכילה את רקמת אבי העורקים על במת המיקרוסקופ, ואבטח את הצלחת עם מחזיק הצלחת המגנטית. לאחר שאבי העורקים מחובר לשלוחה יש לוודא שמרכז הפיזו יציב ולחץ על רמפה. הגדר את גודל הרמפה לשלושה מיקרומטרים, את מצב ההדק ליחסי ואת סף ההדק ל-100 ננומטר.

לאחר מכן בחר רמפה רציפה. שימו לב שנקודת המגע בין הגשושית לדגימה מתרחשת בערך במרכז לשלושת הרבעים התחתונים של מחזור רמפת Z. אם זה לא נצפה, התנתק מהדגימה, התאם את גודל הרמפה לפי הצורך והפעל מחדש את הדגימה.

לאחר מכן, לחץ על מיקרוסקופ בשורת התפריטים ובחר Engage Settings. שנה/י את משיכת ה-SPM ל-30 מיקרומטר ולחץ/י על ״אישור״. לאחר התבוננות בעקומת הכוח, לחץ על לכידה בשורת התפריטים ובחר לכידת שם קובץ. הזן שם קובץ רצוי המסתיים ב-OOO, בחר תיקייה ייעודית ושמור את הנתונים.

כדי להתחיל בניתוח, פתח את תוכנת ניתוח עקומת הכוח, טען את הקובץ שיש לנתח ושנה והחלק את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, בחר תיקון בסיסי בשורת התפריטים, והגדר את הכניסות כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, התאם את הקו הכחול המקווקו האנכי בגרף כדי להקיף את החלק השטוח של עקומת הכוח ולחץ על ביצוע.

לאחר מכן, לחץ על הזחה בתפריט סרגל הכלים, והגדר את הכניסות כפי שמוצג כאן. שמרו את הערכים הללו, ונתחו את מודול יאנג של כל אחד מאזורי העניין על ידי מדידת חמש עקומות כוח לכל אזור שנלקחות במרחק קטן זו מזו. כדי לקבוע את הנוקשות הכוללת של דגימת הרקמה, יש לבצע עד 25 מדידות על פני חמישה אזורים שונים של אזור הדגימה בתוך הרקמה.

ניתן להשתמש באזורים אלה להשוואת רקמות במקומות שונים, כגון קשת אבי העורקים ואבי העורקים היורד. בגרפים אלה, עקומות כוח מייצגות של אבי העורקים היורד וקשת אבי העורקים מוצגות מאותה דגימה של אבי העורקים של העכבר. על סמך נתונים אלה, ניתן לחשב את המודול האלסטי עבור כל קבוצה, ולהשתמש בו להשוואה בין אזורים או תנאים שונים.

לאחר צפייה בסרטון זה תהיה לך הבנה טובה כיצד לבודד כראוי את אבי העורקים של העכבר ולמדוד את המודול האלסטי על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. לאחר ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את מדידת ה-AFM מיד לאחר בידוד הרקמות. לאחר השליטה, ניתן להשלים את בידוד אבי העורקים תוך כ-45 דקות לכל עכבר, וניתן להשלים את מדידת וניתוח ה-AFM תוך שעה וחצי, אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות אימונופלורסנציה או התפשטות על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לשיפוץ כלי הדם או התפשטות תאי שריר חלק בכלי הדם.