חזותי בשלבים המוקדמים של Phagocytosis

מטרת העל של טכניקה זו היא לנטר את השלבים השונים של פגוציטוזיס באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציות בין פתוגנים. בעיקר כדי להבין כיצד פתוגנים נכנסים לתאי המארח במהלך הזיהום.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה ומאפשרת לנו לקבל מידע על תא הנגיף של האירועים שלנו המתרחשים במהלך פגוציטוזיס בצורה רגישה לזמן. כדי להתחיל, הכן את הזימוזאן המצומד פלואורסצנטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. יום קודם לכן, זרעו בערך חמש פעמים 10 לתאי DC 2.4 הרביעיים בשקופית תא, כך שהבארות יהיו 60 עד 70% מתכנסות בזמן הניסוי.

לאחר שהתאים נמצאים בצפיפות מתאימה, הנח את שקופית התא על 10 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. קירור התאים הכרחי כדי לחסום אנדוציטוזיס כמו גם מתי להחליף ציטוזיס. ובהמשך לקבל פגוציטוזיס מסונכרן.

לאחר מכן, הסר בעדינות את המדיום מכל באר באמצעות פיפטה או שואב. לאחר מכן, מערבבים את הזימוזאן המצומד פלואורסצנטי עם מדיום תרבית תאים בריבוי של זיהום של 10. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום לכל תא היטב כדי להבטיח שכל התא מכוסה.

לאחר מכן סובב את מגלשת התא כדי להגדיל את המגעים בין החלקיקים בתאים ולסנכרן את תהליך ההדבקה. לאחר צנטריפוגה, העבירו את מגלשת התא לאינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5 אחוז CO2. לאחר חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, הסר את מגלשת החדר מהחממה ושאף את המדיום.

לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח. לאחר הכביסה הסופית, בדוק אם יש חלקיקים לא קשורים במיקרוסקופ אור ובצע שטיפות נוספות במידת הצורך. חיוני להסיר חלקיקים לא קשורים מהבארות כדי למזער רעשי רקע במהלך הניתוח.

לאחר מכן, תקן את התאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של ארבעה אחוז פרפורמלדהיד ב-PBS לבארות, ודגירה שלהם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר תיקון התאים, יש לשטוף אותם על ידי הוספת 500 מיקרוליטר PBS לכל תא ואז לשאוב בעדינות את התמיסה. חזור על שלב הכביסה פעמיים נוספות.

לאחר סבב הכביסה השלישי, עצרו את התגובה על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של אמוניום כלוריד 50 מילי-מולרי ב-PBS לתאים ודגירתם למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים ב -500 מיקרוליטר PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חדירה לתאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר מקשר לכל באר ודגירה של התאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

השלב הבא הוא צביעה עבור F-actin על ידי הוספת פלואידין מצומד פלואורסצנטי לתאים ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר PBS. לבסוף, צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ונתח את התמונות באמצעות ImageJ.

על מנת למדוד את ספיגת הזימוזן, הכינו שקופיות תא עם תאים כפי שמוצג בבדיקת הקשירה. לאחר שלבי הקירור והתווית, העבירו את מגלשת התא לחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזי CO2. ודגירה על התאים לנקודות זמן שונות.

תקן את התאים לאחר 30, 60 ו-90 דקות לאחר ההדבקה. הקפד לייעל את נקודות הזמן הללו על סמך סוג התא המתאים וחלקיקי הפלואורסצנט שבהם נעשה שימוש. לאחר מכן, נתח תמונות באמצעות ImageJ.

קליטה מוצלחת מאופיינת בהפנמה מלאה של חלקיק בתוך הציטופלזמה של פגוציט. כדי להתחיל, הכינו תא סביבתי שלב מיקרוסקופ על ידי חימום ל-37 מעלות צלזיוס ואיזון התא עם 5 אחוז CO2. המתן 30 עד 45 דקות עד שהטמפרטורה וה-CO2 יתייצבו לפני ההדמיה.

ראיית ה-CO2 ורמות הטמפרטורה הן קריטיות לפגוציטוזיס, שכן חשוב להפעיל את תנור המיקרוסקופ לפני הניסוי כדי לאזן את הסביבה של אותו תא. לאחר מכן, הכינו שקופיות תא עם תאי DC 2.4 המייצבים את mCherry F-actin כפי שמוצג בבדיקת הכריכה. לאחר שלבי התיוג והתיוג, העבירו את מגלשת התא מהצנטריפוגה ישירות לשלב מיקרוסקופ מחומם מראש.

לבסוף, בצע הדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה, לא רק כדי ללכוד את התנועה והדינמיקה של רשת F-actin, אלא גם כדי לדמיין את האירועים הפגוציטים השונים בתוך התאים החיים. התאים שמוצגים כאן בירוק הם תא DC 2.4 מסוג פרא שנדבק ב-BFP קנדי שמוצג באדום. הדמיית Timelapse משמשת להמחשת השלבים המוקדמים של פגוציטוזיס ומוצגת כאן במרווחים של 30 שניות.

המיקומים המסומנים בכוכבית הם המקום שבו מתרחש שיפוץ אקטין. התהליך כולו מתרחש תוך מספר דקות. כאן הוערך תפקידם של ספינגוליפידים על תפקידם בשלבים המוקדמים של פגוציטוזיס.

באמצעות טכניקה זו, נמצא כי ספינגוליפידים חיוניים לקשירת קנדידה אלביקנס לתאים והפחיתו את הפגוציטוזיס הכללי. הפחתה זו של הקישור הפגוציטוטי הוכחה גם עבור קשירת תאי DC 2.4 לזימוזנים. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הדמיה חיה כדי לחקור את השלב המוקדם של פגוציטוזיס.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה עד שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע פגוציטוזיס של פתוגנים אחרים, כולל חיידקים וטפילים, על מנת להבין את הקשר המורכב בין תאי החיסון לפתוגנים אלה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא, לחקור אנדוציטוזיס מתווך קולטנים כולל פגוציטוזיס ומקרופינוציטוזיס בתאי חיסון.