Name: הכנה In vivo השתמש של Probe פעילות מבוססת עבור N -acylethanolamine חומצה Amidase (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: למד את סינתזת הפרוב ARN14686 לזיהוי צורת NAAA הפעילה במיצי תאים ובחתכי רקמה. שיטה זו מספקת מידע אמין על מצב ההפעלה של האנזים בנוגדנים מסורתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למרכז ההדמיה של ניקון במכון האיטלקי לטכנולוגיה, ג'נובה, איטליה (NIC@IIT).

<ol><li>Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+analysis+by+mass+spectrometry+and+sequence+database+searching%3A+tools+for+cancer+research+in+the+post-genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era.</a> Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).</li>
<li>Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+yeast+proteome+by+multidimensional+protein+identification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology.</a> Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).</li>
<li>Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proteomics.</a> Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+the+two-hybrid+system+in+exploration+of+the+yeast+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).</li>
<li>Evans, M. J., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+profiling+of+enzyme+families%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based profiling of enzyme families.</a> Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).</li>
<li>Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling%3A+from+enzyme+chemistry+to+proteomic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry.</a> Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Meldal, M., Tornoe, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cu-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition.</a> Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).</li>
<li>Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling+in+vivo+using+a+copper%28i%29-catalyzed+azide-alkyne+%5B3+%2B+2%5D+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).</li>
<li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li>
<li>Kohn, M., Breinbauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Staudinger+ligation-a+gift+to+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The Staudinger ligation-a gift to chemical biology.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).</li>
<li>Romeo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Based+Probe+for+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase.</a> ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).</li>
<li>Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+an+acid+amidase+selective+for+N-palmitoylethanolamine%2C+a+putative+endogenous+anti-inflammatory+substance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance.</a> J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).</li>
<li>Tsuboi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%2C+a+novel+member+of+the+choloylglycine+hydrolase+family+with+structural+and+functional+similarity+to+acid+ceramidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase.</a> J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).</li>
<li>Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase+%28NAAA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biodivers%22%5BJournal%5D)">The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA).</a> Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).</li>
<li>Ribeiro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potent+Systemically+Active+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase+Inhibitor+that+Suppresses+Inflammation+and+Human+Macrophage+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation.</a> ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).</li>
<li>Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+activation+and+glycosylation+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%2C+a+lysosomal+enzyme+involved+in+the+endocannabinoid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism.</a> Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+crucial+in+pH+regulation+and+proteolytic+activation+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).</li>
<li>West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+of+human+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase.</a> J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).</li>
<li>Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+discovery+of+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors.</a> Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).</li>
<li>Sasso, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinociceptive+effects+of+the+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitor+ARN077+in+rodent+pain+models%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models.</a> Pain. 154, 350-360 (2013).</li>
<li>Duranti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-%282-oxo-3-oxetanyl%29carbamic+acid+esters+as+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitors%3A+synthesis+and+structure-activity+and+structure-property+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships.</a> J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).</li>
<li>Ponzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+structure-activity+relationship+%28SAR%29+of+2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic+acid+esters%2C+a+class+of+potent+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors.</a> J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).</li>
<li>Solorzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+structure-activity+relationships+of+N-%282-oxo-3-oxetanyl%29amides+as+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors.</a> J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).</li>
<li>Vitale, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+structure-activity%2C+and+structure-stability+relationships+of+2-substituted-N-%284-oxo-3-oxetanyl%29+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem+9%22%5BJournal%5D)">Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors.</a> ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).</li>
<li>Fiasella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Aminoazetidin-2-one+derivatives+as+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors+suitable+for+systemic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem+9%22%5BJournal%5D)">3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration.</a> ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).</li>
<li>Armirotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Lactones+Inhibit+N-acylethanolamine+Acid+Amidase+by+S-Acylation+of+the+Catalytic+N-Terminal+Cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine.</a> ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).</li>
<li>Nuzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+alpha-amino-beta-lactam+carbamic+acid+ester+as+NAAA+inhibitors.+Synthesis+and+structure-activity+relationship+%28SAR%29+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies.</a> Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).</li>
<li>Bonezzi, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Important+Role+for+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase+in+the+Complete+Freund%27s+Adjuvant+Rat+Model+of+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis.</a> J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Speers, A. E., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Based+Protein+Profiling+%28ABPP%29+and+Click+Chemistry+%28CC%29-ABPP+by+MudPIT+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry.</a> Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).</li>
<li>Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+biotinylated+proteins+on+streptavidin+resin%3A+a+protocol+for+quantitative+elution%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution.</a> Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (264), (2007).</li>
<li>Giuffrida, A., Piomelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+dilution+GC%2FMS+determination+of+anandamide+and+other+fatty+acylethanolamides+in+rat+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma.</a> FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).</li>
<li>Buczynski, M. W., Parsons, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+brain+endocannabinoid+levels%3A+methods%2C+interpretations+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls.</a> Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פעילות האנזים מוסדר דק ברמות שונות, כולל שעתוק RNA, סינתזת החלבון, טרנסלוקציה חלבון, שינוי שלאחר translational, ואינטראקציה בין חלבונים. לעתים קרובות, ביטוי האנזים אינו לבד חשבון עבור פעילותה. ABPP פותח כדי לחקור את פעילותם של חלבונים במצב הטבעי שלהם. שתי תכונות נדרשות: בדיקה כימית שקושרה קוולנטית אל האתר הפעיל של אנזים עניין ותג כתב כדי לזהות את האנזים שכותרתו בדיקה. עיצוב וסינתזה Probe הם נקודות קריטיות של ההלי...

בשימוש נפוץ שיטות לחקור את דפוסי הביטוי, אינטראקציות, ופונקציות של חלבונים, כולל פלטפורמות ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזליות לניתוח רובה 1,2, שמרים שיטות שני היברידיות 3,4, ו ב מבחני חוץ גופייה, מוגבלות שהם לא ניתן להעריך את הפעילות של חלבונים במצב הטבעי שלהם. פרופיל חלבון מבוססי פעילות (ABPP) שניתן להשתמש בהם כדי למלא את הפער. לפי גישה זו, מולקולות קטנות בוחנות מסוגלות מחייב קוולנטית אל האתר הפעיל של אנזים אינטרסים מצומדות לקבוצת כתב המאפשרת איתור היעד. באמצעות כימיה לחץ (CC), הכתב ניתן לשלב את החללית או יכול להיות מוצג לאחר אירוסי היעד התרחשו 5,6. ההליך האחרון מחייב שימוש בדיקות המכילות קבוצות כימיות מתאימות, כגון אלקין או תזיד מסוף, אשר יכול להיות שונה עם מספר ריאגנטים כתב דרך תגובות ביו-מאונך such כמו Cu (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cycloaddition 7-9 או Staudinger קשירת 10,11. לאחרונה, אנו חשפנו את ARN14686 המתחם כמו ABP הראשון עבור במבחנת איתור vivo של hydrolase ציסטאין, 12 NAAA. NAAA מזרז את שחרור משרות והידרוליזה של FAES רווי בלתי רווי, כולל oleoylethanolamide (OEA) ו palmitoylethanolamide (PEA), שהן אגוניסטים אנדוגני של רצפטור גרעיני אנטי דלקתיות PPAR-alpha 13-15. NAAA מתבטא בעיקר מקרופאגים ותאי מונוציטים הנגזרות אחרים, כמו גם ב-לימפוציטים 14,16, דבר המצביע על תפקיד בוויסות התגובה החיסונית המולדת. האנזים הוא מסונתז reticulum endoplasmic המחוספס בצורה פעילה מופעל בתאים החומצית של התא על ידי מנגנון autoproteolytic 17. מחשוף autoproteolytic יוצר ציסטאין חדש N -terminal (C131 בעכברים וחולדות, C126 בבני אדם), כי הוא אחראי נוקלאופיל עבור FAE הידרוליזה 18,19. עיכוב תרופתי פעילות NAAA משנה את איזון FAE סינתזה / שפלה לטובת רמות תאיים מרובות יותר של 16,20,21 FAES. כמה נגזרים β-lactone ו β-לקטם הוכחו לעכב פעילות NAAA עם עוצמה גבוהה סלקטיביות 16,22-26. מעכבים אלה פועלים באמצעות S -acylation של ציסטאין קטליטי 16,27,28. ARN14686 המתחם תוכנן בהתבסס על המבנה הכימי של פעיל מערכתית, נגזר-סרין β-לקטם NAAA מעכב, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] carbamate) 16. קבוצת 4-בוטיל-cyclohexyl של ARN726 הוחלפה שרשרת אליפטיות רווי C9 נושאות תג אלקין מסוף נטיית CC הבאה עם תג עיתונאי יזיד נושאות. בחרנו לעצב ABP שני שלבים כדי minimally לשנות את מבנה הפיגום המקורי, ובכך שמירה על הזיקה של החללית עבור NAAA. יתר על כן, הימנעות כניסתה של תגים מגושמים, בדיקה כזו יכולה להיות מתאימה יותר לטיפול in vivo מאשר ABP ישיר. ARN14686 מעכב NAAA עם עוצמה גבוהה (hNAAA IC 50 = ננומטר 6, rNAAA IC 50 = 13 ננומטר) על ידי יצירת adduct קוולנטיים עם ציסטאין הקטליטית של האנזים 12. ניסויים בחולדות חיים הראו כי החללית היא סלקטיבית לכידה NAAA לידי ביטוי ריאות. חומצה ceramidase, אחר ציסטאין amidase שחולקת זהות 33-34% עם NAAA, זוהה גם כמטרה בעלת זיקה נמוכה בעת שימוש בריכוזים גבוהים בדיקה (10 מיקרומטר במבחנה, 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל תוך ורידי, iv) 12. יש לנו גם השתמשתי ARN14686 ללמוד בנוכחות NAAA הפעיל ברקמות עכברוש מודלקות לאחר נטילה של אדג&#39;ובנט של שלמה פרוינד (CFA) 29. כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור preparatiעל של ARN14686 (איור 1) ויישומה לחקירת ההפעלה NAAA vivo לשעבר. כדוגמה, אנו מתארים הליך הניסוי לדמיין NAAA בכפות עכברוש לאחר מתן CFA. בניסוי זה, חלבונים המחולצים רקמות כפה לאחר ההזרקה iv של החללית, ואת proteome שכותרתו ABP הוא נתון סמ&quot;ק עם-אזיד ביוטין. דגימות Biotinylated מועשרות באמצעות חרוזי streptavidin, וכתמי חלבון מבוצעים. ביישום אחר, אנו מתארים את הלוקליזציה של NAAA הפעיל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתוך ריאות עכבר מעכברים שטופל חללית. במקרה זה, הרקמה מחולקת וחתכים חשופים CC עבור בנוסף rhodamine. ערכת עבודה מתוארת באיור 2.

<table><tbody><tr><td>1,1'-sulfonyldiimidazole&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td>מזיק</td></tr><tr><td>2-dipyridylcarbonate</td><td>Fluorochem</td><td>11331</td><td>מזיק</td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>דליק, רעיל, מסוכן לסביבה המימית</td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino) pyridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td> רעילה <td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>דליק, קורוזיבי</td></tr><tr><td>אצטוניטריל&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td> פחם פעיל <td>דליק, רעיל</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td> אזיד <td></td></tr> מזיק-PEG3-ביוטין <tr><td></td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>BCA ערכת בדיקת חלבון</td><td>Thermo פישר סיינטיפיק</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>עמודות ביו-ספין</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>חוצץ חוסם</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M6250</td> אלבומין <td>סרום בווין רעיל ביותר</td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>סכנה בריאותית</td></tr><tr><td>Ceric אמוניום חנקתי&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>מחמצן,</td></tr><tr><td>כלורל הידרט</td> מזיק <td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>ציקלוהקסדיאן</td> רעיל <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>125415</td><td>דליק, סכנה בריאותית</td></tr><tr><td>ציקלוהקסאן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>34855</td><td>דליק, מזיק, סכנה בריאותית, סכנה סביבתית</td></tr><tr><td>דיכלורומתאן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>34856</td><td>מזיק, סכנה בריאותית</td></tr><tr><td>דיאתיל אתר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>296082</td><td>דליק, </td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד מזיק (DMSO)</td><td>Acros Organics</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד d6 (DMSO-d6)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>דליק,</td></tr><tr><td>מזיק אתיל אצטט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>דליק, </td></tr><tr><td>גליצרול</td> מזיק <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>אירדיי 680-LT סטרפטווידין</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT סטרפטווידין&nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>צנטריפוגה קצרה לפני השימוש לזירוז קומפלקסים של חלבונים</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>34860</td><td>דליק, רעיל, סכנה בריאותית</td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime; -ethylcarbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>מזיק, קורוזיבי</td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>דליק, קורוזיבי, רעיל</td></tr><tr><td>N,N-דימתילפורממיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>227056</td><td>דליק, מזיק, מסוכן לבריאות</td></tr><tr><td>N-CBZ-L-סרין</td><td>פלואורוכם</td><td>M03053</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה קונפוקלית מזיקה Nikon A1</td><td>Nikon</td><td></td><td>קרא את המדריך למשתמש</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>פלדיום על פחמן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>330108</td><td></td></tr><tr><td>p-anisidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>רעיל, סכנה בריאותית, סכנה</td></tr> <tr><td>סביבתיתParaformaldehyde</td><td>sigma Aldrich</td><td>441244</td><td>רעיל, מזיק לדרכי הנשימה, קורוזיבי, ניתן לדילוף</td></tr><tr><td>פולי (אתילן גליקול)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong זהב תושבת נגד דהייה עם DAPI&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>P36931</td><td>הימנע מהיווצרות בועות</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td> נתרן <td>הידריד רעיל, קורוזיבי, ניתן לזיקה</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td><td></td></tr><tr><td>נתרן גופרתי</td> דליק <td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000 סורק אימאג</td>' <td>FUJIFILM</td><td></td><td>קרא&nbsp; המדריך למשתמש</td></tr><tr><td>Streptavidin agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>טרט-בוטנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>360538</td><td></td></tr><tr><td>טטרהידרופוראן</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' רעיל, דליק <td>186562</td><td>דליק, מזיק, סכנה בריאותית</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>רעיל, חם ב-50 מעלות; C להמסת</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 הומוגנייזר רקמות בסיסי</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Undec-10-yn-1-ol</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td>אוריאה מזיקה</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>U5378</td><td>רעיל, חם ב-50 מעלות; C להתמוסס</td></tr></tbody></table>

הכנה<em&gt; in vivo</em&gt; השתמש של probe פעילות מבוססת עבור<em&gt; n</em&gt; -acylethanolamine חומצה amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

פרופיל חלבון מבוסס פעילות (ABPP) הוא שיטה לזיהוי של אנזים של עניין proteome מורכב באמצעות בדיקה כימית שמכוונת את האתר הפעיל של האנזים. תג כתב הציג לתוך החללית מאפשר זיהוי של האנזים שכותרתו ידי סריקת קרינה-ג&#39;ל, כתם חלבון, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, או ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית. כאן, אנו מתארים את ההכנה ושימוש של ARN14686 המתחם, כימיה לחץ פעילות מבוססת בדיקה (CC-ABP) באופן סלקטיבי מזהה אנזים N -acylethanolamine חומצת amidase (NAAA). NAAA הוא hydrolase ציסטאין שמקדם דלקת ידי השבתת peroxisome אנדוגני קולטן proliferator המופעל (PPAR) אגוניסטים -alpha כגון palmitoylethanolamide (PEA) ו oleoylethanolamide (OEA). NAAA הוא מסונתז כקובץ proenzyme באורך מלא פעיל, אשר מופעל על ידי autoproteolysis ב- pH חומצי של ליזוזום. מחקרי לוקליזציה hותעיף הראה כי NAAA מתבטא בעיקר מקרופאגים ותאי מונוציטים נגזרות אחרים, וכן לימפוציטים מסוג B. אנו מספקים דוגמאות כיצד ניתן להשתמש ARN14686 כדי לזהות ולכמת פעיל NAAA vivo לשעבר ברקמות מכרסמים על ידי כתם חלבון מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ARN14686 תוכנן בהתבסס על הפיגום של ARN726 מעכב NAAA. קבוצת 4-בוטיל-cyclohexyl של ARN726 הוחלפה עם שרשרת אליפטיות רווי C9 נושאות תג אלקין מסוף (איור 1). תג אלקין הוצג על מנת לאפשר את השימוש של הליך תיוג שני שלבים להוסיף fluorophore או מולקולה ביוטין באמצעות CC. תכונה זו מבצעת רינדור ARN14686 כלי תכליתי מאוד לחקור NAAA במבחנה in vivo. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:ri...

כאן, אנו מתארים את ההכנה והשימוש תחקיר מבוססי פעילות (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] carbamate) המאפשר איתור וכימות של צורה פעילה של amidase החומצה המעודד דלקת אנזים N -acylethanolamine (NAAA), הוא במבחנת vivo לשעבר.

הכנה<em&gt; In vivo</em&gt; השתמש של Probe פעילות מבוססת עבור<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine חומצה Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים את הסינתזה של גשש המבוסס על פעילות, ARN 14686, הספציפי ל-N-acylethanolamine acid amidase, או NAAA, ולתאר את השימוש בו לזיהוי האנזים הפעיל קטלית בתמריתי תאים ובחתכי רקמה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות לגבי התפקוד של NAAA in vivo, תוך מתן תובנות על הפעלת NAAA במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים, כגון מחלות דלקתיות ומחלות ניווניות של מערכת העצבים. יתרונה המרכזי הוא שפעולה פשוטה מבוצעת לאחר תגובת ה-NAAA עם הגשש, ובכך מתקבל מידע מהימן על מצב ההפעלה של האנזים in vivo.יתרון נוסף הוא שבניגוד לנוגדנים ספציפיים, הגשוש שלנו מזהה רק את הצורה הפעילה של האנזים, דבר המועיל לבדיקת סטטוס במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן היא משלבת מומחיותים שונות אשר יחד בונות סיפור שלם, החל מהסינתזה הנכונה ועד ליישומים הסופיים שלה. בבקבוק בעגול תחתון בנפח 50 milliliter, המיסו 350 milligrams של undecynenol ושלושה נקודה חמישה milliliters של dichloromethane יבש.לאחר מכן, הוסיפו 25 milligrams של DMAP ו-530 milligrams של DPC לתמיסה זו. ערבבו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות. לאחר 16 שעות, הוסיפו 20 milliliters של dichloromethane לתמיסה.העבירו את התערובת למשפך הפרדה. הוסיפו 15 milliliters של מים. נערו את התערובת והמתינו עד להפרדה של שני השלבים.בשלב הבא פתחו את הברז, אספו את הפאזה האורגנית שבתחתית, סגרו את הברז והעבירו את הפאזה האורגנית בחזרה למשפך. הוסיפו לתערובת 15 milliliters של תמיסת סודיום ביקרבונט רוויה. נערערו את משפך ההפרדה והמתינו להפרדת שתי הפאזות.לאחר ייבוש השכבה האורגנית עם נתרן סולפט, סננו אותה דרך כדור צמר לתוך בקבוק תחתית עגולה בעל צוואר רחב. לאחר מכן, אידו את השכבה האורגנית עד ליובש תחת לחץ מופחת באמצעות אידור סיבובי. שקלו את הבקבוק וקבלו 600 milligrams של שמן, המהווה תערובת של two pyridyl undecynyl carbonate ו-undecynol two oxypyridine carboxylate ביחס של 1.7 ל-1.בתוך בקבוקון עגול בתחתיתו בנפח 10 מיליליטר, המיסו 60 מיליגרם של oxo asetydenol ammonium asetate בשני מיליליטר של dichloromethane יבש. קררו את התמיסה ל-0 °C באמבט קרח ולאחר מכן הוסיפו 81 µL של diazapropalethylamine בטפטוף. לאחר מכן, המיסו 350 מיליגרם של התערובת הגולמית המכילה undecynol two oxypyridine carboxylate בשני מיליליטר של dichloromethane יבש.הוסיפו את התערובת המומסת לתמיסה וערבבו בטמפרטורת החדר למשך 15 שעות. לאחר מכן, אידו את הממס עד ליובש תחת לחץ מופחת באמצעות אידור סיבובי (rotary evaporator). טהרו את התרכובת באמצעות כרומטוגרפיית עמודה של סיליקה ג'ל תוך שימוש במכשיר אוטומטי לכרומטוגרפיית עמודות.ראשית, ספחו את הדגימה על סיליקה ג'ל. לאחר שיווי משקל של העמודה עם cyclohexene, טענו את הדגימה לתוך המחסנית. אלוטו את הדגימה באמצעות ethyl acetate ב-cyclohexane בריכוזים של 0 עד 100, תוך איסוף הפסגות למבחנות.אידפו את הממס של הפראקציות המתאימות לתרכובת עד ליובש בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי (rotary evaporator) כדי לקבל 40 milligrams של מוצק לבן. לאחר ניקוי מקדמי של הדגימה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוסיפו 11.3 µL של תמיסת סטוק בריכוז 5 mM של azide polyethylene glyco biotin וערבלו במכשיר vortex. לאחר מכן, הוסיפו לדגימה 11.3 µL של תמיסת סטוק בריכוז 50 mM של TCEP שהוכנה טרי, וערבלו במכשיר vortex.לאחר ערבוב מוקדם של 34 µL של תמיסת עבודה שהוכנה טרי של 1.7 mM TBTA עם 11.3 µL של תמיסת מלאי של 50 mM נחושת גסולפט (copper sulfate), הוסף 45.3 mL של תמיסה זו לדגימה וערבב במכשיר vortex. השתמש במכלים מסומנים. דגור את התגובה בטמפרטורה של 25 °C למשך שעתיים לפחות.לאחר דגירה של שעה אחת, יש לבחון את שקיעת החלבון ולערבב את התגובה. יש לצנטריפוג את הדגימה למשך ארבע דקות ב-6,500 ×g בטמפרטורה של 4°C. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), יש להוסיף 750 µL של מתנול קר ולשעבד את המשקע באמצעות סוניקציה עם סוניקטור עם פרוב למשך חמש שניות.לאחר מכן, סנטריפוגו את הדגימה למשך ארבע דקות ב-6,500 ×g בטמפרטורה של 4°C. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) בעזרת מזרק ומחט. לאחר שטיפה נוספת פעמיים במתנול קר, הוסיפו למשקע החלבון 325 µL של SDS בריכוז 2.5% ב-PBS.בצע סוניקציה לדגימה שלוש פעמים למשך חמש שניות. לאחר מכן, חמם את הדגימה למשך חמש דקות ב-65 °C. לאחר הסוניקציה, סבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-6,500 ×g בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, העבירו את העילאי לנבובת נקייה בנפח 15 מיליליטר והוסיפו לעילאי 1.4 מיליליטר של PBS כדי לדלל את ריכוז ה-SDS ל-0.5%. להעשרה באמצעות סטרפטאווידין (streptavidin), הגבירו תחילה את נפח הדגימה ל-4.2 מיליליטר באמצעות PBS. לאחר מכן, הוסיפו 40 מיקרוליטר של תרחף (slurry) בריכוז של 50% של agarose-streptavidin שנשטף מראש, באמצעות טיפ קצוץ.דגרו את התערובת במשך שעתיים בטמפרטורת החדר תוך סיבוב. לאחר סנטריפיגציה למשך שתי דקות ב-1,400 ×g, הסירו את העל-נוזל (supernatant) מבלי לייבש את משקע החרו지를. השתמשו בעל-נוזל שנותר כדי להעביר את החרוזים לעמודת ספין (spin column) של 1 mL, ושטפו את העמודה בכבידה עם 1 mL של 1% SDS ב-PBS.המשיכו לשטוף את החרו지를 ב-urea בריכוז six molar ולאחר מכן ב-PBS כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, השתמשו ב-500 µL של PBS כדי להעביר את החרוזים השטופים לשפופרת של 1.5 mL. לאחר סרגיבציה של הדגימה למשך שתי דקות ב-1,400 ×g, שאבו בעדינות את העלייה (supernatant) באמצעות מזרק ומחט.כדי לאלואציה של החלבונים הקשורים לשרף, הוסף 25 µL של בופר אלואציה למשקע השרף והדגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן למשך 15 דקות ב-95 °C. הוסף כ-400 µL של תערובת click chemistry לפרוסות רקמה שהוכנו בהתאם לפרוטוקול הכתוב. שים לב שהנפח הנבחר של תערובת ה-click chemistry מספיק כדי לכסות את הפרוסות.לאחר מכן, הדגרירו את פרוסות הרקמה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך הגנה מאור. לאחר ההדגירה, שטפו את הדגימות עם PBS למשך חמש דקות ולאחר מכן עם מתנול קר למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו את פרוסות הרקמה שלוש פעמים עם תמיסה של 1% Tween 20 ו-0.5 mM EDTA ב-PBS למשך שתי דקות.לבסוף, שטפו את הפרוסות פעם נוספת ב-PBS למשך חמש דקות. לאחר ייבוש באוויר, הוסיפו טיפה של חומר הרכבה למניעת דהייה (antifade mountant) עם DAPI. סגרו את הדגימות באמצעות כיסויי זכוכית ואטמו באמצעות לכה.לצורך סינתזה של גשושית, undecynenol מופעל על ידי dipyridyl carbonate בנוכחות של dimethyl aminyl pyridine קטליטי כדי להפיק קרבונט מעורב, אשר מגיב לאחר מכן עם aminyl lactam. ה-beta lactam, או ראש הגשושית, מגיב עם האתר הפעיל של NAAA, בעוד שהאלקין הקצבי יכול לעבור פונקציונליזציה עם תג דיווח באמצעות click chemistry. ARN 14686 שימש לזיהוי הפעלת NAAA בתמציות תאים של כפות רגליים דלקתיות של חולדה באמצעות protein block. בחולדות נאיביות, לא מזוהה אות NAAA.לעומת זאת, בחולדות שטופלו ב-complete Freunds Adjuvant נצפתה פס בולט המתאים ל-NAAA פעיל. יישום נוסף של ARN 14 six eight six הוא דימוי רקמות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כאן, תאים בצבע אדום מייצגים מקרופאגים אלבולריים החיוביים ל-NAAA פעיל.NAAA ממוקמת במבנים וסיקולריים מפוזרים כפי שניתן להבחין בהגדלה גבוהה יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לסנתז ולהשתמש ב-ARN 14 six eight six כדי לזהות NAAA פעילה ברקמות, הן באמצעות protein blot והן באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בנוסף, למרות שפרוטוקול זה ספציפי למטרה שלנו, ניתן להתאים בקלות את יישומי הגשושית שתיארנו עבור גששנים מבוססי-פעילות שונים הספציפיים למטרות אחרות מלבד NAAA.

preparation-vivo-use-an-activity-based-probe-for-n-acylethanolamine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול לזהות trichothecenes (mycotoxins של דאגה לבריאות האדם) בשיטת ההקרנה החדשה שפותחה על בסיס שיטת immunochemical תחרותי זיהוי סופי אלקטרוכימיים מודגם.

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

פרוטוקול זה מתאר את הכנת המצע tRNA סינתטי...

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

שיטה להגדרה של פעילות קינאז אצטט מתואר. Assay זה מנצל תגובה ישירה לקביעת פעילות האנזים ועל קינטיקה של קינאז אצטט בכיוון אצטט יוצרי עם acceptors phosphoryl שונים. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מנוצל עבור assaying פוספט אצטיל אחרים או אצטיל-CoA אנזימים ניצול.

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

סרטון זה מדגים מדידה חוץ גופית של פעילות אנזימים עבור α-גלקטוזידאז A וחומצה α-גלוקוזידאז בדגימות באמצעות מצעים סינתטיים 4-Methylumbelliferyl.

מדידה חוץ גופית של פעילות האנזים α-גלקטוזידאז A וחומצה α-גלוקוזידאז

בנוסף ההפיך של Palmitate לחלבונים הוא רגולטור חשוב של סחר בחלבונים תאי. זו היא עניין מיוחד בתאי עצב שבו חלבונים סינפטיים רבים palmitoylated. אנו משתמשים בשיטה ביוכימית פשוטה לזהות חלבונים בתאי עצב בתרבית palmitoylated, שניתן להתאים למספר רבים של סוגי תאים ורקמות.

איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-Exchange ביוטין (אייב)

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

הדו"ח הנוכחי מתאר בדיקה אנזימטית במבחנה למדידת פעילות פוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראז באמצעות תמציות תאי לישמניה. בדיקה זו מבוססת על העברה של קבוצת מתיל רדיואקטיבית מ-S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine על פוספטידיל-אתנולמין אנדוגני.

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

עבודה זו מציגה שיטה לסריקת תפוקה גבוהה באמצעות מערכת סינון אנזימים גנטית אוניברסלית שניתן ליישם באופן תיאורטי על למעלה מ-200 אנזימים. כאן, מערכת הסינון היחידה מזהה שלושה אנזימים שונים (ליפאז, צלולאז ופוספטאז אלקליין) פשוט על ידי שינוי הסובסטרט המשמש (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ופניל פוספט).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

יש דרישה לעשות ניסויים פרה-קליניים של בדיקות עבור מחלקה הרומן של תרופות היתום"בשם מלווים תרופתי לשחזור, מהיר ויעיל. פיתחנו assay המבוסס על תרבות של תאים פשוטים מאוד מתוקננת, תכליתי למסך המטופלים זכאים, כמו גם רומן המלווה תרופתי סמים.

במבחנה אנזים המדידה לנקודת מבחן תגובתיות המלווה תרופתי פאברי, מחלת הפומפה

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתית (SBEM) מוחלת על תמונה ולנתח קוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס המורין.

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פרצוף בלוק (SBEM) לחקר קוצים דנדריטים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים של הטמעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים, תוך התמקדות בחקר מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים ברשתית.

חקירת מעגלי רשתית ולוקליזציה מולקולרית על ידי הטבעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים

למד את סינתזת הפרוב ARN14686 לזיהוי צורת NAAA הפעילה במיצי תאים ובחתכי רקמה. שיטה זו מספקת מידע אמין על מצב ההפעלה של האנזים בנוגדנים מסורתיים.

הכנה

גלה סרטונים נוספים