הכנה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים את הסינתזה של גשש המבוסס על פעילות, ARN 14686, הספציפי ל-N-acylethanolamine acid amidase, או NAAA, ולתאר את השימוש בו לזיהוי האנזים הפעיל קטלית בתמריתי תאים ובחתכי רקמה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות לגבי התפקוד של NAAA in vivo, תוך מתן תובנות על הפעלת NAAA במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים, כגון מחלות דלקתיות ומחלות ניווניות של מערכת העצבים. יתרונה המרכזי הוא שפעולה פשוטה מבוצעת לאחר תגובת ה-NAAA עם הגשש, ובכך מתקבל מידע מהימן על מצב ההפעלה של האנזים in vivo.

יתרון נוסף הוא שבניגוד לנוגדנים ספציפיים, הגשוש שלנו מזהה רק את הצורה הפעילה של האנזים, דבר המועיל לבדיקת סטטוס במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן היא משלבת מומחיותים שונות אשר יחד בונות סיפור שלם, החל מהסינתזה הנכונה ועד ליישומים הסופיים שלה. בבקבוק בעגול תחתון בנפח 50 milliliter, המיסו 350 milligrams של undecynenol ושלושה נקודה חמישה milliliters של dichloromethane יבש.

לאחר מכן, הוסיפו 25 milligrams של DMAP ו-530 milligrams של DPC לתמיסה זו. ערבבו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות. לאחר 16 שעות, הוסיפו 20 milliliters של dichloromethane לתמיסה.

העבירו את התערובת למשפך הפרדה. הוסיפו 15 milliliters של מים. נערו את התערובת והמתינו עד להפרדה של שני השלבים.

בשלב הבא פתחו את הברז, אספו את הפאזה האורגנית שבתחתית, סגרו את הברז והעבירו את הפאזה האורגנית בחזרה למשפך. הוסיפו לתערובת 15 milliliters של תמיסת סודיום ביקרבונט רוויה. נערערו את משפך ההפרדה והמתינו להפרדת שתי הפאזות.

לאחר ייבוש השכבה האורגנית עם נתרן סולפט, סננו אותה דרך כדור צמר לתוך בקבוק תחתית עגולה בעל צוואר רחב. לאחר מכן, אידו את השכבה האורגנית עד ליובש תחת לחץ מופחת באמצעות אידור סיבובי. שקלו את הבקבוק וקבלו 600 milligrams של שמן, המהווה תערובת של two pyridyl undecynyl carbonate ו-undecynol two oxypyridine carboxylate ביחס של 1.7 ל-1.

בתוך בקבוקון עגול בתחתיתו בנפח 10 מיליליטר, המיסו 60 מיליגרם של oxo asetydenol ammonium asetate בשני מיליליטר של dichloromethane יבש. קררו את התמיסה ל-0 °C באמבט קרח ולאחר מכן הוסיפו 81 µL של diazapropalethylamine בטפטוף. לאחר מכן, המיסו 350 מיליגרם של התערובת הגולמית המכילה undecynol two oxypyridine carboxylate בשני מיליליטר של dichloromethane יבש.

הוסיפו את התערובת המומסת לתמיסה וערבבו בטמפרטורת החדר למשך 15 שעות. לאחר מכן, אידו את הממס עד ליובש תחת לחץ מופחת באמצעות אידור סיבובי (rotary evaporator). טהרו את התרכובת באמצעות כרומטוגרפיית עמודה של סיליקה ג'ל תוך שימוש במכשיר אוטומטי לכרומטוגרפיית עמודות.

ראשית, ספחו את הדגימה על סיליקה ג'ל. לאחר שיווי משקל של העמודה עם cyclohexene, טענו את הדגימה לתוך המחסנית. אלוטו את הדגימה באמצעות ethyl acetate ב-cyclohexane בריכוזים של 0 עד 100, תוך איסוף הפסגות למבחנות.

אידפו את הממס של הפראקציות המתאימות לתרכובת עד ליובש בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי (rotary evaporator) כדי לקבל 40 milligrams של מוצק לבן. לאחר ניקוי מקדמי של הדגימה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוסיפו 11.3 µL של תמיסת סטוק בריכוז 5 mM של azide polyethylene glyco biotin וערבלו במכשיר vortex. לאחר מכן, הוסיפו לדגימה 11.3 µL של תמיסת סטוק בריכוז 50 mM של TCEP שהוכנה טרי, וערבלו במכשיר vortex.

לאחר ערבוב מוקדם של 34 µL של תמיסת עבודה שהוכנה טרי של 1.7 mM TBTA עם 11.3 µL של תמיסת מלאי של 50 mM נחושת גסולפט (copper sulfate), הוסף 45.3 mL של תמיסה זו לדגימה וערבב במכשיר vortex. השתמש במכלים מסומנים. דגור את התגובה בטמפרטורה של 25 °C למשך שעתיים לפחות.

לאחר דגירה של שעה אחת, יש לבחון את שקיעת החלבון ולערבב את התגובה. יש לצנטריפוג את הדגימה למשך ארבע דקות ב-6,500 ×g בטמפרטורה של 4°C. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), יש להוסיף 750 µL של מתנול קר ולשעבד את המשקע באמצעות סוניקציה עם סוניקטור עם פרוב למשך חמש שניות.

לאחר מכן, סנטריפוגו את הדגימה למשך ארבע דקות ב-6,500 ×g בטמפרטורה של 4°C. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) בעזרת מזרק ומחט. לאחר שטיפה נוספת פעמיים במתנול קר, הוסיפו למשקע החלבון 325 µL של SDS בריכוז 2.5% ב-PBS.

בצע סוניקציה לדגימה שלוש פעמים למשך חמש שניות. לאחר מכן, חמם את הדגימה למשך חמש דקות ב-65 °C. לאחר הסוניקציה, סבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-6,500 ×g בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, העבירו את העילאי לנבובת נקייה בנפח 15 מיליליטר והוסיפו לעילאי 1.4 מיליליטר של PBS כדי לדלל את ריכוז ה-SDS ל-0.5%. להעשרה באמצעות סטרפטאווידין (streptavidin), הגבירו תחילה את נפח הדגימה ל-4.2 מיליליטר באמצעות PBS. לאחר מכן, הוסיפו 40 מיקרוליטר של תרחף (slurry) בריכוז של 50% של agarose-streptavidin שנשטף מראש, באמצעות טיפ קצוץ.

דגרו את התערובת במשך שעתיים בטמפרטורת החדר תוך סיבוב. לאחר סנטריפיגציה למשך שתי דקות ב-1,400 ×g, הסירו את העל-נוזל (supernatant) מבלי לייבש את משקע החרו지를. השתמשו בעל-נוזל שנותר כדי להעביר את החרוזים לעמודת ספין (spin column) של 1 mL, ושטפו את העמודה בכבידה עם 1 mL של 1% SDS ב-PBS.

המשיכו לשטוף את החרו지를 ב-urea בריכוז six molar ולאחר מכן ב-PBS כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, השתמשו ב-500 µL של PBS כדי להעביר את החרוזים השטופים לשפופרת של 1.5 mL. לאחר סרגיבציה של הדגימה למשך שתי דקות ב-1,400 ×g, שאבו בעדינות את העלייה (supernatant) באמצעות מזרק ומחט.

כדי לאלואציה של החלבונים הקשורים לשרף, הוסף 25 µL של בופר אלואציה למשקע השרף והדגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן למשך 15 דקות ב-95 °C. הוסף כ-400 µL של תערובת click chemistry לפרוסות רקמה שהוכנו בהתאם לפרוטוקול הכתוב. שים לב שהנפח הנבחר של תערובת ה-click chemistry מספיק כדי לכסות את הפרוסות.

לאחר מכן, הדגרירו את פרוסות הרקמה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך הגנה מאור. לאחר ההדגירה, שטפו את הדגימות עם PBS למשך חמש דקות ולאחר מכן עם מתנול קר למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו את פרוסות הרקמה שלוש פעמים עם תמיסה של 1% Tween 20 ו-0.5 mM EDTA ב-PBS למשך שתי דקות.

לבסוף, שטפו את הפרוסות פעם נוספת ב-PBS למשך חמש דקות. לאחר ייבוש באוויר, הוסיפו טיפה של חומר הרכבה למניעת דהייה (antifade mountant) עם DAPI. סגרו את הדגימות באמצעות כיסויי זכוכית ואטמו באמצעות לכה.

לצורך סינתזה של גשושית, undecynenol מופעל על ידי dipyridyl carbonate בנוכחות של dimethyl aminyl pyridine קטליטי כדי להפיק קרבונט מעורב, אשר מגיב לאחר מכן עם aminyl lactam. ה-beta lactam, או ראש הגשושית, מגיב עם האתר הפעיל של NAAA, בעוד שהאלקין הקצבי יכול לעבור פונקציונליזציה עם תג דיווח באמצעות click chemistry. ARN 14686 שימש לזיהוי הפעלת NAAA בתמציות תאים של כפות רגליים דלקתיות של חולדה באמצעות protein block. בחולדות נאיביות, לא מזוהה אות NAAA.

לעומת זאת, בחולדות שטופלו ב-complete Freunds Adjuvant נצפתה פס בולט המתאים ל-NAAA פעיל. יישום נוסף של ARN 14 six eight six הוא דימוי רקמות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כאן, תאים בצבע אדום מייצגים מקרופאגים אלבולריים החיוביים ל-NAAA פעיל.

NAAA ממוקמת במבנים וסיקולריים מפוזרים כפי שניתן להבחין בהגדלה גבוהה יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לסנתז ולהשתמש ב-ARN 14 six eight six כדי לזהות NAAA פעילה ברקמות, הן באמצעות protein blot והן באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בנוסף, למרות שפרוטוקול זה ספציפי למטרה שלנו, ניתן להתאים בקלות את יישומי הגשושית שתיארנו עבור גששנים מבוססי-פעילות שונים הספציפיים למטרות אחרות מלבד NAAA.