Name: טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע תסיסנית ביציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למדו הכנת ביציות Drosophila לבדיקה ציטולוגית של הרכבת ספינדל וכיוון כרומוזומים במיוזה. השיטה מאפשרת הדמיה באימונופלואורסצנציה וחושפת מנגנוני דו-קוטביות ותפקוד גנטי בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכריסטיאן להנר על מתן נוגדן CENP-C ולאריק ג'ויס על ההמלצות על FISH. העבודה במעבדת מק'קים מומנה על ידי מענק מה-NIH (GM101955).

<ol><li>Bridges, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-disjunction+as+proof+of+the+chromosome+theory+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity.</a> Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+spindle+assembly+in+Drosophila+females%3A+behavior+of+nonexchange+chromosomes+and+the+effects+of+mutations+in+the+nod+kinesin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein.</a> J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).</li>
<li>Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtubule-destabilizing+kinesin+motor+regulates+spindle+length+and+anchoring+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes.</a> J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86 (1), 135-146 (1996).</li>
<li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li>
<li>Gilliland, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+transiently+sequesters+mps1+and+polo+to+collagenase-sensitive+filaments+in+Drosophila+prometaphase+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes.</a> PLoS One. 4 (10), e7544(2009).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+and+End-On+Kinetochore+Attachments+Are+Coordinated+to+Achieve+Bi-orientation+in+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).</li>
<li>Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleine+2%2C+an+isoform-specific+inhibitor+of+Drosophila+Aurora+B+kinase%2C+provides+insights+into+the+mechanism+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis.</a> ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+gamma-tubulin+in+the+acentriolar+female+meiotic+spindle+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila.</a> EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).</li>
<li>Endow, S. A., Komma, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+dynamics+during+meiosis+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes.</a> J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).</li>
<li>Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthies%2C+HJ+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).</li>
<li>Colombié, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+Incenp+crucial+to+the+assembly+of+the+acentrosomal+metaphase+spindle+in+female+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis.</a> Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

Staging תסיסנית ביציות אם כי karyosome מוארך נראה בדרך כלל ב ביציות prometaphase, באמצעות karyosome צורה להבחין prometaphase מ ביציות metaphase יכול להיות בעייתי. במהלך prometaphase, את karyosome מתחיל כמו צורה עגולה, מתארך, ולאחר מכן חזר בו כדי צורה עגולה כמו הביצית מתקרבת מעצר metaphase. משמעות הדבר היא כי רבים ביציות prometaphase אין לי karyosome מוארך. בנוסף, אם ביציות מוטציה או מטופ...

חקר המיוזה מתואר לפעמים כ"גנטיקה של הגנטיקה". הסיבה לכך היא שהתכונות הבסיסיות של תורשת כרומוזומים ומבחר עצמאי מתבצעות באמצעות הפרדת כרומוזומים במהלך ייצור הגמטות. הדגמה חשובה של תאוריית הכרומוזומים של התורשה הגיעה ב-1916 מעבודתו של קלווין ברידג'ס ב-Drosophila melanogaster1. מחקר זה ומחקרים גנטיים קלאסיים אחרים בדרוזופילה תרמו רבות להבנת הגנטיקה שלנו. בדיקה ציטולוגית של כרומוזומים מיוטיים בביציות דרוזופילה, לעומת זאת, הייתה מאתגרת. הסיבה העיקרית לכך היא שאימונופלואורסצנציה של ביציות דרוזופילה בשלב מאוחר, כאשר הציר מתאסף והכרומוזומים מכוונים להפרדה, נפגעת על ידי נוכחות של ממברנות שהופכות את הביצית לבלתי חדירה לנוגדנים.
למרות אתגר זה, ביציות דרוזופילה נותרו מודל אטרקטיבי לחקר התנהגות הכרומוזומים והרכבת הציר. הסיבה לכך היא הכלים הגנטיים החזקים הזמינים בדרוזופילה, אך גם מכיוון שהביציות נעצרות במטאפאזה I, כאשר הכרומוזומים מכוונים והציר נוצר במלואו. זה מקל על איסוף ובדיקה של מספר רב של ביציות בשלב חשוב זה של חלוקת התאים. בנוסף, אורגניזם מודל פשוט הניתן למניפולציה גנטית לחקר הפרדת כרומוזומי ביציות יכול לספק תרומה חשובה להבנתנו את בריאות הרבייה האנושית. שגיאות במספר הכרומוזומים הן הגורם הגנטי המוביל להפלה ולמומים מולדים בבני אדם2. ניתן לייחס את רוב השגיאות הללו לביצית והן קשורות לעלייה בגיל האם. הגיל הממוצע של אמהות בארה"ב עולה, מה שהופך את זה לדאגה גדולה לבריאות הציבור.
אנו מתארים כאן שיטות לבדיקה ציטולוגית של ביציות דרוזופילה, כולל הדגמה כיצד להסיר את ממברנות הביציות. שיטות אלה הן שינויים של פרוטוקולים שתוארו לראשונה על ידי Theurkauf ו-Hawley3, Zou et al.4, ו-Dernburg et al.5. אנו כוללים גם שיטות להעשרה של שלבים שונים של ביציות, המבוססות על פרוטוקול שתואר לראשונה על ידי Gilliland ואחרים.6. לבסוף, אנו מוסיפים הוראות לטיפול תרופתי בביציות דרוזופילה. יחד, שיטות אלו מאפשרות חקירה ציטולוגית של הפרדת כרומוזומי ביציות והרכבת ציר בדרוזופילה.

<table><tbody><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>שונים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% פורמלדהיד</td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>18505</td><td>מסוכן; לאחר הפתיחה, יש להשליך לאחר חודש</td></tr><tr><td>250 מ"ל כוסות</td><td>שונות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>של 5 מ"ל שמרים</td><td></td> יבשים פעילים שונים <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>מערבבים עם מים ליצירת משחה העקביות של</td></tr><tr><td>נוגדן חמאת בוטנים נגד &אלפא טובולין מצומד לשיבוט FITC</td><td>Sigma</td><td>F2168</td><td>DM1A</td></tr><tr><td>Binucleine 2</td><td>סיגמא</td><td>B1186</td><td>בלנדר מסוכן</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td></td><td></td> שונים סיגמא A4161 <td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>קולכיצין שונים</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>סיגמא</td><td>C-9754</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים</td> מסוכנים <td>VWR</td><td>48366-227</td><td>מס' 1 1/2</td></tr><tr><td></td><td></td> דקסטרן סולפט שונים <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>מגוון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td></td> אתנול מלקחיים <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>שונים</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>5622</td><td>פינצטה דומונט דיוק גבוה בסגנון 5</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>סיגמא</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td></td> בוגרים שונים <td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות</td><td></td><td></td><td></td></tr> שונים <tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td>זמינים ממספר ספקים</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td>מגנזיום כלוריד <td>שונים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>שונים</td> רשתות גדולות שונות <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> (~1,500 & מיקרו;<td></td><td></td></tr><tr><td> m)</td> <td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>מגוון פורמטים וספקים אחרים, 12 או 14</td></tr><tr><td>רשת רשת קטנה (~ 300 ומיקרו; m)</td> <td>מעבדות ספקטרום</td><td>146 424</td><td>מגוון פורמטים, למשל , 146 422 או 146 486</td></tr><tr><td>nutator</td><td></td> פיפטות פסטר שונות <td></td><td></td></tr><tr><td>אשלגן אצטט</td><td></td> שונות חומצה קקודילית שונות <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>C0125</td><td>מסוכן; לחלופין, נתרן קקודילאט עשוי להיות מוחלף</td></tr><tr><td></td><td></td> באשלגן <td></td><td></td></tr><tr><td> הידרוקסיד</td><td></td> נתרן אצטט שונים <td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td></td> נתרן ציטראט שונים <td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>שונים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>שונים</td> טקסול שונים <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> (פקליטקסל) סיגמא T1912 מסוכן <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>פישר</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>פישר</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>שונות</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקות הדמיה prometaphase ו metaphase של המיוזה ואני קבוע<em&gt; תסיסנית</em&gt; ביציות

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

הפרדת כרומוזומים בביציות אנושיות מועדת לטעויות, וכתוצאה מכך אנופלואידיה, שהיא הגורם הגנטי המוביל להפלה ולמומים מולדים. חקר התנהגות הכרומוזומים בביציות מאורגניזמים מודל טומן בחובו הבטחה רבה לחשוף את הבסיס המולקולרי של הרגישות של ביציות אנושיות לאנופלואידיה. Drosophila melanogaster נתון למניפולציה גנטית, עם למעלה מ-100 שנות מחקר, קהילה ופיתוח טכניקות. עם זאת, להמחשת התנהגות הכרומוזומים והרכבת הציר בביציות דרוזופילה יש אתגרים מיוחדים, בעיקר בשל נוכחותם של ממברנות המקיפות את הביצית שאינן חדירות לנוגדנים. אנו מתארים כאן פרוטוקולים לאיסוף, הכנה והדמיה של הרכבת ציר מיוזה I והתנהגות כרומוזומים בביציות דרוזופילה, המאפשרים דיסקציה מולקולרית של הפרדת כרומוזומים באורגניזם מודל חשוב זה.

השיטות שתיארנו כאן תוביל גביית ביציות תסיסנית בשלב מאוחר המייצגים שלושה שלבי המיוזה (איור 1). ביציות ב prophase מאופיינים בנוכחות מעטפת הגרעין, אשר גלוי על ידי חוסר האות טובולין באזור המקיף את karyosome (איור 1 א). Prometaphase היא התקופה לאחר התמוטטות מעטפת גרעין שבמהלכו מרכיב הכישור. במהלך prometaphase, את karyosome לובשת צורה ייחודית, נעשה ארוך מדי לעתים קרובות עם 4 הכרומוזומים ה מלבד המסה ka...

אנו מציגים פרוטוקולים לאיסוף, הכנה והדמיה של ביציות דרוזופילה בוגרות. שיטות אלו מאפשרות הדמיה של התנהגות הכרומוזומים והרכבת הציר ותפקודו במהלך מיוזה.

טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע<em&gt; תסיסנית</em&gt; ביציות

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

המטרה הכוללת של נוהל זה היא להכין אוקיציטים של Drosophila לבחינה ציטולוגית של הרכבת כישוף המטמורס (spindle) ואוריינטציה של כרומוזומים במהלך מיוזה I. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המיוזה, כגון כיצד נקבעת הביפולריות של הכישוף וכיצד כרומוזומים הופכים לדו-מכוונים (bi-oriented) בהיעדר צנטרוזומים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהממברנות של האוקיציט, החוסמות חדירה של נוגדנים, מוסרות ביעילות, מה שמאפשר ביצוע אימונופלורסנציה. לתחילת העבודה, יש לצפות מראש את הפנים של מבחנה בנפח חמישה מילימטרים ופיפטת פסטור ב-PTB כדי למנוע מהאוקיציטים להיצמד למשטחים.הוסיפו 100 milliliters של ROB's buffer לבלנדר, לאחר מכן הוסיפו 100 עד 300 זבובים הרדומים והפעילו את פונקציית הפולס שלוש פעמים למשך שנייה אחת. סננו את התערובת שהתקבלה לכוס כימית של 250-milliliter דרך רשת גסה בעלת נקבים של כ-1,500 micrometers. המתינו כשתי דקות לשקיעת התסנין ולאחר מכן שאבו את השכבה העליונה, תוך הסרת כמה שיותר חלקי גוף גדולים.סננו שוב את תמיסת העיסה לתוך כוס כימית של 250-milliliter, דרך רשת קטנה יותר עם גודל נקבוביות של 300 micrometers. שטפו את הכוס הכימית הראשונה באמצעות באפר נוסף בפיפט המצופה כדי לאסוף את הביציות שנותרו. המתינו שלוש דקות עד שהעיסה תשקע, ולאחר מכן שאבו את כל הנוזל למעט 10 milliliters בתחתית.שפכו כמה שיותר מתוך ה-10 milliliters אל תוך המבחנה המצופה בנפח של חמישה מיליליטר. הניחו לתסביך לשקוע למשך כשתי דקות ולאחר מכן הסירו בזהירות את הנוזל. הוסיפו את יתרת ה-10 milliliters של התסביך והניחו לתערובת לשקוע שוב לפני הסרת הנוזל.שטפו את שאר הביציות מהכלי באמצעות בופר נוסף בפיפטה המצופה. המתינו שהשטיפה תשקע במבחנה של 5 mL למשך שלוש עד חמש דקות. כדי לקבע את השחלות, שאבו תחילה את כל הנוזל מהרקמות והוסיפו מיד 1 mL של Fix Mix.הניחו את הרקמות על נוטטור למשך 2 1/2 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של heptane, ערבלו את המבחנה בוורטקס למשך דקה אחת, ואז המתינו דקה נוספת עד שהאוציטים ישקעו. הסירו את כל הנוזל מהרקמה השקועה, ולאחר מכן הוסיפו 1 mL של 1x PBS.ערבבו את המבחנה במיקסר (Vortex) למשך 30 שניות ולאחר מכן המתינו דקה עד שהאוציטים ישקעו. לאחר מכן, הסירו את כל הנוזל מהמבחנה ומלאו אותה ב-5 milliliters של 1x PBS. באמצעות פיפטה מצופה, העבירו כ-500 עד 1,000 אוציטים לזכוכית נושאת מטופלת (frosted glass slide).הסירה חלקי גוף או חומרים מיותרים באמצעות פינצטה. הנח זכוכית כיסוי מעל הרקמה וגלגל בעדינות את האוציטים עד להסרה של כל הממברנות. גרירת קצה זכוכית הכיסוי מעל האוציטים יעילה לביצוע פעולה זו.יש לבדוק את התקדמות הסרת הממברנה תחת מיקרוסקופ במרווחי זמן קבועים. לחץ רב מדי יהרוס את התאי ביצית (oocytes). הסרת ממברנת התאי ביצית היעילה ביותר מושגת על ידי שילוב של תנועה מקסימלית של התאי ביצית עם לחץ מינימלי.השתמש במגע עדין ובתנועות מהירות כדי לגרור את קצה הזכוכית המכסה מעל התאי ביצה (oocytes). כדי להתחיל את התהליך של השליפה והחסימה, הוסף 15 milliliters של PBS 1%Triton X-100 למבחנה של 50-milliliter. שטוף את התאי ביצה הגלגולים לתוך מבחנה זו ובצע נטציה (nutate) במשך שעה וחצי עד שעתיים.לאחר המתנה של שתי דקות לשקיעת הביציות (oocytes), הסר את הנוזל יחד עם כמה שיותר ממברנות והוסף 50 milliliters של PBS 0.05%Triton X-100. המתן שתי דקות נוספות לשקיעת הביציות, ולאחר מכן הסר את כל הנוזל למעט כ-one milliliter. העבר את הביציות למבחנה מדורגת של 1.5 milliliter והסר את שארית הנוזל.הוסיפו 1 mL של PTB לחסימה (blocking) והעבירו בנסיעה סיבובית (nutate) למשך שעה אחת. הסירו את הנוזל מהביציות (oocytes) ולאחר מכן הוסיפו 300 µL של PTB. לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדן הראשוני הרלוונטי בדילול המתאים, תוך הקפדה להגן על דגימות שטופלו בנוגדן פלואורסצנטי מפני אור.השרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C. שטפו את הביציות ב-1 mL של PTB ארבע פעמים, למשך 15 דקות בכל פעם. הסירו את הנוזל, והוסיפו 200 µL של עליון (supernatant) מהעוברים שעובדו עם נוגדן משני.סננו את סימון ה-300-microliter באמצעות PTB ולאחר מכן בצעו נוטציה (nutation) למשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר. שטפו את התאי ביצה (oocytes) פעם אחת למשך 15 דקות עם one milliliter של PTB. לאחר מכן, הסירו את הנוזל והוסיפו 0.5 microliters של Hoechst 33342 ו-500 microliters של PTB.הגדירו תנועת נסיעה (nutation) למשך שבע דקות. השתמשו ב-1 mL של PTB כדי לשטוף את הביציות פעמיים, למשך 15 דקות בכל פעם. כעת ניתן להכין את הדגימות למשקף ולבצע הדמיה באופן מיידי באמצעות טכניקות סטנדרטיות של מיקרוסקופיה קונפוקלית, או לאחסן אותן ב-PTB בטמפרטורה של 4 °C עד למועד השימוש.כאן מוצגים תמונות של תאי ביצית (oocytes) בשלבים מאוחרים שנוצרו באמצעות הטכניקה שהודגמה, הלוכדות שלושה שלבים שונים של המיוזה. תאי ביצית בפרופאזה נבדלים על ידי נוכחות המעטפת הגרעינית, הנראית לעין בשל היעדר אות טובולין באזורים הסובבים את הקריוזום (karyosome). נצפתה גם ההתארכות המאפיינת של הקריוזום בפרומטפאזה, ואת הכרומוזומים הרביעיים ניתן לראות בנפרד ממסת הקריוזום.גם שלב המטפאזה תועד, וניתן לראות את הקריוסומה נסוגה לצורה עגולה. כאן, צביעה אימונוהיסטוכימית עם נוגדנים שונים מדגישה את כישסורי המבנה (spindle), את הצנטרומרים ואת הכישסור המרכזי בביציות שקובעו בפורמאלדהיד והפטאן. ביציות שטופלו בתרופה Colchicine הראו פנוטיפים לא סטנדרטיים עם השמדה של רוב המיקרוטובוליים הלא-קינטיים, מה שהוביל למצב שבו כל המיקרוטובוליים יוצרים מגע עם ה-DNA בצנטרומר המסומן כ-Phocyde.טיפול ב-Paclitaxel הוביל להיווצרות של תאי ביצית עם כמות מוגברת של מיקרוטובולים בציטופלזמה. לבסוף, תאי ביצית שטופלו ב-Binucleine 2 לעכוב את Aurora B kinase, הראו אובדן מלא של מיקרוטובולי הפסולה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לא להאיץ את קצב העבודה במהלך הסרת ממברנת תא הביצית, שכן הצלחת הפרוטוקול תלויה בשלב זה.בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה, מכיוון שהסרת הממברנות דורשת סבלנות ותרגול. לכן, הדרך הטובה ביותר ללמוד טכניקה זו היא על ידי צפייה במישהו המבצע אותה בהצלחה. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע את גלגול האוציטות תוך 5 עד 10 דקות.אך ניתן להמתין עד 30 דקות מבלי להשפיע על איכות התוצאות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת אווציטים של Drosophila בשלבים מאוחרים לצורך דימוי של הרכבת כישור ביוטי, ארגון הכישור, תנועות כרומוזומים ובי-אוריינטציה של כרומוזומים. תודה שצפיתם, ובהצלחה בניסוייכם.

techniques-for-imaging-prometaphase-metaphase-meiosis-i-fixed

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה...

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה...

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

Immunostaining של ביציות דרוזופילה בשלב מאוחר יכול להיות מאתגר בשל הקרומים הסובבים את הביציות. סרטון זה מתאר שיטה בעלת תפוקה גבוהה להשגת ביציות, קיבוע שלהן והסרת קרומים לצורך צביעה חיסונית. הפרוטוקול המוצג מדגים טכניקות אלה עם ביציות בשלב מאוחר המשמשות לדמיין שלבים שונים של מיוזה.

הכנת ביציות דרוזופילה קבועות עבור immunostaining: שיטה תפוקה גבוהה כדי לתקן ולהסיר את הקרום החיצוני

הדמיה של חלבוני centrosomal במהלך spermatogenesis דרוזופילה היא שיטה רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לביולוגית centrosome, כמו גם על מנת להבהיר את הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליך זה.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

כתב יד זה מציג שיטה מפורטת ליצירת X-כרומוזום הזרוע המחקרים וכל ביצוע קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) לבדוק את מצבה של אחותך כרומטידה לכידות ב- prometaphase, מפה של עצרתי  דרוזופילה oocytes. פרוטוקול זה מתאים לקביעת אם הזרוע meiotic לכידות הוא שלם או קטועים ב שונים אחרים.

באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני דרוזופילה Oocytes

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

Mesoscopic הקרינה טומוגרפיה פועלת מעבר לגבולות חדירה של מיקרוסקופיה רקמות חתך פלואורסצנטי. הטכניקה מבוססת על תאורה השלכה רב ותיאור תחבורה פוטון. אנו להדגים ב-vivo כל הגוף 3D להדמיה של המורפוגנזה ה-GFP-לבטא דיסקים דמותי האגף...

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

למדו הכנת ביציות Drosophila לבדיקה ציטולוגית של הרכבת ספינדל וכיוון כרומוזומים במיוזה. השיטה מאפשרת הדמיה באימונופלואורסצנציה וחושפת מנגנוני דו-קוטביות ותפקוד גנטי בתאים.

טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע

גלה סרטונים נוספים