שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לחקור שינויים בהרכב השומנים של נויטרופילים במהלך שחרור מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה ו-HPLC. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבל מידע מפורט יותר על המנגנונים המעורבים ביצירת מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים, או בשם קצר, היווצרות NET. היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהוא מספק מידע על תפקיד השומנים בתפקוד הכללי של נויטרופילים על ידי שימוש בפרוטוקול קל לביצוע.

הבידוד של תאים שמקורם בדם אנושי יודגם על ידי דוקטורנטית לשעבר במעבדה שלנו, אריאן נוימן. והיא תסייע על ידי פרידריקה רונר. הכנת תאים לניתוח ליפידים תודגם על ידי גרהם ברוגדן, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי, ודיאב חוסיין, סטודנט לתואר שני בתוכנית לביוכימיה.

כדי לבודד נויטרופילים שמקורם בדם אנושי שכבו כ-20 מ"ל דם על 20 מ"ל של תמיסת נתרן דיאטריזואט/דקסטרן ליד להבה, מבלי לערבב. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 470 פעמים גרם ללא בלימה. זה קריטי לא לערבב את שלב הדם עם דרגת הצפיפות בתמיסה.

לאחר שלב הצנטריפוגה בתוספת תאים חד-גרעיניים יש להסיר בזהירות כדי למנוע זיהום או הפעלה לא ספציפית של תאים. הסר את התאים החד-גרעיניים ואת שכבת הפלזמה הצהבהבה. העבירו את התא הפולימורפו-גרעיני, או שלב ה-PMN, לתוך צינור חדש של 50 מ"ל, ומלאו אותו עד 50 מ"ל במי מלח חוצצים פוספט 1X.

צנטריפוגה את הדגימה למשך 10 דקות ב 470 פעמים גרם עם בלימה. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל מים סטריליים למשך חמש שניות כדי ליזק את האריתרוציטים. מלאו מיד את הצינור ל-50 מ"ל עם 1X PBS וצנטריפוגה את הדגימה.

עם הסרת הסופרנטנט, הכדור צריך להיות לבן. אם הוא עדיין אדום, חזור על שלבים אלה. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-1000 מיקרוליטר של מכון הזיכרון רוזוול פארק, או מדיום RPMI.

ספרו את מספר התא באמצעות צביעת טריפן כחול והמוציטומטר תחת מיקרוסקופ אור. הכן תרחיף תאים ב- RPMI בריכוז של שני מיליון תאים למ"ל. ניתן לקצור כ-25 מיליון נויטרופילים מ-20 מ"ל דם.

כדי לטפל פרמקולוגית בנויטרופילים לניתוח שומנים, השתמש ב -15 מיליון מהתאים המוכנים. דגרו את הדגימות בצינורות התגובה למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר צנטריפוגה של הדגימות יש להסיר את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את כדור התא ב-300 מיקרוליטר של HBSS.

לאחר צנטריפוגה שוב של הדגימה באמצעות אותם פרמטרים, השעו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של תמיסת כלורופורם:מתנול 1:1. לאחר מכן הומוגניזציה של הגלולה המושעה מחדש עם צינורית בגודל 26 על ידי דחיפת הדגימה פנימה והחוצה ממזרק של 1 מ"ל 10 פעמים. כדי לבודד את השומנים מהנויטרופילים שמקורם בדם היקפי אנושי, קחו את הנויטרופילים המוכנים והניחו אותם על קרח.

פיפטו את הנויטרופילים לצינור זכוכית עם מכסה בורג של 15 מ"ל עם אטם PTFE, והפכו אותם להומוגניזציה על ידי ניעור למשך דקה אחת. לאחר מכן מוסיפים 2 מ"ל מתנול ואחריו דקה לאחר מכן 1 מ"ל כלורופורם. לאחר ניעור של דקה נוספת, סובב את צינורות הזכוכית בטמפרטורת החדר ו -50 סל"ד למשך 30 דקות.

לאחר מכן, גלולה את חלק החלבון על ידי צנטריפוגה של התמיסה ב -7 מעלות צלזיוס ו -1, 952 פעמים גרם למשך 10 דקות. שפכו בזהירות את הסופרנטנט לתוך צינור זכוכית חדש של 15 מ"ל עם מכסה בורג, והשאירו מאחור את הגלולה המכילה חלבון. אחסן את הגלולה ב-20 מעלות צלזיוס לכימות עתידי.

מוסיפים 1 מ"ל כלורופורם וממתינים דקה אחת. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל מים מזוקקים כפולים והפוך את צינור מכסה הבורג מזכוכית עם הדגימה למשך 30 שניות. לאחר צנטריפוגה של הדגימה כמו קודם, הסר והשליך את השלב העליון למטה, אך לא כולל השכבה העכורה.

יבש את הדגימות ברכז ואקום ב-60 מעלות צלזיוס ואחסן אותן ב-20 מעלות צלזיוס עד הצורך. כדי להתחיל, מלאו עד 5 מ"ל מכל תמיסה בתא הזכוכית המתאים. הוסף כל סוג של נייר סינון כדי להגביר את מהירות הריצה בכל תא.

דגירה מוקדמת של צלחת זכוכית HPTLC סיליקה ג'ל 60 בגודל 20x10 ס"מ בתמיסת הריצה הראשונה. לאחר שתמיסת הריצה מגיעה לחלק העליון של הצלחת, יש לייבש אותה במשך 10 דקות בחום של 110 מעלות צלזיוס. ממיסים את גלולת השומנים, שהושגה בעבר לאחר ייבוש עם רכז ואקום, בנפח הרצוי של 1:1 כלורופורם: תמיסת מתנול, ודוגרים למשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס להמסה.

לאחר מכן, השתמש בסרגל ובעיפרון רך כדי לסמן את נקודות הטעינה למספר הדגימות הרצוי בתוספת תקן אחד לפחות. סמן את מרחק הריצה בכ-4 ס"מ עבור פתרון הריצה הראשון וכ-6 ס"מ עבור פתרון הריצה השני. כדי לטעון את הדגימות, שטפו את המזרק של 10 מיקרוליטר שלוש פעמים בכלורופורם 1:1: מתנול לפני טעינת כל דגימה חדשה.

טען 10 מיקרוליטר מכל דגימה בניסיון לרכז את הדגימה על שטח קטן ככל האפשר. הנח את הצלחת אנכית לתוך החדר הראשון עם פתרון ריצה אחד. ודא שהצלחת מקבילה לדופן תא הזכוכית כדי להשיג מהירות נדידה אחידה.

הקפד שהלוחות ממוקמים במקביל לקיר האחורי של תאי הזכוכית ושחזיתות הממס לא ירוצו רחוק מדי כדי להבטיח שהליפידים מופרדים ביעילות. לאחר שקו הממס הגיע לסימון הראשון, הסר את הצלחת, יבש אותה והנח אותה בתמיסה השנייה. חזור על שלבים דומים עבור הפתרון השני והשלישי.

השאירו את הצלחת בתמיסה עד שחזית הממס תגיע לחלק העליון של הצלחת. לאחר מכן, הסר את הצלחת וייבש אותה בטמפרטורת החדר למשך דקה. מניחים את הצלחת בתמיסת הנחושת גופרתית למשך שבע שניות.

לאחר ייבוש יסודי של הצלחת, אופים אותה בתנור במשך שבע דקות בחום של 170 מעלות צלזיוס. מוציאים את הצלחת מהתנור ומניחים לה להתקרר. כדי לבצע HPLC, חבר את העמוד למחסנית מגן במכשיר, וחמם אותו ל-32 מעלות צלזיוס.

השתמש במתנול כשלב הנייד בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה ו-65 בר. הגדר את גלאי ה-UV למדידה של 202 ננומטר כדי לכמת את כמות הכולסטרול בכל דגימה. שטפו היטב את מכונת ה-HPLC לפני ניתוח הדגימות וקבעו עקומת כולסטרול סטנדרטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לבסוף, השעו מחדש את הדגימות ב-500 מיקרוליטר של 1:1 כלורופורם: מתנול בבקבוקי זכוכית 1.5 מ"ל בצבע ענבר עם מכסי PTFE/סיליקון לבנים לפני טעינתם על מכשיר ה-HPLC. מוצג כאן פרופיל השומנים של נויטרופילים על צלחת HPTLC. ניתן לזהות שומנים על ידי השוואת מרחקי הנדידה לתקן.

כמו כן מוצגת כרומטוגרמה של HPLC המציגה שתי פסגות גדולות. השיא הראשון קצת לפני שתי דקות הוא כלורופורם. השיא הגדול השני בחמש דקות הוא כולסטרול.

מוצגות כאן עקומות סטנדרטיות של כולסטרול שנקבעו על ידי HPLC ועל ידי HPTLC. העקומה הסטנדרטית המתקבלת על ידי HPLC היא ליניארית על פני טווח ריכוזים רחב יותר בהשוואה לעקומה הסטנדרטית של HPTLC. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד נויטרופילים שמקורם בדם אנושי ולאחר מכן לנתח את הרכב השומנים שלהם.

בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור ללבוש כפפות ניטריל כדי להגן על הידיים מפני חשיפה מסוכנת לכלורופורם: מתנול וגם לעבוד מתחת למכסה אדים. ניסויים עתידיים יספקו מידע נוסף על המנגנונים המעורבים בהיווצרות NET ותפקודי נויטרופילים כלליים שעדיין אינם מובנים במלואם. אל תשכח שעבודה עם תאים ראשוניים שמקורם בדם אנושי דורשת אישור אתי כמו גם אמצעי זהירות מתאימים כגון עבודה במעבדת בטיחות ביולוגית מתאימה כדי למנוע חשיפה לסיכון לפתוגנים אנושיים.

לבסוף, מטרת המחקר שלנו היא למצוא מטרות טיפוליות חדשות נגד זיהום שמבוססות על מערכת החיסון המולדת, ובמיוחד הרכב השומנים מעניין אותנו מאוד מאחר שהוא יסייע לנו להבין מדוע הנויטרופיל פועל כאנטי-מיקרוביאלי כנגד זיהום.