כלים כדי ללמוד את התפקיד של HMGB1 חלבון אדריכלי בעיבוד בסילוף Helix, DNA ספציפיים באתר Interstrand Crosslinks

המטרה הכוללת של ניסויי כרומטין אימונו-משקעים וסלילת DNA היא לחקור את הקשר והשינויים הטופולוגיים הבאים הנגרמים על ידי חלבונים ארכיטקטוניים על נזק DNA ספציפי לאתר הנגרם על ידי חומרים כימותרפיים או מסרטנים בתאים אנושיים. מתודולוגיה זו תאפשר לנו לענות על שאלות מפתח לגבי נזק ותיקון DNA שאמורות להקל על גילוי מטרות פרמקולוגיות חדשות לטיפול בסרטן. הטכנולוגיה שלנו מאפשרת לנו לכוון נזק ל-DNA ספציפי לאתר, ומאפשרת הערכה של תהליכי תיקון DNA קריטיים הרלוונטיים לסרטן אנושי.

כדי להתחיל, 24 שעות לפני הטרנספקציה, צלחת 400,000 תאי יונקים לכל צלחת של 60 מילימטר ב-DMEM בתוספת 10% FBS ללא אנטיביוטיקה. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך הלילה. בצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר, שלב 30 מיקרוליטר של חומר טרנספקציוני בטמפרטורת החדר עם 500 מיקרוליטר של מדיום גידול 1X שחומם ל-37 מעלות צלזיוס.

בשפופרת שנייה, שלבו שני מיקרוגרם של פלסמידים המכילים ICL מכוון TFO ב-500 מיקרוליטר של מדיום גידול 1X. דגרו את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מערבבים אחד עם ערבוב שניים, ופיפטה למעלה ולמטה לערבוב יסודי.

לאחר מכן דגרו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 25 עד 30 דקות. לאחר מכן, השתמש ב-PBS חם כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת הטרנספקציה בצורה טיפתית, והפיצו את התמיסה באופן שווה בכל צלחת התאים.

הוסף מיליליטר אחד של מצע גידול לצלחת, והביא את הנפח הסופי לשני מיליליטר. מערבבים היטב, ומניחים את צלחות התרבות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני. ארבע שעות לאחר מכן, החלף את המדיום בשלושה מיליליטר של מדיום גידול עם 10% FBS, ודגר 16 שעות נוספות.

לאחר הדגירה יש להוסיף לתאים 80 מיקרוליטר של פורמלדהיד טרי 37% לצלחת, ולדגור בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות. להרוות את הפורמלדהיד על ידי הוספת 300 מיקרוליטר גליצין צונן לצלחת, ולדגור במשך חמש דקות. לאחר מכן הסר את המדיום, והשתמש ב- PBS צונן כדי לשטוף את הצלחות פעמיים.

לאחר מכן, לאחר הוספת מילימטר אחד של PBS מקורר, אספו את התאים על ידי גירוד לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה על קרח, תוך שמירה על דגימות על קרח כל הזמן. הכן כדורי תאים על ידי צנטריפוגה ב-13, 400 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והניח את הכדורים על קרח.

השתמש במיליליטר אחד של Buffer A צונן כדי להשעות מחדש את הכדורים בצורה הומוגנית, ולדגור על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, גלולה את התאים כמו קודם. כעת, עם מיליליטר אחד של Buffer B צונן, השעו מחדש את הכדורים באופן הומוגני, ודגרו על קרח למשך 10 דקות עם ערבוב מדי פעם על ידי היפוך.

ואז גלולה את התאים כמו קודם. לאחר השעיית התאים שוב, ב-200 מיקרוליטר של מאגר B מקורר, הוסיפו שני מיקרוליטרים של נוקלאז מיקרוקוקלי, או MNase, ודגרו את התגובה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, עצרו את תגובת ה-MNase על ידי הנחת הצינורות על קרח, והוספת 40 מילי-מולרי EDTA.

רמת העיכול על ידי מיקרוקוקל נוקלאז היא קריטית מאוד, מכיוון שעיכול יתר עלול לגרום לאובדן אות, בעוד שתת עיכול עלול לגרום להרבה רקע לא ספציפי. לאחר הטלת התאים, השעו מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של משקעים חיסוניים של כרומטין, או מאגר ChIP, בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה דק דופן.

סוניקציה של הדגימות על ידי הצפתן על סוניקטור אמבט מים למשך 20 שניות, ולאחר מכן 20 שניות על קרח. חזור על שלבי הסוניקציה תשע פעמים כדי ליצור כ-800 עד 1,200 שברי זוגות בסיסים. ל-20 מיקרוליטר מהדגימות הסוניקטיביות, הוסיפו שלושה מיקרוליטר של חמישה נתרן כלורי מולארי, ומיקרוליטר אחד של RNase A.Vortex את הצינורות, ודגרו אותם ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של פרוטאינאז K, ודגרו בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר טיהור הדגימות, על פי פרוטוקול הטקסט, יש להריץ אותן על ג'ל אגרוז 1%, ולדמיין עם אתידיום ברומיד. בשלושה צינורות סיליקון נפרדים ומקוררים מראש, הוסיפו 30 מיקרוליטר ליזאט ו-70 מיקרוליטר של מאגר 1X ChIP מקורר בתוספת מעכבי פרוטאז.

הוסף מיקרוגרם אחד של נוגדנים נגד IgG, אנטי-היסטון H3 או אנטי-HMGB1 לצינורות המתאימים. דגירה למשך הלילה בחדר קר עם סיבוב רציף. בחדר הקירור, לאחר השעיה מחדש של חרוזי חלבון G, הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של החרוזים לכל צינור תגובה, ודגרו בחדר קר עם סיבוב למשך שעתיים עד ארבע שעות נוספות.

הנח את הצינורות על מתלה מגנטי כדי לגלול את החרוזים, והסר את הסופרנטנט. הוסף לכדורים 200 מיקרוליטר של מאגר ChIP 1X עם קוקטייל מעכב פרוטאז, ושטוף בקור עם סיבוב במשך חמש דקות. לאחר מכן, עם מאגר ChIP 1X מלח גבוה, בצע שטיפה נוספת.

לאחר מכן, השתמש ב-160 מיקרוליטר של מאגר פליטה כדי להשעות מחדש את הכדורים, ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב למשך 30 דקות. גלו את החרוזים, ואספו את הסופרנטנט בצינור טרי. הוסיפו שישה מיקרוליטרים של נתרן כלורי מולארי ושני מיקרוליטרים של פרוטאינאז K, ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.

לאחר טיהור ה-DNA, על פי פרוטוקול הטקסט, בצע תגובות PCR באמצעות ערכות פריימר לאזור או לאזורי העניין, ופתור את המוצרים על ג'ל אגרוז 1%, מוכתם באתידיום ברומיד. לפני השימוש, הפשירו בעבר מאגר סינתזה לתיקון DNA על קרח, והוסיפו 40 מילי-מולרי פוספוקריאטין, ו-2.5 מיקרוגרם קריאטין פוספוקינאז. לאחר הכנת מאגר סלילי-על פי 10X, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במיקרוליטר אחד של Vaccinia topoisomerase 1 עם מאגר סליל-על 1X בתגובה של 10 מיקרוליטר כדי ליניאריזציה של 300 ננוגרם של פלסמיד סליל-על, PCA FG1.

לפלסמידים הרגועים, הוסיפו 25 מיקרוליטר של תמצית תאי HeLa שזה עתה הופשרה, ומאגר סינתזת DNA. מערבבים היטב, ואז מוסיפים מיקרוליטר אחד של Vaccinia topoisomerase 1 לתגובה, ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. סיימו את התגובות על ידי הוספת 1% SDS, ו-0.25 מיליגרם למיליליטר של פרוטאינאז K, ודגרו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר יציקת ג'ל אגרוז 1% עם מאגר 1X TPE, הוסף צבע טעון DNA לתגובות, וטען את הדגימות ישירות על הג'ל במרחק של לפחות ארבעה נתיבים זה מזה. הפעל את הג'ל במשך שמונה עד 10 שעות בשני וולט לסנטימטר ב-1X TBE עבור הממד הראשון בטמפרטורת החדר כדי לפתור את הטופוזומרים. הכן שני ליטר של 1X TBE עם שלושה מיקרוגרם למיליליטר כלורוקווין פוספט.

משרים את הג'ל ב -200 מיליליטר מהתמיסה, מכוסה בנייר אלומיניום למשך 20 דקות. כדי לאלקטרופור את הג'ל בממד השני, סובב את הג'ל 90 מעלות בכיוון השעון, והפעל אותו במשך ארבע עד שש שעות בשני וולט לסנטימטר בכלורוקווין המכיל 1X TBE כדי לפתור את סלילי העל החיוביים והשליליים. כמות הכלורוקווין במאגר האלקטרופורזה, ובג'ל, היא קריטית מאוד, כמו גם הפעלת הג'ל במתח נמוך מאוד עבור הממד השני היא קריטית מאוד כדי להפריד בין סלילי העל החיוביים והשליליים.

לאחר צביעה והסרת הג'ל, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בהדמיה כדי לדמיין את התפלגות החום של הטופוזומרים. כפי שניתן לראות בג'ל זה, כ-79% מהפלסמידים המכילים ICL מכווני TFO נודדים בניידות איטית יותר דרך מטריצת ג'ל האגרוז בהשוואה לפלסמידים בקרה לא מקושרים. מבחני ChIP שבוצעו על ליזטים מתאי U2OS אנושיים שהועברו עם פלסמיד בקרה או פלסמידים המכילים ICLs מכווני TFO מראים העשרה של HMGB1 באזור P-ICL בהשוואה לאזור הביקורת כאשר הם מואצים חיסונית עם נוגדן anti-HMGB1.

כאשר HMGB1 התרוקן מהתאים באמצעות טיפול ב-siRNA, ההעשרה הספציפית ל-P-ICL פחתה. כאשר אותן דגימות הוזרזו באמצעות נוגדן נגד IgG, זוהתה הגברת PCR מינימלית. לבסוף, באיור זה, אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז מדגימה שינוי ארכיטקטוני של הפלסמידים המכילים ICL מכווני TFO כסליל-על שלילי על ידי HMGB1 בתמציות תאי HeLa.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כחמישה ימים, אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לזכור שכל השטיפות צריכות להיעשות בחדר הקירור, שכן שטיפות בטמפרטורת החדר עלולות להגביר את אות הרקע. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון דלדול חלבון בתיווך siRNA, ואחריו בדיקות סינון מוטציות, על מנת לענות על שאלות, כגון, האם החלבון המעניין מעורב בתיקון DNA?

או, האם זה משנה באופן משמעותי את ספקטרום המוטציות במהלך התהליך? טכניקה זו סללה את הדרך לחקר הקשר בין חלבונים לנזק ספציפי ל-DNA ספציפי לאתר. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לחקור את הקשר של חלבונים אדריכליים כדי למקד קישורים צולבים של DNA, ובהמשך, לקבוע את ההשפעה של קשר כזה על הטופולוגיה של ה- DNA.

אל תשכח שעבודה עם אתידיום ברומיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן יש ללבוש תמיד ציוד מגן מתאים במהלך ביצוע ניסוי זה.