ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

המטרה הכוללת של ה-CARA היא לספק הערכה כמותית למחצה בתפוקה בינונית של פעילות התרכובות כנגד מיקובקטריות משתכפלות ולא משתכפלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שכמחליף CFU, ה-CARA מאפשר לבדוק במהירות את המינון והתלות בזמן של תרכובת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום גילוי תרופות לשחפת, כגון קביעה אם תרכובת היא בקטריוסטטית או חיידקית כנגד חיידקים משתכפלים ואם היא קוטל חיידקים נגד חיידקים שאינם משתכפלים.

תדגים את השיטה ג'וליה רוברטס, שותפה במעבדה שלנו. הוסף 450 מיליליטר מים לכוס זכוכית של ליטר אחד או 900 מיליליטר מים לבקבוק ארלנמאייר של שני ליטר. כלול מוט ערבוב הניתן לחיטוי בכוס או בבקבוק.

לאחר מכן, הוסף אבקת Middlebrook 7H11, פחם פעיל לריכוז סופי של 0.4% ותמיסת גליצרול 50% כדי להשיג ריכוז סופי של 0.2%. מכסים את פתח הבקבוק או הכוס בנייר אלומיניום ומחברים לזכוכית בעזרת סרט חיטוי. לאחר חיטוי המדיום, מצננים אותו לכ-55 עד 65 מעלות צלזיוס על צלחת ערבוב מגנטית המוגדרת למהירות נמוכה כדי לשמור על הפחם בתרחיף.

תוך כדי עבודה אספטית בקולט אדים עם בטיחות ביולוגית שיש לו לוחית ערבוב מגנטית, הסר את נייר הכסף מהמדיום והוסף 100 או 50 מיליליטר של תוסף OADC לבקבוק של שני ליטר או לכוס ליטר אחד בהתאמה והמשיך לערבב. בעזרת פיפטה רב-ערוצית עם שמונה או 12 קצות מסנן, מלאו מיקרופלייט של 96 בארות בבאר של 200 מיקרוליטר של פחם 7H11-OADC ממאגר המגיב או הכוס, ועבדו במהירות כדי למנוע התמצקות אגר והיווצרות בועות. הניחו ערימות של מיקרו-צלחות CARA בשקיות ניילון הניתנות לסגירה חוזרת כדי למנוע התייבשות ואחסנו אותן בארבע מעלות צלזיוס.

חסנו צינורות צנטריפוגה עגולים או חרוטיים מפוליפרופילן המכילים ארבעה או 20 מיליליטר בהתאמה של Middlebrook 7H9-ADN או 7H9-OADC עם M.smegmatis ב-OD580 של 0.01 עד 0.1. דגרו על תרביות M.smegmatis ב-37 מעלות צלזיוס ו-20% O2 עם טלטול, והרחיבו את התרביות לשלב אמצע העץ או OD580 משוער של 0.5. כדי להגדיר ניסוי בסגנון ריכוז מעכב מינימלי בתנאים של שכפול ולא שכפול, יש להפיץ 200 מיקרוליטר של תאים ב-7H9-ADN ב-OD580 של 0.01 לכל הבארות של צלחת 96 בארות שטופלה בתרבית רקמה שקופה.

עבור הבדיקה שאינה משתכפלת, השתמש ב-PBS המכיל 0.02% טילוקספול כדי לשטוף את התאים פעמיים. והשתמש במדיום שאינו משכפל כדי להשעות מחדש את התאים. השתמש במדיום שאינו משתכפל כדי לדלל את התאים ל-OD580 של 0.1 ולהוסיף נתרן חנקתי לריכוז סופי של 0.5 עד 5 מילי-מולר ממלאי טוחנת טרי שהוכן לאחרונה.

הפץ 200 מיקרוליטר תאים ב-OD580 של 0.1 לכל הבארות של צלחת 96 בארות שטופלה בתרבית רקמות שקופה. לאחר הכנת חומרי בדיקה על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף שני מיקרוליטר של חומר בדיקה אחד לשורות A עד E ושני מיקרוליטרים של חומר בדיקה שניים לשורות E עד H, וערבב היטב. לצורך שכפול מבחנים, דגרו מיקרו-לוחות M.smegmatis ב-37 מעלות צלזיוס, 20% O2 ו-5% CO2 למשך שעה עד 48 שעות.

בנקודות הזמן שבהן ה-CARA ישמש כקריאה, השתמש בפיפטה רב-ערוצית p200 המוגדרת ב-50 עד 75 מיקרוליטר כדי להשעות מחדש בזהירות את תכולת הבאר של לוחית הבדיקה בסגנון MIC90 על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש עד 10 פעמים. לאחר מכן השתמש בקצות הפיפטה כדי לסובב בעדינות את תכולת הבארות בתנועה סיבובית. העבר 10 מיקרוליטר מתכולת באר הבדיקה הלא מדוללת לבארות המתאימות של המיקרו-פלטת CARA הימנע מהתזות במהלך ההעברות, וודא שב-10 מיקרוליטר אליקוט מזוהה באמצע בארות המיקרו-פלטות של CARA.

בעזרת סרט צלחת, קשרו ערימות של מיקרו-צלחות CARA ולאחר מכן הניחו אותן בשקית ניילון הניתנת לסגירה חוזרת. דגרו את המיקרו-לוחות M.smegmatis CARA ב-37 מעלות צלזיוס עם 20% O2 למשך יום עד יומיים לשכפול צלחות ולמשך יומיים עד שלושה עבור צלחות שאינן משתכפלות. כאשר סרט של גידול חיידקים או מושבות מקרוסקופיות גדולות יותר נראה בבארות הבקרה השליליות, השתמש בסט יחיד של 12 קצות p200 עם פיפטה רב-ערוצית כדי להוציא 40 מיקרוליטר של PBS סטרילי לאורך צד הבארות ולאפשר ל-PBS להתפזר על פני החלק העליון של המיקרו-מושבות האגר/חיידקים.

הכן מגיב פיתוח CARA על ידי ערבוב של חמישה מיליגרם רזזורין ו-50 מיליליטר של 5%Tween80 ב-PBS. הוסף 50 מיקרוליטר של ריאגנט פיתוח CARA טרי לכל באר של המיקרו-צלחת של CARA. לאחר מכן נדנד את הלוחות קדימה ואחורה כמה פעמים כדי לעזור להפיץ את המגיב על פני האגר ומחצלת החיידקים בכל באר.

מניחים את הצלחות בשקית ניילון הניתנת לסגירה חוזרת ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות עבור M.smegmatis. לפני קריאת הקרינה יש להניח את המיקרו-פלטות של CARA במכסה מנוע למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כשהמכסים מוסרים. בעת שימוש בספקטרופוטומטרים BSL3 מחוץ לארון בטיחות ביולוגית, הדביקו מדבקת PCR באיכות אופטית מעל הצלחת והשתמשו במגבת נייר רכה כדי לאטום היטב על ידי לחיצה עדינה על משטח המדבקה.

קבע את הקרינה באמצעות קריאה עליונה עם עירור ב-530 ננומטר ופליטה ב-590 ננומטר. אין צורך לרוקן את הצלחת. כדי לנתח את הנתונים, שרטט את ריכוז המעכב על ציר ה-X כסולם log10 ואת הקרינה על ציר ה-Y בקנה מידה ליניארי.

עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים. ריכוז חומר הבדיקה שגורם לכישלון הקרינה של CARA לעלות מעל רמות הרקע הוא ה-CARA-MBC גדול משווה ל-99 המוצג כאן. הגדול מהשווה ל-99 מציין כי ה-CARA-MBC מספק ריכוז משוער של חומר בדיקה, המוליד הרג חיידקים גדול משווה לשני log10.

תרכובות חשודות כמפעילות אפקט פוסט-אנטיביוטי אם הן מציגות חלון סטטי, המוגדר כתזוזה גדולה מפי ארבעה ימינה בין עקומות MIC ו-CARA. החלון הסטטי מצביע על כך שמולקולה הפעילה נגד שכפול M.tuberculosis עשויה להיות בקטריוסטטית במקום קוטל חיידקים. עבור מולקולות בעלות השפעה פוסט-אנטיביוטית חזקה, חלונות סטטיים עשויים להיות קשים לצפייה והם נראים רק לאחר בדיקה של ציר Y מורחב עבור פלואורסצנטיות CARA כפי שניתן לראות כאן.

מולקולות פעילות משוכפלות ולא משתכפלות שנבדקו על ידי MIC90 ו-CARA מוצגות כאן. בעוד שנראה כי לאיזוניאזיד ולינזוליד יש פעילות נגד חיידקים שאינם משתכפלים על ידי בדיקת MIC90, ה-CARA מציע שהם אינם פעילים בתנאים שאינם משתכפלים שנבדקו. בניסוי CARA זה, חשיפת M.smegmatis לריכוזים הולכים וגדלים של ריפמפיצין חשפה פגיעה תוך שעה אחת בלבד והראתה פעילות חיידקית מוגברת בין שלוש ל-24 שעות שהרגה יותר מ-2 עד 3 לוג10 בכ-10 מיקרוגרם למיליליטר ב-24 שעות.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעתיים להכנת צלחות, פחות משעה להעברת תאים לצלחות CARA, וכשעה עד שעתיים לפתח ולמדוד פלואורסצנטיות של לוחות CARA אם זה נעשה כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש ב-CARA כמבחן חיזוי כדי לקבוע אם לתרכובת יש פעילות חיידקית או בקטריוסטטית כנגד מיקובקטריות המשכפלות או אינן משתכפלות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להגדיר CARA ולנתח נתונים באופן שמסייע לחזות את סוג הפעילות של תרכובת.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.