ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

המטרה הכוללת של ה-CARA היא לספק הערכה חצי-כמותית בעלת תפוקה בינונית של פעילות תרכובות נגד מיקובקטריה משוכפלת ושאינה משוכפלת. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שכבתחליף ל-CFU, ה-CARA מאפשרת לבחון במהירות את התלות במינון ובזמן של תרכובת. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום גילוי תרופות לשחפת, כגון קביעה אם תרכובת היא בקטריוסטטית או בקטריצידית נגד חיידקים משוכפלים, והאם היא בקטריצידית נגד חיידקים שאינם משוכפלים.

את השיטה תדגים ג'וליה רוברטס, עמיתה במעבדה שלנו. הוסיפו 450 milliliters של מים לכוס כימית מזכוכית בנפח של ליטר אחד, או 900 milliliters של מים לבקבוק ארלנמאייר בנפח של שני ליטרים. הכניסו למכלי הזכוכית מגנט ערבוב שניתן לעקר באוטוקלבה.

לאחר מכן, הוסיפו אבקת Middlebrook 7H11, פחם פעיל לריכוז סופי של 0.4% ותמיסת 50% glycerol כדי להגיע לריכוז סופי של 0.2%. כסו את פתח הבקראק או הכלי עם נייר אלומיניום והדביקו לזכוכית באמצעות סרט הדבקה לאוטוקלב. לאחר עיקור המצע באוטוקלב, קררו אותו לערך של 55 עד 65 degrees Celsius על גבי בוחנן מגנטי המכוון למהירות נמוכה כדי לשמור על הפחם בתמיסה.

בעת עבודה סטרילית במנדף בטיחות ביולוגית הכולל בוחש מגנטי, הסירו את הרדיד מבעגל המצע והוסיפו 100 או 50 מיליליטר של תוספת OADC לבקראך של שני ליטר או לכוס כימית של ליטר אחד, בהתאמה, והמשיכו בערבוב. באמצעות פיפט רב-ערוצי עם שמונה או 12 טיפים עם פילטר, מלאו מיקרופלטה בעלת 96 בארות ב-200 מיקרוליטר של 7H11-OADC-charcoal ממאגר הריאגנטים או מהכוס הכימית, תוך עבודה מהירה כדי למנוע התמצקות של האגר ויצירת בועות. הניחו ערימות של מיקרופלטות CARA בשקיות פלסטיק הניתנות לסגירה חוזרת כדי למנוע התייבשות, ואחסנו אותן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

יש להוסיף M.smegmatis בריכוז OD580 של 0.01 עד 0.1 למבחנות צנטריפוגה מפוליפרופילן בעלות תחתית עגולה או קונוית, המכילות ארבעה או 20 מיליליטרים של Middlebrook 7H9-ADN או 7H9-OADC בהתאמה. יש להדגיר את תרביות ה-M.smegmatis בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-20%O2 עם ניעור, עד להגעה לשלב הלוגריתמי המרכזי (mid-log phase) או לערך OD580 מקורב של 0.5. כדי להקים ניסוי בסגנון ריכוז עיכוב מינימלי (minimal inhibitory concentration) תחת תנאי שחזור ותנאים ללא שחזור, יש לחלק 200 microliters של תאים ב-7H9-ADN בריכוז OD580 של 0.01 לכל אחת מהבארות של פלטת 96-בארות שחובה לטיפול רקמות ובעלת תחתית שקופה.

עבור בדיקה של תאים שאינם משכפלים, השתמש ב-PBS המכיל 0.02% tyloxapol כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן, השתמש במצע שאינו משכפל כדי לתלה את התאים מחדש. השתמש במצע שאינו משכפל כדי לדלל את התאים עד ל-OD580 של 0.1, והוסף sodium nitrate לריכוז סופי של 0.5 עד 5 millimolar מתוך תמיסת סטוק של one molar שהוכנה טרם הבדיקה.

חלקו 200 µL של תאים בריכוז OD580 של 0.1 לכל הבארים של פלטה בעלת 96 באריים, עם תחתית שקופה ומטופלת לתרבית רקמה. לאחר הכנת חומרי הבדיקה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הוסיפו 2 µL של חומר בדיקה אחד לשורות A עד E ו-2 µL של חומר בדיקה שני לשורות E עד H, וערבבו היטב. עבור בדיקות חוזרות, הדגריו את מיקרו-פלטות ה-M.smegmatis בטמפרטורה של 37 °C, 20% O2 ו-5% CO2 למשך שעה אחת עד 48 שעות.

בנקודות הזמן שבהן נעשה שימוש ב-CARA כמדד תוצאה, השתמשו בפיפט רב-ערוצי p200 המכוון ל-50 עד 75 µL כדי להחזיר בזהירות את תכולת הבארות של פלטת הבדיקה מסוג MIC90 למצב של סספנסיות, באמצעות שאיבה ושחרור של הנוזל (pipetting up and down) 5 עד 10 פעמים. לאחר מכן, השתמשו בקצות הפיפט כדי לערבב בעדינות את תכולת הבארות בתנועות סיבוביות. העבירו 10 µL מתכולת בארת הבדיקה ללא דילול לבארות המתאימות במיקרופלטת ה-CARA, תוך הימנעות מהשפרצות במהלך ההעברה, וודאו שהמנה של 10 µL מונחת במרכז בארות מיקרופלטת ה-CARA.

בעזרת סרט דביק לפלטות, קשרו ערימות של מיקרופלטות CARA ולאחר מכן הכניסו אותן לשקית פלסטיק נסגרת. דגרו את מיקרופלטות ה-M.smegmatis CARA בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 20%O2 למשך יום עד יומיים עבור פלטות שחזרו (replicating plates) ולמשך יומיים עד שלושה עבור פלטות שאינן שחזוריות. כאשר נראה שכבה של צמיחה בקטריאלית או מושבות מאקרוסקופיות גדולות יותר בבארות של ביקורת השלילה, השתמשו בסט אחד של 12 טיפים p200 עם פפית רב-ערוצית כדי להעביר 40 microliters של PBS סטרילי לאורך דופן הבארות, ואפשרו ל-PBS להתפשט על פני השטח של האגר/מיקרומושבות הבקטריאליות.

הכינו תמיסת פיתוח CARA על ידי ערבוב של חמישה מיליגרמים של resazurin ו-50 milliliters של 5%Tween80 ב-PBS. הוסיפו 50 microliters של תמיסת פיתוח CARA שהוכנה טרייה לכל באר במיקרופלטת ה-CARA. לאחר מכן, נערו את הפלטות קדימה ואחורה מספר פעמים כדי לסייע בפיזור התמיסה על פני האגר ומחצן החיידקים בכל באר.

הניחו את הפלטות בתוך שקית פלסטיק הניתנת לסגירה מחדש והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות לפחות עבור M.smegmatis. לפני קריאת הפלואורסצנציה, הניחו את מיקרו-פלטות ה-CARA במCבטחת ביולוגית למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ללא המכסים. כאשר משתמשים בספקטרופוטומטרים של BSL3 מחוץ למכברת בטיחות ביולוגית, הדביקו מדבקת PCR באיכות אופטית על הפלטה והשתמשו בנייר סופג רך כדי לאטום אותה היטב על ידי לחיצה עדינה על פני השטח של המדבקה.

קבעו את הפלואורסצנציה באמצעות קריאה עליונה (top read) עם עירור ב-530 nanometers ופליטה ב-590 nanometers. אין צורך בכיול אפס (blank) של הפלטה. כדי לנתח את הנתונים, שרטטו את ריכוז המעכב על ציר ה-X בסולם log10 ואת הפלואורסצנציה על ציר ה-Y בסולם לינארי.

עיינו בפרוטוקול הכתוב לפרטים נוספים. ריכוז חומר הבדיקה שגורם לכך שפלואורסצנציית ה-CARA לא תעלה מעל רמות הרקע הוא ה-CARA-MBC הגדול או השווה ל-99 המוצג כאן. המסמן "גדול או שווה ל-99" מציין כי ה-CARA-MBC מספק ריכוז מוערך של חומר הבדיקה, הגורם להשמדה חיידקית של מעל או שווה ל-2 log10.

חשד כי תרכובות מפעילות אפקט פוסט-אנטיביוטי אם הן מציגות "חלון סטטי" (static window), המוגדר כהסטה ימינה של יותר מפי ארבעה בין עקומות ה-MIC ל-CARA. החלון הסטטי מעיד על כך שמוLECule הפעיל נגד שחזור של *M.tuberculosis* עשוי להיות בקטריוסטטי במקום בקטריצידי. עבור מולקולות בעלות אפקט פוסט-אנטיביוטי חזק, ייתכן שיהיה קושי להבחין בחלונות סטטיים, והם יופיעו רק לאחר בחינה של ציר Y מורחב עבור פלואורסצנציית CARA, כפי שניתן לראות כאן.

מולקולות פעילות משכפלות ולא משכפלות שנבדקו באמצעות MIC90 ו-CARA מוצגות כאן. בעוד ש-isoniazid ו-linezolid נראים כבעלי פעילות נגד חיידקים שאינם משכפלים בבדיקת MIC90, ה-CARA מרמז כי הם אינם פעילים תחת תנאי אי-השכפול שנבדקו. בניסוי CARA זה, חשיפת M.smegmatis לריכוזים עולים של rifampicin חשפה השפעה כבר לאחר שעה אחת בלבד והראתה פעילות בקטריצידית עולה בין 3 ל-24 שעות, עם הרגה של ≥ 2 עד 3 log10 בריכוז של כ-10 micrograms per milliliter עד לשעה ה-24.

לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעתיים להכנת הפלטות, פחות משעה להעברת תאים לפלטות CARA, וכשעה עד שעתיים לפיתוח ומדידת פלואורסצנציה של פלטות CARA, במידה והיא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש ב-CARA כבדיקה ניבויית כדי לקבוע אם תרכוב מסוים בעל פעילות בקטריצידית או בקטריוסטטית נגד מיקובקטריה המשכפלים או שאינם משכפלים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של אופן הגדרת CARA וניתוח נתונים באופן המסייע בניבוי סוג הפעילות של התרכוב.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.