ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

המטרה הכוללת של הליך שינוי גנטי זה של עכבר היא לזהות, לטהר ולאפיין תאי חיסון המייצרים IL-22. תאים של מערכת החיסון משחררים מתווכים שנקראים ציטוקינים, שאחראים להגן עלינו מפני גורמים זרים כמו חיידקים ולשקם רקמות פגועות. IL-22 הוא ציטוקין כזה ויוחסו לו פעילויות רבות החל מתיקון רקמות ועד פתולוגיה.

ומספר סוגי תאים שונים במערכת החיסון דווחו כמסוגלים לייצר אותו. אז כדי להבהיר אילו תאים באמת מייצרים IL-22, פיתחנו עכבר מדווח IL-22 חדש. זה איפשר לנו לזהות יצרני IL-22 רלוונטיים in vivo בעכברים בתנאים רגילים ובמודל של מחלת מעי דלקתית.

השתמשנו גם בתאי מדווח כדי לטהר את מבטאי IL-22 כדי לקבוע את תכונותיהם האחרות. השיטה ליצירת עכברים מדווחים מתוארת בקצרה ומתוארות שיטות הניתוח. ניתן ליישם את השיטות המתוארות על גנים אחרים למטרות זיהוי המבטאים וטיהור תאים מבטאים ברי קיימא לאפיון נוסף.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה לגבי הפעילות הביולוגית של IL-22 ותכונות התאים המייצרים אותו. תדגים איתי את ההליך ג'ולי היקסון, ביולוגית, קרוליין אנדרוז, פוסט-דוקטורנטית, ו-וונצ'ינג לי, מדען צוות כולם מהמעבדה של ד"ר דורהאם. לאחר החדרת הגן המדווח tdTomato לווקטור מעבורת, החלפת הגן GFP באותו אתר, השתמש בכרומוזום המלאכותי החיידקי המתאים, או בתבנית BAC כדי להגביר את תיבות ההומולוגיה A ו-B לאקסון המתורגם הראשון של IL-22 במערכת תגובת PCR של 50 מיקרוליטר.

לאחר מכן הפוך את הווקטורים המטוהרים לתאי חיידקים בעלי יכולת BAC על לוחות אגר לוריא-ברטאני או LB המכילים כלורמפניקול ואמפיצילין ב-37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, יש לחסן שתיים עד שלוש מושבות במיליליטר אחד של מרק LB, בתוספת כלורמפניקול ב-37 מעלות צלזיוס ו-225 סל"ד. לאחר שעה, מורחים 100 מיקרוליטר מכל תערובת על צלחת אגר LB בתוספת כלורמפניקול וסוכרוז לתרבית לילה ב-37 מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר, צלחו מחדש את המושבות הגדולות על צלחת אגר LB חדשה עם כלורמפניקול ואת המושבות הקטנות על צלחת אגר LB אחרת וחשפו את הלוחות לאור UV למשך 30 שניות. לאחר מכן בחר מושבה רגישה ל-UV והשתמש בפריימר הטרוזיגוט tdTomato IL-22 כדי לאשר את נוכחותו של ה-DNA BAC השונה על ידי PCR. לאחר הסרת הטחול והתימוס, השתמש במלקחיים משוננים עדינים כדי לקצור את בלוטות הלימפה המזנטריות הלבנות הפנינה קרוב לדופן המעי הדק.

לאחר מכן, הסר את כל המעי הדק והמעי הגס והשתמש במספריים כדי לחלץ את כתמי פייר הסגלגלים המורחבים לאורך המעיים. לאחר איסוף כל רקמות הלימפה, טוחנים את בלוטות הלימפה המזנטריות ואת המדבקות של פייר יחד בין שתי שקופיות חלביות ב-PBS בתוספת FBS על קרח. לאחר יצירת תרחיפי תאים בודדים של טחול ובלוטת התימוס באותו אופן, צנטריפוגה תאי הטחול עקבו אחר ליזה של תאי דם אדומים טחול עם מיליליטר אחד של טחול ACK Lysing Buffers.

לאחר דקה אחת, החזר את האיזוטוניות עם תשעה מיליליטר PBS וצנטריפוגה שוב את התאים. השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר PBS וסננו את התאים דרך מסננת תאים של 100 מיקרון. לאחר מכן אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה נוספת, והשהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום RPI לספירה על ידי אי הכללה כחולה של טריפאן.

לאחר קצירת המעי הדק מהתריסריון לאילאום יחד עם המעי הגס כולו, השתמש במלקחיים כדי להסיר את רקמת השומן והמזנטרית הנוספת מהמעי ולהניח מיד את רקמת המעי ב-PBS קר כקרח. השתמש במלקחיים כדי לקצור את כתמי פייר לאורך האזור הדיסטלי של המעי הדק. לאחר מכן השתמש במספריים כדי לפתוח את המעי לאורכו ולשטוף היטב את הרקמה עם 10 מיליליטר PBS קר כקרח.

העבירו את הדגימה ל-20 מיליליטר של מאגר עיכול מקדים לשתי דגירות של 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-50 סל"ד בשייקר, מערבולת הרקמה למשך 30 שניות ב-12,000 סל"ד ולחיצה על כל השברים דרך מסננת תאים של 100 מיקרון בסוף כל דגירה כדי לאסוף את שכבת תאי האפיתל. לאחר מכן, הוסף תמיסת EDTA טרייה של 20 מיליליטר לתמיסת התאים למשך 30 דקות נוספות עם ניעור ב-37 מעלות צלזיוס, סינון וקירור תאי האפיתל של המעי בסוף הדגירה כפי שהודגם זה עתה. מניחים את שברי המעי הנותרים על קרח ואוספים את תאי האפיתל במעי המאוגדים על ידי צנטריפוגה, ולאחר מכן שטיפה של 10 מיליליטר HBSS בתוספת FBS.

השעו מחדש את הגלולה השטופה בשמונה מיליליטר של מדיום סיליקה קולואידי 44% וכסו את תרחיף התא בחמישה מיליליטר של מדיום סיליקה קולואיד 67%. הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה והשתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי להסיר את חמשת המיליליטר העליונים של מדיום הפרדת התאים. לאחר מכן אוספים את התאים בממשק ושוטפים את תאי האפיתל במעי ב-10 מיליליטר של מדיום RPMI, ומשעים את הגלולה בחמישה מיליליטר של RPMI טרי.

לאחר הכנת תרחיפי תאי טחול בודדים מעכברי IL-22 td-Tomato כפי שהודגם זה עתה. השעו מחדש את התאים בריכוז אחד של 10 עד 7 תאים למיליליטר ב-PBS סטרילי והשתמשו בשיטת הבידוד השלילי של תאי CD4 של העכבר כדי לטהר את תאי ה-T החיוביים ל-CD4. לאחר מכן, סמנו את תאי ה-T בנוגדנים נגד CD4 ו-CD45RB למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ואחריה שטיפה בשני מיליליטר PBS בתוספת FBS. השעו מחדש את הגלולה השטופה במיליליטר אחד של PBS ו-FBS טריים ומיין את תאי ה-T המסומנים לפי ציטומטריית זרימה לפי הביטוי המשותף CD4 ו-CD45RB שלהם. לאחר שכל התאים מוינו, אספו אותם על ידי צנטריפוגה והשעו מחדש את הגלולה בריכוז חד פעמי של 10 עד שישה תאים למיליליטר ב-PBS סטרילי להזרקת התאים למקבלי עכברים נוקאאוט RAG1.

כדי ליצור את מדווח IL-22 העכברי, נעשה שימוש ברקומבינר טרנסגן לשינוי כרומוזום מלאכותי חיידקי הנושא את ארבה IL-22 המכיל גם סמן ברירה חיובי וגן עמידות לאנטיביוטיקה כלורמפניקול. לאחר הכנסת tdTomato לאקסון 1, רצף פפטיד האות שובש, לכד את מדווח ה-tdTomato בתוך התאים המבטאים IL-22 ואיפשר את זיהויים ובידודם על ידי ציטומטריית זרימה. כדי לבדוק את נאמנותם של מדווחי IL-22, ניתן לגדל טחול שנוצר במבחנה בתנאים Th22 או ניטרליים עם ביטוי IL-22 tdTomato הנראה הן על ידי ציטומטריית זרימה והן על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

in vivo, מדווחי IL-22 זוהו ברקמות עכבר שונות בתנאים הומאוסטטיים כאשר רוב האות נצפה בתאי הלמינה פרופריה מהמעיים, אך לא בבלוטת הלימפה בבית השחי, בטחול או בתימוס. במודל קוליטיס עכברי המושרה על ידי העברה של תאי CD45RB חיוביים CD4 לעכברי נוקאאוט RAG1, מדווחי tdTomato מוצגים לראשונה בבלוטות הלימפה המזנטריות, אך הצטברותם בסופו של דבר עם למינה פרופריה של המעי הדק הדיסטלי ורקמות המעי הגס. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור לבחור את שיבוט ה-BAC הנכון.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו הקמת מודלים של זיהום ריאות או עור באמצעות עכבר מדווח זה כדי לענות על שאלות נוספות לגבי תפקידו של IL-22 בהגנה על המארח ותיקון רקמות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את תפקודם של חלבונים מופרשים המדגימים ביטוי נמוך באמצעות מודל עכבר כמו זה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור עכבר מדווח טרנסגני ולזהות גנים מדווחים של IL-22 במבחנה וב-vivo.