ניתוח של ייבוא ​​חלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים מצמחים לחוצים

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לחקור את הייבוא של חלבונים מקודדי גרעין לכלורופלסטים עם דגש מיוחד על השפעות הלחץ. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכלורופלסט, כגון כיצד מוסדר ייבוא חלבון כלורופלסט. יתרון מיוחד של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת להעריך את השפעות הלחץ על יבוא חלבון כלורופלסט.

למרות ששיטה זו פותחה לשימוש עם צמח המודל Arabidopsis thaliana, ניתן לשנות אותה ולהתאים אותה לשימוש עם מערכות אחרות, כגון צמחי יבול. מי שתדגים את ההליך תהיה צ'יהואה לינג, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, יש לגדל תחילה את צמחי ה-Arabidopsis כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

לאחר מכן, כאשר הצמחים בני שמונה ימים, בצע טיפול במאמץ. מגרדים בעדינות את הצמחים מצלחת האגר ביד, ומניחים אותם בבקבוק מעוקר של מדיום MS נוזלי המכיל את גורם הלחץ. הצבת צמחים נוספים בבקבוק דומה ללא גורם לחץ כביקורת עשויה להיות נחוצה גם כן, בהתאם לאופי הניסוי.

מכסים את פי הצלוחיות בנייר כסף מעוקר ומאפשרים לצמחים לצמוח במשך יומיים נוספים על שייקר אורביטלי עם ניעור עדין. הכן שיפוע צפיפות רציף על ידי ערבוב ראשון של 13 מיליליטר פרקול, 13 מיליליטר של שני מאגר בידוד כלורופלסט וחמישה מיליגרם גלוטתיון בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. ואז צנטריפוגה את התערובת.

לאחר צנטריפוגה, טפל בצינור בזהירות כדי למנוע הפרעה לשיפוע, ושמור אותו על קרח לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, העבירו 100 מיליליטר של מאגר בידוד כלורופלסט לכל מצב לכוס של ליטר אחד. הסר את השתילים מהמדיום הנוזלי על ידי הטיית אותם למסננת.

לאחר מכן העבירו אותם לכוס המכילה מאגר בידוד כלורופלסט. שטפו את הרקמה עם המאגר כדי להסיר כל מדיום שנותר, ולאחר מכן החליפו את המאגר ב-100 מיליליטר של מאגר בידוד טרי. לסבב הראשון של הומוגניזציה, העבירו את רקמת הצמח לכוס של 50 מיליליטר ביד, ואפשרו למאגר הקודם להתנקז דרך האצבעות.

לאחר מכן הנח את הגשושית של הומוגנייזר הרקמות לתוך הרקמה והומוגניזציה בשתי פעימות של שנייה עד שתיים כל אחת. מסננים את ההומוגנאט דרך שתי שכבות של בד סינון לתוך צינור צנטריפוגה של 250 מיליליטר. סיים על ידי סחיטה עדינה של הבד.

שמור על הסינון והעביר את רקמת הצמח בחזרה לכוס של 50 מיליליטר. לאחר מכן הנח מאגר בידוד שני של 20 מיליליטר כלורופלסט לכוס של 50 מיליליטר והוסף את כל הרקמה שנותרה שלא הייתה בשימוש בסבב ההומוגניזציה הראשון. חזור על שלבי ההומוגניזציה והסינון ארבע פעמים נוספות.

צנטריפוגה ההומוגנית המאוגדת ב-1,000 פעמים גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש לשפוך את הסופרנטנט מיד לאחר הצנטריפוגה, תוך הקפדה לא להפריע לכדור. הנח את הצינור על קרח והשהה מחדש את הכדור בשאריות הסופרנטנט על ידי ערבוב עדין של הצינור.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה של פסטר כדי להעביר בעדינות את ההומוגנאט לחלק העליון של שיפוע הצפיפות הרציף המוכן מראש דרך דופן הצינור המקבל. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה והשיפוע ברוטור דלי מתנדנד ב -7, 800 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כשהבלם כבוי. בסיום, שימו לב לשתי הפסים הירוקים שניתן לראות בשיפוע.

השליכו את הרצועה העליונה, המכילה כלורופלסטים שבורים, והשתמשו בפיפטה של פסטר כדי להעביר את הרצועה התחתונה המכילה כלורופלסטים שלמים לצינור צנטריפוגה טרי של 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 25 מיליליטר של מאגר HMS לתוך הצינור, והפוך את הצינור פעמיים כדי לשטוף את הפרקול מהכלורופלסטים. לאחר מכן הנח את הצינור בחזרה לרוטור הדלי המתנדנד וגלגל מחדש את הכלורופלסטים.

שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הכדור במאגר השיורי על ידי ערבוב עדין של הצינור על קרח. הוסף עוד 100 עד 300 מיקרוליטר של מאגר HMS במידת הצורך, אך נסה לא לדלל את הדגימה יותר מדי. אחסן את הכלורופלסטים המרחפים על קרח.

התחל בהוספת חמישה מיקרוליטרים של הכלורופלסטים המבודדים ל-495 מיקרוליטר של מאגר HMS בצינור של 1.5 מיליליטר. הפוך את הצינור כדי לערבב בעדינות את התמיסה. לאחר מכן הניחו כיסוי על גבי תא הספירה של המציטומטר.

פיפטה לאט 40 עד 60 מיקרוליטר מתרחיף הכלורופלסט המדולל לתוך הפער שבין זכוכית הכיסוי לתא הספירה. באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, דמיין את הכלורופלסטים עם מטרה של פי 20. כלורופלסטים שלמים נראים עגולים ובהירים ומוקפים בהילה של אור.

לאחר מכן השתמש במטרה פי 10 למספר הכלורופלסטים ב-10 ריבועים גדולים. מספר הכלורופלסטים לריבוע גדול צריך להיות בממוצע בין 10 ל-30. אם קיימים מעט מדי או יותר מדי כלורופלסטים, התאם את גורם הדילול וחזור על ההליך.

ברגע שנמצא בטווח המתאים, חשב את מספר הכלורופלסטים למיליליטר כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. כדי להריץ מסלול זמן עם שלוש נקודות זמן, הכינו שלוש צינורות, כל אחת מכילה 130 מיקרוליטר של מאגר עצירת ייבוא, והשאירו אותם על קרח. בשפופרת של שני מיליליטר, הכינו את תגובת הייבוא המכילה את מאגר התגובה וחלבון מבשר עם תווית רדיו.

שים לב שצריכה להיות תגובה אחת לכל מצב שייבדק. השתמש בכ-10 מיליון כלורופלסטים לנקודת זמן. דגרו את צינור התגובה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס באמבט מים תחת כמות מוגבלת של אור.

מדי פעם יש להזיז את הצינורות כדי להשהות מחדש את הכלורופלסטים. לבצע מהלך זמן, עם 130 מיליליטר אליקוטטים מהתגובה בנקודות הזמן הנדרשות בתחום הייבוא הליניארי. מיד עם הנסיגה, העבירו כל 130 מיקרוליטר לצינור של מאגר עצירת ייבוא קר כקרח מעורבב על ידי הקשה עדינה על הצינור, והניחו את הצינורות על קרח עד להשלמת מהלך הזמן.

לאחר הסרת הדגימה האחרונה, צנטריפוגה את כל הדגימות למשך 30 שניות ב-12,000 פעמים גרם במיקרופוגה. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנטים והשעו מחדש את הכדורים ב-15 מיקרוליטר של שני x מאגר העמסת חלבון. לאחר מכן מערבבים את הדגימות על ידי מערבולת.

לבסוף, נתח את כל הדגימות, בתוספת בקרת קלט מבשר, באמצעות SDS-PAGE סטנדרטי ואוטורדיוגרפיה, פלואורוגרפיה או הדמיית זרחן. PsaD הוא רכיב של 18 קילודלטון במערכת הפוטו I המסונתז כמבשר גדול יותר של 23 קילודלטון. עיבוד לצורה הבוגרת של 18 קילו-דלטון מצביע על כך שהתרחש ייבוא לכלורופלסטים.

המוטציה sp1 של Arabidopsis שנחקרה כאן נושאת פגם בווסת חשוב של מנגנון ייבוא החלבון של הכלורופלסט, חלבון sp1. בתנאי לחץ, כמות ייבוא חלבון ה-PsaD לכלורופלסטים מוטנטיים sp1 גדלה ביחס לסוג הפראי, אך לא בתנאים רגילים שאינם מלחיצים. בעוד שצורת החלבון הבוגרת של PsaD הצטברה באופן תלוי זמן עם כלורופלסטים משני הגנוטיפים של הצמח, קצב הייבוא היה גבוה משמעותית עבור כלורופלסטים מוטנטיים sp1 מאשר עבור כלורופלסטים מסוג בר.

תוצאות אלו מרמזות על תפקיד חשוב לחלבון sp1 בוויסות יבוא חלבון כלורופלסט בתנאי עקה. לאחר שליטה, ניתן להשלים שיטה זו מבידוד הכלורופלסט ועד להשלמת בדיקת הייבוא תוך חמש עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את כל שלבי בידוד הכלורופלסט בארבע מעלות צלזיוס כדי להבטיח שהכלורופלסטים ישמרו על פעילות מקסימלית.

לאחר פיתוחו הראשוני לפני מספר עשורים, בדיקת ייבוא חלבון כלורופלסט במבחנה סללה את הדרך לחוקרים בתחום לחקור היבטים רבים ושונים של מנגנון ייבוא חלבון הכלורופלסט. הליטוש המוצג כאן מאפשר לחקור את ההשפעות של תנאי לחץ על יבוא חלבון. אל תשכח שעבודה עם חומר רדיואקטיבי דורשת טיפול מיוחד.

יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות בעת ביצוע הליך זה.