שיטה של המגזרים הישירים Intra-כבדית משלוח באמצעות מודל קלאמפ עכברוש הכבד hilar
2 באפריל 2017
מודל מהדק hilar כבד עכברוש ייחודי שפותח עבור הבוחנים את שפעת מולקולות תרופתיות לטיוב פגיע reperfusion-איסכמיה. מודל זה כולל cannulation ישיר של אספקת הפורטל למגזר הכבד איסכמי באמצעות סניף של וריד השער, המאפשר למסירה כבדה ישירה.
המטרה הכוללת של מודל ייחודי זה של מהדק הילר כבד חולדה היא לאפשר לחקור את ההשפעה של מולקולות פרמקולוגיות מעניינות בשיפור פגיעה באיסכמיה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השתלת הכבד לגבי אילו מולקולות ניתן להחדיר ישירות לכבד כדי לסייע בתיווך פגיעה באיסכמיה. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שהמולקולה המעניינת מוזרקת ישירות לווריד הפורטל, ומפחיתה את נפח ההפצה.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על השתלת כל האיברים, מכיוון שהיא מאפשרת בדיקה של מולקולות שעשויות להיות מתווספות לפרפוזה של איברים להפחתת פגיעה באיסכמיה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית בגלל גודלו הקטן של ענף וריד הפורטל המשמש לקנולציה. התחל באישור רמת ההרגעה המתאימה על ידי צביטת הבוהן, ולאחר מכן הנח את החולדה על כרית חימום מתחת למיקרוסקופ מנתח ורסן את הגפיים.
לאחר מכן, בצע חתך בעור הבטן בקו האמצע מהערווה לקסיפואיד, ואחריו חתך דומה בצפק לאורך הלינאה אלבה. היכנסו לבטן, הקפידו לא לפגוע בשלפוחית השתן או במעי, ושחררו את הכבד מהצפק מלפנים בסמוך לתהליך הקסיפואיד. בצע חתך רוחבי דרך העור והצפק בגבול התחתון של האונה הימנית של הכבד, והשתמש במהדק יתושים מעוקל כדי למשוך את תהליך ה-xiphoid.
השתמש במחזירי צלעות כדי לפתוח את הצלעות רחוק ככל האפשר מקו האמצע, ולחתוך את הרצועות הפלציפורמיות, הפרניות והקיבה. לאחר מכן השתמש בצמר גפן סטרילי לח כדי להפוך את הכבד כלפי מעלה ולחתוך רצועות נוספות לפי הצורך כדי לקבל גישה לפורטה. בעזרת גזה לחה מלוחה, סובב את הכבד באופן קרביים, ואז הסר את רקמת החיבור הרופפת המכסה את הילום הפורטל, ואת רקמת החיבור הרופפת המכסה את אורך וריד הפורטל.
בעזרת מלקחיים, דחפו דרך רקמת החיבור הרופפת האחורית לווריד הפורטל השמאלי, העורק וצינור המרה כדי ליצור חלון ולהקיף את הכלים באופן רופף בתפר 4-0 פוטס. לאחר מכן נקה את רקמת החיבור הרופפת המכסה את הענף האחורי לווריד הפורטלי בכליה הימנית. לאחר מכן, השתמש במזרק אינסולין כדי לשאוב 0.5 מיליליטר דם מהווריד הנבוב התחתון ולהעביר את הדם לבקבוקון קטן.
צנטריפוגה של הדגימה ואיסוף הנסיוב בבקבוקון חדש להקפאה מהירה בחנקן נוזלי. חותכים שתי חתיכות של תפר 7-0. הנח את לולאת ה-7-0 הראשונה סביב וריד הפורטל השמאלי רחוק ככל האפשר, והשתמש במהדק יתושים מעוקל כדי למשוך את הווריד.
הנח לולאה שנייה של 7-0 קשורה באופן רופף על הענף האחורי לווריד הפורטל ליד הצטלבותו עם וריד הפורטל. כעת, טען את משאבת העירוי במזרק של חמישה מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של ריאגנט במי מלח של 0.9%, והעמיס את הצינור. השתמש במהדק מיקרו-כירורגי כדי לאחוז בווריד הפורטלי הדיסטלי כדי להפחית את הדימום במהלך הקנולציה, והשתמש במספריים מיקרוכירורגיים קטנים כדי לחתוך חור של 0.5 מילימטר בווריד בין תפר השהייה 7-0 לבין הצטלבותו עם וריד הפורטל.
באמצעות צנתר 27-0, קננו את המערכת הוורידית של הפורטל השמאלי, והכניסו את הקטטר מעבר להתפצלות של ורידי הפורטל השמאלי והימני. יש להחדיר מיליליטר אחד של מי מלח רגילים כדי לאשר את מיקום הצינורית ולצפות באונות הצדדיות והאמצעיות השמאליות של הכבד להלבין. הערך ידנית שהקטטר עבר את ההמראה של וריד הפורטל הימני, אך לא מעבר להמראה של וריד הפורטל המזין את האונה החציונית, ואז כווץ את תפר הפוטס, אבטח את הקטטר עם תפר 7-0 והסר את המהדק מווריד הפורטל הדיסטלי.
התחל מיד בעירוי של שני מיליליטר של המגיב המעניין במשך 15 דקות, תוך ניטור רציף של הסימנים החיוניים של בעל החיים לאורך כל העירוי. שעה אחת מתחילת הזמן האיסכמי, הסר את תפר הפוטס ואת הקטטר, ואז הצמיד את תפר ה-7-0 על הענף האחורי לווריד הפורטלי. שעתיים לאחר תחילת הרפרפוזיה, שאבו לאט 0.5 מיליליטר דם מהווריד הנבוב התחתון, ואחריו העברת טפטוף איטית של הדם לבקבוקון חדש.
הפעל לחץ עדין כדי לעצור את הדימום מהווריד לפי הצורך. לאחר מכן צנטריפוגה את הדם והקפיא מחצית מהסרום לעיבוד במורד הזרם, כפי שהודגם זה עתה. בסיום הניסוי יש לחתוך את הסרעפת במעגל ולנתק כל רקמת חיבור נוספת שנותרה המחברת את הכבד לחלל הצפק.
אסוף את הכבד וקבל ארבע דגימות גדולות מהאונה השמאלית והאמצעית, וארבע דגימות גדולות מהאונה הימנית. לאחר מכן הנח את הדגימות בבקבוקונים מסומנים בודדים והקפיא את הרקמות בחנקן נוזלי לעיבוד במורד הזרם. מדידת אלנין אמינוטרנספראז בסרום בבעלי חיים מהודקים תמיסת מלח רגילה ו-PEG-SOD מדגימה הבדל משמעותי בין בקרת הסרום לרמות ביטוי אנזימי כבד בבעלי חיים ניסיוניים ב-120 דקות לאחר הרפרפוזיה.
ביטוי מלונדיאלדהיד רקמות באונה הימנית, שאינה הילרית, אינו מציג הבדל משמעותי בין קבוצת הביקורת לקבוצת הניסוי. עם זאת, המהדק השמאלי שלאחר ההילר ואונה הרפרפוזיה מדגימים רמה גבוהה משמעותית של ביטוי מלונדיאלדהיד ברקמות בהשוואה לאונה הלא מחודשת והלא מוזרקת, כמו גם לאונה הימנית המוחדרת PEG-SOD. אותו דפוס נצפה גם עבור ביטוי גלוטתיון ברקמות.
ניתוח כתמים מערביים מצביע על רמה מוגברת של ביטוי קספאז-3 שסוע באונה השמאלית לאחר מהדק הילר ורפרפוזיה שיורדת בבעלי חיים שטופלו בעירוי PEG-SOD, הבדלים שאושרו כמשמעותיים על ידי דנסיטומטריה. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שלוש שעות ו -30 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשיג מתיחה משמעותית על ענף וריד הפורטל לקנולציה בעת הנחת מהדק וריד הפורטל הדיסטלי.
לאחר שליטה בהליך זה, ניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההשפעה של מגוון חומרים פרמקולוגיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשרוף את מערכת הוורידים של הפורטל השמאלי.
סקירה כללית
מאמר זה מציג מודל ייחודי של תסמיך (clamp) של קשרי הליבר (hilar clamp) בכבד של חולדה, שנועד לבחון את השפעותיהם של מולקולות פרמקולוגיות על פגיעת איסכמיה-רפרפוזיה. המודל מאפשר הובלה ישירה של חומרים לכבד דרך הווריד הפורטלי, ובכך מסייע למחקר ממוקד בתחום השתלת כבד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- פרמקולוגיה
- השתלת כבד
רקע
- פגיעת איסכמיה-רפרפוזיה היא סוגיה קריטית בהשתלות כבד.
- הבנת התערבויות פרמקולוגיות יכולה לשפר את תוצאות ההשתלה.
- שיטות של עירוי ישיר יכולות להגביר את היעילות של סוכנים טיפוליים.
- הדגמה חזותית של טכניקות כירורגיות חיונית לשחזור הניסוי.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל לבחינת סוכנים פרמקולוגיים בפגיעה כתוצאה מאיסכמיה-רפרופוזיה של הכבד.
- הערכת ההשפעות הישירות של מולקולות שהוזרקו על בריאות הכבד.
- אספקת מתודולוגיה הניתנת ליישום בתרחישים אחרים של השתלת איברים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מודל של סגירת קשרי השער בכבד של חולדה עם קנולציה של הווריד הפורטלי.
- עירוי ישיר של חומרים פרמקולוגיים אל הווריד הפורטלי.
- ניטור של סימנים חיוניים במהלך תהליך העירוי.
- איסוף וניתוח של דגימות סרום ורקמות לאחר reperfusion.
תוצאות עיקריות
- הבדלים משמעותיים ברמות alanine aminotransferase בנסיוב לאחר הטיפול.
- ביטוי מוגבר של malondialdehyde ברקמות באונות כבד מטופלות.
- ניתוח Western blot הראה שינוי ברמות cleaved caspase-3.
- הוכח הפוטנציאל של חומרים פרמקולוגיים להפחית את הפגיעה.
מסקנות
- מודל תסניר הילום של כבד חולדה יעיל לחקר פגיעת איסכמיה-רפרפוזיה.
- טכניקות של עירוי ישיר יכולות להגביר את היעילות הטיפולית.
- הממצאים עשויים להנחות אסטרטגיות עתידיות בהשתלת איברים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל זה של קליבת הילום בכבד של חולדה מאפשר הובלה ממוקדת של חומרים פרמקולוגיים למקטעים כבדיים איסכמיים, ובכך מפחית את החשיפה הסיסטמית ומשפר את התובנה המכניסטית לגבי פגיעה בשל איסכמיה-reperfusion. על ידי מתן אפשרות להזרקה ישירה למערכת הוורידית הפורטלית, השיטה תומכת בהערכה פרה-קלינית של תרכובות ציטופרוטקטיביות עם יחס אות לרעש משופר בנקודות קצה ספציפיות לרקמה. גישה זו מסייעת בהפחתת הסיכונים של מועמדים מובילים להשתלת כבד ואסטרטגיות אחרות של פרפוזיה של איברים, על ידי בידוד ההשפעות הכבדיות מגורמים סיסטמיים מבלבלים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקת היפותזות טיפוליות על ידי הזרקה ישירה של תרכובות לבדיקה לאונה האיסכמית של הכבד, ובכך מבהיר מנגנוני פעולה תלויי-מטרה.
- ערך תפעולי: מפחית את נפח התרכובת הנדרש וממזער השפעות חוץ-מטרה, ובכך משפר את רגישות הבדיקה ואת הספציפיות למטרה.
- ערך תרגומי: תומך בתיקוף מטרה במודל I/R הרלוונטי למחלה, ובכך מגביר את הביטחון ברלוונטיות הפתופיזיולוגית לפני מעבר למינים גדולים יותר.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת תוצאות ביוכימיות כמותיות, כגון רמות serum ALT ו-tissue MDA, המאפשרות סריקה סטנדרטית של תרכובות לבדיקת פעילות הגנה על הכבד (hepatoprotective).
- שחזוריות: המודל הכירורגי מספק דפוסי פגיעה איסכמית עקביים, התומכים בהערכות אמינות של תגובה למינון בין סדרות ניסיוניות שונות.
- מדרגיות: ברגע שהפרוצדורה נלמדת, היא מאפשרת בדיקה חוזרת של סוכנים פרמקולוגיים מרובים באופן מבוקר וספציפי לסגמנט.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה איסכמיה חמה קלינית במהלך השגת איברים והשתלה, ובכך מספק מודל ניבוי לפגיעה ולשיבוש בתפקוד השתל.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשר הערכה של חומרים נוגדי חמצון ונוגדי אפופטוזיס (למשל, PEG-SOD) על סמנני פגיעה מרכזיים כגון cleaved caspase-3 ופרוקסידציה של ליפידים.
- המשכיות פרה-קלינית: מקל על אופטימיזציה של מועמדים מובילים על ידי קישור בין מעורבות המטרה בכבד לתוצאות תפקודיות של שחרור אנזימים ועקה חמצונית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
המודל משתלב ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ובכך הוא מאפשר סריקה מכניסטית בשלב מוקדם של חומרים ציטופרוטקטיביים לפני ביצוע פרופיל פסיקו-פרמקולוגי או רעילויות רחב יותר.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהבהרת מסלולים ובתיקוף מטרות על ידי בידוד השפעות התרופה למקטע הכבדי העובר פגיעת I/R.
- סקר (Screening): מאפשר הערכה סטנדרטית של יעילות תרכובות באמצעות פלטים מדידים כמו שחרור ALT והיווצרות MDA.
- אנליטיקה: מספק קריאות מרובות (אנזימטיות, חמצוניות, אפופטוטיות) להשוואת מנגנוני הפעולה ועוצמת התרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הגנה כבדית לתוצאות רלוונטיות להשתלה, ובכך תומך בהחלטות go/no-go עבור אסטרטגיות לשימור איברים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להשתמש בפלטפורמה הכירורגית שוב במספר קמפיינים של בדיקת תרכובות, מה שממקסם את ה-ROI על פיתוח המודל והכשרת המפעיל.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי הפחתת השונות הפרמקוקינטית והתמקדות בפרמקודינמיקה ספציפית לכבד.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות גישה וסקולרית ופרפוזיה סגמנטלית סטנדרטיות, תוך מזעור השונות בין בעלי החיים.
- ערך אסטרטגי: מגביר את היעילות בזיהוי מועמדים מובילים (leads) על ידי מתן אפשרות לבדיקה מהירה של קשר מבנה-פעילות (SAR) בהקשר פתופיזיולוגי רלוונטי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של מועמדים ציטופרוטקטיביים לתוכניות השתלה, באמצעות אספקת נתונים מכניסטיים ונתוני יעילות בשלבים מוקדמים של הגילוי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בקנולציה וסקולרית מיקרו-כירורגית ובאנטומיה של כבד מכרסמים.
- תלות במכשור מדויק הכולל מיקרו-מזרקים, תפרי סיב דקים ומערכות הגדלה.
- מחייב טיפול פרי-אופרטיבי סטנדרטי, כולל שמירה על הטמפרטורה וניטור סימנים חיוניים.
- התאמה לאונות או לאיברים אחרים עשויה לדרוש מיפוי אנטומי מחדש והתאמה של גודל כלי הדם.
- מגבלות מעשיות כוללות מורכבות טכנית ותלות במבצע, אשר עלולות להשפיע על השחזור בין מעבדות ללא הכשרה קפדנית.
