לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של D. discoideum שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

המטרה הכוללת של טכניקת הדמיה זו היא לצפות בהפרעות תאיות הנגרמות על ידי מתח חום בתאי Dictyostelium discoideum. שיטה זו יכולה לעזור להבין את המנגנונים של תגובת עומס חום ובקרת איכות חלבון באמבה Dictyostelium discoideum. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בקרה הדוקה ומדויקת על הטמפרטורה המופעלת על הדמיית הקובץ של התאים.

כדי להתחיל בהליך, הכן תאי דיקטיוסטליום כמפורט בפרוטוקול הטקסט. יום לפני ההדמיה, פיצלו את התאים למדיום פלואורסצנטי נמוך ל-10,000 תאים למיליליטר. לפני ההדמיה, קצרו את התאים מצלחת הרקמה ב-LFM, ולאחר מכן העבירו מספר מספיק של תאים לכלי זכוכית תחתונים.

הניחו לתאים להתיישב במשך 20 דקות ואז החליפו בזהירות את המדיום המשומש במדיום טרי, כדי להסיר תאים לא מיושבים. תאי תמונה בתנאים לא מלחיצים ב-23 מעלות צלזיוס, רוכשים מינימום של שישה שדות ראייה. רכוש ערימות Z של מקסימום שבעה מיקרומטר בצעדים של 1 עד 0.25 מיקרומטר כדי ללכוד את כל נפח התא.

לאחר מכן רכוש תמונת שדה בהיר התייחסות כדי להעריך את המספר הכולל של התאים. לאחר מכן, התאם את הטמפרטורה של תא הקירור ל -30 מעלות צלזיוס. לאחר שתצוגת הטמפרטורה הגיעה לערך הרצוי, התמקד מחדש באופן ידני בערוץ השדה הבהיר.

בדוק את כל ה-FOVs המוקלטים לפני תחילת ה-Time-lapse, ולאחר מכן התחל זמן-lapse לארבע שעות של מתח חום עם מרווח זמן של חמש עד 10 דקות בין נקודות זמן. בדוק כדי לוודא שהמיקוד נכון במהלך רכישת שתי נקודות הזמן הראשונות. לאחר השלמת מתח החום, הפחיתו את הטמפרטורה בחזרה ל-23 מעלות צלזיוס.

המתן עד שתצוגת הטמפרטורה תתכוונן ותמקד מחדש באופן ידני. לאחר מכן הקלט סרטוני דולג זמן בשלב השחזור למשך שמונה עד 10 שעות במרווחי זמן של 10 עד 20 דקות. בדוק כדי לוודא שהמיקוד נכון במהלך רכישת נקודת הזמן הראשונה.

התחל בפתיחת חבילת עיבוד התמונה המצוידת בתוסף Cell Counter. טען את אוסף תמונות השדה הבהיר על-ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן על פתח. לאחר מכן, פתח את התוסף Cell Counter, טען את אוסף התמונות על ידי לחיצה על Initialize.

בחר את סוג המונים על-ידי לחיצה על התיבה המתאימה. לאחר מכן, ספור את מספר התאים הכולל, שמור את הסמנים על ידי לחיצה על שמור סמנים. לאחר שמירת הסמנים, טען את ההקרנה המקסימלית של ההיפר-סטאק של תמונת הקרינה.

פתח את התוסף Cell Counter וטען את הסמנים על-ידי לחיצה על Load Markers. לאחר מכן, בחר את סוג הסמן עבור מוקדים ציטוזוליים וספור את התאים. הסמנים הקיימים יכולים לשמש כהנחיה למיקום של תאים בודדים.

אחזר את מספר הספירה לפרוסה על ידי לחיצה על תוצאות, ולאחר מכן שמור את הספירה במקום אחר לחישובים נוספים. במחקר זה, התפלגות חלבון הפוליגלוטמין Q103 המתויג GFP נצפתה בתאי דיקטיוסטליום. בתנאי גידול רגילים, Q103-GFP מופץ באופן מפוזר בציטופלזמה.

במהלך עומס חום, סמן Q103-GFP מתלכד כדי לנקב מבנים. עם שחרור מתח וצמיחה בתנאי גידול רגילים, מבנים אלה מתמוססים. החלוקה מחדש של Q103-GFP והיווצרות מוקדים ציטוזוליים המושרים על ידי מתח חום מכומתת באמצעות ניתוח תמונה.

את התוצאות המייצגות של תגובת מתח החום ניתן לראות כאן. מספר התאים עם מוקדי Q103-GFP ציטוזוליים גדל במספרם עם עקת חום מתמשכת. במהלך עומס חום, מערכת בקרת איכות החלבון מוצפת, ולכן לא ניתן לשמור על חלבונים המועדים לצבירה במצב מסיס.

לאחר מתח חום, מספר התאים עם מוקדים ציטוזוליים פוחת, מה שמרמז על כך שהחלבונים המצטברים מתמוססים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנטר הפרעות הנגרמות על ידי מתח חום באמבה Dictyostelium discoideum. במהלך ההדמיה, חשוב לזכור לוודא שהמיקוד מותאם כראוי, אם למיקרוסקופ שלך אין פוקוס אוטומטי של חומרה.

ניתן להשתמש בבקרת הטמפרטורה המוצגת בפרוטוקול זה מעבר לתחום תגובת מתח החום. הדמיה בתנאי גידול רגילים באמצעות בקרת טמפרטורה יכולה להפחית באופן משמעותי את ההשפעות הפוטוטוקסיות.