לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של
2 בדצמבר 2016
האמבות החברתיות Dictyostelium discoideum הוקמה לאחרונה כמערכת לחקר קיפול שגוי של חלבונים ופרוטאוסטזיס. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה חדשה מבוססת הדמיה לחקר צבירת חלבונים המושרה על ידי טמפרטורה ותגובת הלחץ התאית ב-D. discoideum.
המטרה הכללית של טכניקת דימוג זו היא לצפות בשיבושים תאיים המושרים על ידי עקה תרמית בתאי Dictyostelium discoideum. שיטה זו עשויה לסייע בהבנת המנגנונים של התגובה לעקה תרמית ובקרת איכות חלבונים באמבה Dictyostelium discoideum. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא השליטה ההדוקה והמדויקת בטמפרטורה המופעלת על התאים במהלך הדימוג.
כדי להתחיל את הפרוצדורה, הכין תאי Dictyostelium כמפורט בפרוטוקול הטקסט. יום לפני הדימיג', פצל את התאים למצע עם פלואורסצנציה נמוכה (LFM) בריכוז של 10,000 תאים למילליליטר. לפני הדימיג', קצור את התאים מלוח הרקמה ב-LFM, ולאחר מכן העבר מספר מספיק של תאים לצלחות בעריסה מזכוכית.
אפשרו לתאים לשקוע במשך 20 דקות, ולאחר מכן החליפו בזהירות את המצע המשומש במצע טרי, כדי להסיר תאים שלא שקעו. צלמו את התאים בתנאים ללא עקה בטמפרטורה של 23 °C, ורכשו לפחות שישה שדות ראייה. רכשו Z-stacks בעומק מקסימלי של 7 µm במדרגות של 1 עד 0.25 µm כדי ללכוד את כל נפח התא.
לאחר מכן, רכשו תמונת ייחוס בשדה בהיר (bright field) כדי להעריך את מספר התאים הכולל. בשלב הבא, כוונו את הטמפרטורה של תא הקירור ל-30 °C. לאחר שתצוגת הטמפרטורה תגיע לערך הרצוי, בצעו מיקוד מחדש באופן ידני בערוץ השדה בהיר.
בדקו את כל שדות הראייה (FOVs) שהוקלטו לפני תחילת צילום ה-time-lapse, ולאחר מכן התחילו צילום time-lapse למשך ארבע שעות של עקת חום עם מרווח זמן של 5 עד 10 דקות בין נקודות הזמן. ודאו כי המיקוד נכון במהלך רכישת שתי נקודות הזמן הראשונות. לאחר סיום עקת החום, החזירו את הטמפרטורה ל-23 degrees Celsius.
המתינו עד שתצוגת הטמפרטורה תתעדכן ובצעו מיקוד מחדש באופן ידני. לאחר מכן, הקליטו סרטוני time-lapse בשלב ההתאוששות למשך שמונה עד 10 שעות במרווחי זמן של 10 עד 20 דקות. ודאו שהמיקוד נכון במהלך רכישת נקודת הזמן הראשונה.
התחילו בפתיחת חבילת עיבוד התמונות המצוידת בתוסף Cell Counter. טענו את סדרת תמונות השדה המואר על ידי לחיצה על File ולאחר מכן Open. לאחר מכן, פתחו את תוסף ה-Cell Counter וטענו את סדרת התמונות על ידי לחיצה על Initialize.
בחרו את סוג הסופרים על ידי לחיצה על התיבה המתאימה. לאחר מכן, ספרו את מספר התאים הכולל ושמרו את הסימונים על ידי לחיצה על Save Markers. לאחר שמירת הסימונים, טענו את ההקרנה המקסימלית (maximum projection) של ה-hyperstack של תמונת הפלואורסצנציה.
פתחו את תוסף ספירת התאים (Cell Counter) וטענו את הסמנים על ידי לחיצה על Load Markers. לאחר מכן, בחרו את סוג הסמן עבור מוקדי ציטוזול (cytosolic foci) וספרו את התאים. ניתן להשתמש בסמנים קיימים כהנחיה למיקומם של תאים בודדים.
שלוף את מספר הספירות לכל פרוסה על ידי לחיצה על Results, ולאחר מכן שמור את הספירות במקום אחר לצורך חישובים נוספים. במחקר זה, נבחנה התהלוּת של חלבון polyglutamine המסומן ב-GFP, מסוג Q103, בתאי Dictyostelium. בתנאי גדילה רגילים, Q103-GFP מופץ באופן דיפוזי בציטופלזמה.
במהלך עקה תרמית, סמן ה-Q103-GFP מתגבש למבנים נקודתיים. עם הפסקת העקה וגידול בתנאי צמיחה רגילים, מבנים אלה מתפזרים. את חלוקתו מחדש של Q103-GFP ואת היוו terbentuk של מוקדים ציטוזוליים המוּשְׁטָעִים על ידי עקה תרמית מקימים באמצעות ניתוח תמונות.
ניתן לראות כאן את התוצאות המייצגות של התגובה למעקה חום. מספר התאים עם מוקדי Q103-GFP ציטוזוליים עולה עם המשך מעקה החום. במהלך מעקה חום, מערכת בקרת האיכות של החלבונים מוצפת, ולכן חלבונים הנוטים להתקבץ אינם יכולים להישמר במצב ממיס.
לאחר עקה תרמית, מספר התאים עם מוקדי ציטוזול פוחת, מה שמרמז כי החלבונים המצטברים מתפנים. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להחזיק בהבנה טובה של האופן שבו ניתן לנטר שיבושים המושראים על ידי עקה תרמית באמבה Dictyostelium discoideum. לאורך תהליך ההדמיה, חשוב לזכור לוודא שהמיקוד מכוון כראוי, במידה ומיקרוסקופכם אינו כולל מערכת מיקוד אוטומטית בחומרה.
ניתן להשתמש בבקרת הטמפרטורה המוצגת בפרוטוקול זה גם מעבר לתחום התגובה למעקה חום. דימוי בתנאי צמיחה רגילים תוך שימוש בבקרת טמפרטורה עשוי להפחית באופן משמעותי השפעות פוטוטוקסיות.
סקירה כללית
מחקר זה מציג מתודולוגיית דימוג חדשנית לבחינת אגרגציה של חלבונים והשפעות מאמץ תאי המושרות על ידי טמפרטורה באמבה החברתית Dictyostelium discoideum. הטכניקה מאפשרת בקרת טמפרטורה מדויקת, המאפשרת לחוקרים לצפות בהשפעות של מאמץ חום על בקרת האיכות של חלבונים.
מרכיבים מרכזיים במחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- אגרגציה של חלבונים
רקע
- Dictyostelium discoideum משמש כאורגניזם מודל לחקר תגובות תאיות למעיקה.
- הבנת קיפול שגוי של חלבונים חיונית להשגת תובנות לגבי מחלות שונות.
- מעיקה תרמית עלולה להוביל לאגרגציה של חלבונים, ובכך להשפיע על התפקוד התאי.
- טכניקות דימות חיוניות לצפייה בזמן אמת בתהליכים תאיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לצפייה בשיבושים תאיים המושרים על ידי עקה תרמית.
- הבהרה של מנגנוני התגובה לעקה תרמית ב-D. discoideum.
- הערכת היעילות של בקרת איכות חלבונים בתנאי עקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תאי Dictyostelium במצע בעל פלואורסצנציה נמוכה.
- דימוי תחת טמפרטורות מבוקרות (23°C ו-30°C).
- דימוי Time-lapse למעקב אחר תגובות תאיות לאורך מספר שעות.
- ניתוח תמונות לכימות אגרגציה והתאוששות של חלבונים.
תוצאות עיקריות
- חלבון Q103-GFP הראה התפלגות דיפוזית בתנאים רגילים.
- במהלך עקה תרמית, Q103-GFP יצר מבנים נקודתיים המעידים על אגרגציה.
- לאחר העקה, מספר התאים עם אגרגטים פחת, מה שמרמז על התאוששות.
- השיטה הדגימה בהצלחה את הדינמיקה של אגרגציה ופירוק של חלבונים.
מסקנות
- טכניקת הדימיון מספקת תובנות לגבי תגובות למעקה תאי.
- בקרת טמפרטורה היא קריטית לצפייה מדויקת בדינמיקה של חלבונים.
- ניתן להחיל מתודולוגיה זו על תחומים אחרים של מחקר על מעקה תאי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי תאים חיים תחת בקרת טמפרטורה ב-Dictyostelium discoideum מאפשר בחינה מדויקת של מנגנוני בקרת איכות של חלבונים תחת עקה, ובכך תומך בתיקוף מטרות בשלב מוקדם עבור נתיבים של אגרגציה של חלבונים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במחקרים מכניסטיים הרלוונטיים לניוון עצבי ולפרוטאוסטזיס. יכולתה של השיטה להפחית פוטוטוקסיות ולהכמיס אגרגציה דינמית של חלבונים מספקת תובנות יישומיות למיון פורטפוליו בביולוגיה של גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תצפית ישירה על דינמיקה של אגרגציה של חלבונים במודל חי המגיב למעמדות (stress).
- תומך בהסרה של סיכונים מכניסטיים על ידי כימות תגובות תאיות למעמדות פרוטאו-טוקסי הנגרם מחום.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות לבקרת איכות חלבונים הרלוונטיות להפרעות אגרגציה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פרוטוקול דימות מתוקף לכימות אירועי אגרגציה והמסה של חלבונים.
- מפחית פוטוטוקסיות, מה שמאפשר עוצמות דימות גבוהות יותר עבור חלבונים בעלי ביטוי נמוך.
- תומך בקריאות כמותיות הניתנות לשחזור, המתאימות לתהליכי סינון (screening) בהמשך הדרך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם למנגנונים הרלוונטיים למחלה של קיפול שגוי של חלבונים ואגרגציה.
- מאפשר רציפות ממחקרי מנגנון בשלב הגילוי ועד לפיתוח מודלים פרה-קליניים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון עבור תרופיות המכוונות לצבירה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פרוטוקול הדמיה זה משתלב ברצף הגילוי, החל ממחקרי מנגנון מוקדמים ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות לצבירה של חלבונים.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמתה אגרגציה של חלבונים המושרית על ידי עקה תרמית, ובכך מבהירה מסלולים של פרוטאוסטזיס.
- סריקה: מספקת מדדי אגרגציה כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מספקת ספירה ברמת התא של אירועי אגרגציה ודינמיקת התאוששות.
- מחקר תרגומי: ממדלת תגובות לעקה הרלוונטיות למחלות לצורך התאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פרוטוקול סטנדרטי וניתן להתאמה למגוון מחקרי בקרת איכות של חלבונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות עבור מסלולי אגרגציה של חלבונים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות דימות ואנליזה סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים ומכניסטיים על פרוטאוסטזיס.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בתעדוף מותאם סיכון של תוכניות המכוונות לאגרגציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימיון תאים חיים ובניתוח תמונות כמותי.
- מחייב מיקרוסקופיה עם בקרת טמפרטורה ותוכנת ניתוח תואמת.
- מצריך סטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרמטרי הדמיון ופירוש הנתונים.
- ניתן להתאמה למודלים אחרים של חלבונים הנוטים לאגרגציה באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- ניידות תאים גבוהה ורגישות לפוטוטוקסיות מחייבות תכנון ניסויי קפדני.
