Name: קביעת פני התא יחסית והביטוי סהכ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: למדו לכמת ביטוי חלבוני קרום על פני תאים בשיטת cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של תאים חיים לחקר ערבוביות לבביות ותעלות יונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למר סרג' סנשל ולד"ר ז'אק ת'יבודו על שיתוף המומחיות שלהם והענקת גישה לפלטפורמת הזרימה ומיון התאים שלהם. עבודה זו הושלמה עם מענק תפעולי 130256 מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות, מענק סיוע מקרן הלב והשבץ הקנדית, ותמיכה מ-"Fondation de l'Institut de Cardiologie de Montréal" ל-L.P.

<ol><li>Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Cardiac+Arrhythmias%3A+Ion+Channel+Protein+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking.</a> Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).</li>
<li>Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correctors+of+the+basic+trafficking+defect+of+the+mutant+F508del-CFTR+that+causes+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).</li>
<li>Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+Mutated+Cardiac+Ion+Channels+in+Inherited+Arrhythmia+Syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovas+Pharm%22%5BJournal%5D)">Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes.</a> J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).</li>
<li>Gargus, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+Monogenic+Channelopathies+and+Their+Implications+for+Complex+Polygenic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease.</a> Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).</li>
<li>Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+channelopathies%3A+Genetic+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms.</a> Gene. 517, 1-11 (2013).</li>
<li>Behr, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sudden+arrhythmic+death+syndrome%3A+familial+evaluation+identifies+inheritable+heart+disease+in+the+majority+of+families%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families.</a> Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).</li>
<li>Catterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+regulation+of+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels.</a> Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).</li>
<li>Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+is+the+Ca2%2B+sensor+for+Ca2%2B+-dependent+inactivation+of+L-+type+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels.</a> Neuron. 22, 549-558 (1999).</li>
<li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+diversity%3A+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Opin.Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li>
<li>Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+assemblies+and+localized+regulation+of+voltage-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels.</a> Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).</li>
<li>Gao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+subcellular+localization+of+the+subunits+of+L-type+calcium+channels+and+adenylyl+cyclase+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes.</a> J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).</li>
<li>Carl, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+of+sarcolemmal+dihydropyridine+receptor+and+sarcoplasmic+reticular+triadin+and+ryanodine+receptor+in+rabbit+ventricle+and+atrium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium.</a> J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).</li>
<li>Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+Channel+Macromolecular+Complexes+in+Cardiomyocytes%3A+Roles+in+Sudden+Cardiac+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death.</a> Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).</li>
<li>Bourdin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Determinants+of+the+Cavb-induced+Plasma+Membrane+Targeting+of+the+Cav1.2+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel.</a> J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).</li>
<li>Raybaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+GX9GX3G+Motif+in+the+Gating+of+High+Voltage-activated+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels.</a> J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).</li>
<li>Burashnikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+cardiac+L-type+calcium+channel+associated+with+inherited+J-wave+syndromes+and+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death.</a> Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).</li>
<li>Hennessey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CACNA1C+Variant+Associated+with+Reduced+Voltage-Dependent+Inactivation%2C+Increased+Cav1.2+Channel+Window+Current%2C+and+Arrhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis.</a> PLoS ONE. 9, e106982(2014).</li>
<li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: basic principles and applications.</a> Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).</li>
<li>Graham, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Coulter+Principle%3A+Foundation+of+an+Industry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">The Coulter Principle: Foundation of an Industry.</a> J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).</li>
<li>Rothe, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRothe%2C+G+%22Cellular+Diagnostics.+Basics%2C+Methods+and+Clinical+Applications+of+Flow+Cytometry%22">Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry</a>. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. , Karger. Basel. 53-88 (2009).</li>
<li>Bourdin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+of+Cavalpha2delta+Mutations+Associated+with+Sudden+Cardiac+Death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death.</a> J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).</li>
<li>Tetreault, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glycosylation+sites+essential+for+surface+expression+of+the+Cavalpha2delta1+subunit+and+modulation+of+the+cardiac+Cav1.2+channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity.</a> J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).</li>
<li>Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Transfection+Strategy+for+Expression+and+Electrophysiological+Recording+of+Recombinant+Voltage-Gated+Ion+Channels+in+HEK-293T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Immunol%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).</li>
<li>Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quartet+of+Leucine+residues+in+the+Guanylate+Kinase+domain+of+Cavbeta+determines+the+plasma+membrane+density+of+the+Cav2.3+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel.</a> J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).</li>
<li>Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-+and+antagonist-induced+up-regulation+of+surface+5-HT3A+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors.</a> Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).</li>
<li>Hoffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+tetracysteine-tagged+proteins+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells.</a> Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).</li>
<li>Cockcroft, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCockcroft%2C+CJ+%22Ion+Channels%3A+Methods+and+Protocols%22">Ion Channels: Methods and Protocols</a>. Gamper, N. , Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).</li>
<li>Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Src+Homology+3+Domain+of+the+beta-Subunit+of+Voltage-gated+Calcium+Channels+Promotes+Endocytosis+via+Dynamin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction.</a> J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).</li>
<li>Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+photoaffinity+labeling+of+receptor+sites+for+the+Calcium+channel+inhibitors+d-cis-diltiazem%2C+%28%2B%2F-%29-bepridil%2C+desmethoxyverapamil%2C+and+%28%2B%29-PN+200-110+in+skeletal+muscle+transverse+tubule+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes.</a> J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).</li>
<li>Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+voltage+sensor+in+voltage-dependent+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.Rev%22%5BJournal%5D)">The voltage sensor in voltage-dependent ion channels.</a> Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).</li>
<li>Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variance+of+sodium+current+fluctuations+at+the+node+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier.</a> J Physiol. 307, 97-129 (1980).</li>
<li>Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+PCMBS-dependent+modification+of+KCa3.1+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating.</a> J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).</li>
<li>Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Image+Colocalization+and+Its+Statistical+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance.</a> Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).</li>
<li>Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+subcellular+protein+fractions+from+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart.</a> Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li>
<li>Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+light+on+ion+channel+imaging+by+total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).</li>
<li>Wible, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HERG-Lite-R%3A+A+novel+comprehensive+high-throughput+screen+for+drug-induced+hERG+risk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).</li>
<li>Wilde, A. A. M., Brugada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypical+Manifestations+of+Mutations+in+the+Genes+Encoding+Subunits+of+the+Cardiac+Sodium+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel.</a> Circ. Res. 108, 884-887 (2011).</li>
<li>Milano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sudden+Cardiac+Arrest+and+Rare+Genetic+Variants+in+the+Community%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Cardiovasc+Genet%22%5BJournal%5D)">Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community.</a> Circ Cardiovasc Genet. , (2016).</li>
<li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Assay cytometry מבוסס זרימה זו יושם בהצלחה על מדידת רמות פן כולל ותא היחסיים של fluorescently שכותרתו יוצרי הנקבוביות הקשורים יחידות המשנה של ערוצי סידן מגודר מתח 14,22,26. עדיף להשתמש כאשר חוקרים את ההשפעה של מוטציות גנטיות וכך מחייב כי עוצמת הקרינה הפנימית של המבנה fluorescently שכותרתו מתויג wild-type להיות לפחות 10 עד פי 100 גדול יותר עבור עוצמת הקרינה של לבנות מתויגות שכותרתו fluorescently . במקרה המסוים הזה, לבנות mCherry-Ca V α2δ1-HA המתואר כאן הניב או...

מאמר זה מספק assay אמין לדווח הביטוי שטח פני התא היחסי של חלבונים בממברנה כגון תעלות יונים לידי ביטוי בתאים רקומביננטי באמצעות טכנולוגית cytometry הזרימה הקיימת. תעלות יונים הן חלבונים בממברנה נקבוביים יוצרים שאחראים לשליטת אותות חשמליים על ידי gating את זרימת יונים על פני קרום התא. הם מסווגים על ידי מנגנון הפעלה, טבע, סלקטיביות של מינים יון העוברים דרך הנקבוביות שבו הם נקודתיים. ברמה התאית ורקמות, והנתיבים יון מקרוסקופית דרך תעלות יונים הם תוצר של biophysical (gating ו חלחול), ביוכימיות (זירחון), ו biogenesis (סינתזה, glycosylation, סחר, השפלה) נכסים 1. כל התהליכים הללו הוא ייחודי לכל סוג של תעלות יונים, והוא מותאם למלא את התפקיד הפיזיולוגי של ערוץ יון. כתוצאה מכך, שינויים בכל תהליכים המכוילים אלה באמצעותבירושה או הנדסה גנטית, המכונה לעתים קרובות &quot;channelopathy&quot;, יכול להיות מזיק הומאוסטזיס תא. חשוב להדגיש, כי מסירת הסכום &quot;הנכון&quot; של תעלות יונים על פני התא היא קריטית הומאוסטזיס תא. גם עליות קטנות (רווח של פונקציה) וירידה קטנה (הפסד של פונקציה) בפעילות ערוץ יון יש פוטנציאל לגרום פתולוגיה רצינית לאורך החיים. פגמי המשלוח פני התא של תעלות יונים בוגרות הוא הקובע חשוב channelopathies רב, כגון סיסטיק פיברוזיס (ערוץ יון CFTR) 2 ו הפרעות בקצב לב של טופס תסמונת QT הארוך (תעלות אשלגן לב) 3. Channelopathies המשויכים מוות פתאומי של הלב 4. שהשכיחות העולמית הנוכחית של כל channelopathies הלב נחשב לפחות 1: 2,000-1: 3,000 לנפש 5 ואחראים כמחצית ca למוות קרדיאלי פתאומי בקצב לא סדירses 6. תפקוד לקוי של נתרן מתח מגודר לב, potassium-, ו בסידן תעלות יונים סלקטיבי ידועות לשחק תפקיד מרכזי בתהליך זה. The L-סוג Ca V 1.2 תעלות סידן מתח מגודרת נדרש ליזום התכווצות שריר הלב מסונכרן. הלב L- סוג Ca V 1.2 ערוץ הינו קומפלקס חלבון רב-למקטע מורכב למקטע α1 הראשי יוצרי הנקבוביות Ca V ו- CA V SS ו- CA V α2δ1 יחידות משנה עזר 7-12. ראוי לציין, כי ההשלמה המלאה של יחידות משנת עזר נדרשת לייצר ערוצי Ca V 1.2 פעילות לפי קרום הפלזמה ואינטראקציות דינמיות בין יחידות המשנה אלה חיוניות כדי לתמוך בפונקציה החשמלית הרגילה של הלב 13. Ca V SS מקדם את הביטוי על פני קרום התא של Ca V 1.2 ערוצים באמצעות אינטראקציה הידרופובי nanomolar הלא קוולנטיים 14. שיתוף ביטוי של wi למקטע Ca V α2δ1ה Ca V SS הנכנס Ca V α1 מגרה ביטוי השיא הנוכחי (5 עד פי 10) ומקדם ההפעלה ערוץ במתח שלילי יותר. קבל של פונקצית מוטציות של למקטע יוצרי הנקבוביות Ca V 1.2 נקשר עם צורה של הפרעות קצב חדריות שנקראת תסמונת QT הארוך 15 בעוד שורה של מוטציות נקודתיות בשלוש היחידות משנה הראשיים להרכיב ערוץ L- סוג Ca V 1.2 זוהה במקצועות הסובלים הפרעות קצב של טופס תסמונת QT הקצר 16,17. תעלות יונים הן חלבוני בממברנה שניתן לחקור מנקודת מבט ביוכימית (כימית חלבון) או באמצעות כלי אלקטרו (מכונה ייצור הנוכחי) ולעתים קרובות תוך שימוש בגישות משלימות אלה. אלקטרופיזיולוגיה, ב תיקון- clamping כל תא מסוים, היא פתרון ראוי להבהיר את הפונקציה של תעלות יוני 15 אבל לא יכולה לפתור שינויים בסחר חלבון משינויי biophysical שלהםנכסים. כימית חלבון יש, עם זאת, לעתים קרובות שימוש אפשרי מוגבלת בשל הביטוי הנמוך היחסי של חלבונים בממברנה גדולים ביחס חלבונים מסיסים קטנים. שיטות תפוקה גבוהה חזקות באמצעות הודעת קרינה צריכות להיות מפותחות על מנת לתת מענה ליקויים דווקא biogenesis חלבון גורמים לשינויי הביטוי פני התא של תעלות יונים. Cytometry זרימה היא טכנולוגיה biophysical מועסק ספירת תאים, מיון, איתור סמן ביולוגי, והנדסת חלבון 18. כאשר פתרון מדגם של תאי חיים או חלקיקים מוזרק לתוך cytometer זרימה, התאים מסודרים לזרם יחיד שיכול להיות נחקר על ידי מערכת זיהוי של המכונה (איור 1). התזרים הראשון cytometer המכשיר המיוצר ב -1956 19 זוהה רק פרמטר אחד אבל cytometers הזרימה המודרני יש לייזרים מרובים גלאי קרינה המאפשרים זיהוי של יותר מ -30 פרמטרי ניאון 20,21.מסננים ומראות (אופטיקה פליטה) לכוון את פיזור האור או אור הניאון של תאי רשת אלקטרונית (פוטודיודה וגלאים) הממירה את אור יחסי עוצמתו. נתונים דיגיטליים מנותחים באמצעות תוכנות מיוחדות הפלט העיקרי מוצג כמזימת נקודה 21. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54732/54732fig1.jpg" /> איור 1:. עקרונות Biophysical של זרימת cytometry מיון תאים בודדים נדחפים דרך נחיר בלחץ גבוה בתוך זרם של נוזל נדן אשר נע אותם על אחד או יותר נקודות החקירה לייזר. אלומת האור היא מוסחת על ידי התאים עוברים והאור שנאסף בכיוון קדימה (Forward הפיזור, FCS) נשלח פוטודיודה הממיר האור לאות ביחס ישירה לגודל של התא. האור נאסף גם בזווית של 90 ° לנתיב לייזר ונשלח גלאי (המכונה גם photomultipliers (PMT)).אור זה מנותב דרך מראות dichroic המאפשרות זיהוי של אות הפיזור בצד (SSC), המשקפת את הגרעיניות בתוך התאים, ואת פליטת פלורסנט אם fluorochromes הנרגש נוכחים בתא. שלושה גלאים (ירוק, צהוב, אדום) מיוצגים עם מסננים bandpass אורך גל שונה, מה שמאפשר זיהוי סימולטני של fluorochromes שונים. האותות השונים דיגיטציה ידי למחשב חיצוני והוסבו נתונים שינותחו לכמת את המאפיינים של התאים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54732/54732fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> קיבולת התפוקה הגבוהה של cytometers הזרימה נוצלה לכמת את ביטוי הקרום היחסי של סוג-בר רקומביננטי מתח מגודר סחר מחסר L- סוג Ca V 1.2 ערוצים יחידים משנה הקשורים בתאים חיים. בונת cDNA שיתוףדינג עבור החלבונים תויגו כפליים לבצע אפיטופ ללא ניאון תאי זמנית שיכול להיות מזוהה על ידי נוגדן מצומדות ניאון בלתי חדיר ו fluorophore תאי כי הוא פלורסנט constitutively. הן epitope התאית, הוכנסה בלופ תאי של החלבון, ואת fluorophore התאי, מוכנסת לאחר C- הסופית, מתורגם עם החלבון. בסדרה זו של ניסויים, חלבון Ca V α2δ1 תוכנן להביע hemagglutinin התאי epitope (HA) (YPYDVPDYA) זוהה על ידי (isothiocyanate והעמסה) FITC בלתי חדירה, מצומדות אנטי-HA ו mCherry כמו fluorophore התאי המהותי. כדי לקבוע את רמת הביטוי שטח פני התא היחסי של α2δ1 V mCherry-Ca HA-tagged חלבון, תאים רקומביננטי המבטאים את החלבון היתוך נבצרו לאחר transfection, ומוכתם antibod תג FITC- מצומדות העכבר חד שבטיים אנטי-HA epitopey (איור 2). FITC הוא תרכובת אורגנית ניאון כי הוא קטן יותר באופן משמעותי מאשר כתבים האנזים ולכן לא צפויות כמו להפריע לתפקוד ביולוגי. mCherry- Ca V α2δ1-HA ביתר TSA-201cells, מייצר גידול של 3-יומן משמעותי את קרינת FITC ו mCherry הקרין על מגרשים דו ממדים 22. בהתחשב בכך epitope HA ממוקם בחלק התאי של החלבון, את עוצמת הקרינה עבור FITC שהושגה בנוכחות של תאים שלמים לשקף את המדד היחסי של הביטוי על פני קרום התא של חלבון HA-tagged. הנגישות של epitope HA של המבנים הוא תוקף באופן שיטתי על ידי מדידת האות FITC לאחר התא permeabilization. מדד זה משמש גם כדי לאשש את ביטוי חלבון הכולל המנורמל מאז עוצמות קרינה היחסיות עבור FITC מוערכות בתאי permeabilized הם איכותיים להשוות את ערכי הקרינה היחסיים FOr mCherry נמדד בתנאי permeabilized והלא-permeabilized 22,23. חשוב לציין כי ספקטרום קרינה הפנימי מוסט לכיוון ערכים גבוהים יותר לאחר permeabilization אבל זה הערך היחיד שדווח הוא השינוי בעוצמת קרינה לעומת המבנה השליט. שינויים יחסיים בעוצמת הקרינה עבור המבנים הבדיקה מחושבים באמצעות עוצמת הקרינה ΔMean (ΔMFI) ערכים עבור כל fluorophore (mCherry או FITC). ניסויים נועדו למדוד את עוצמת הקרינה של יחסי מבחן לבנות את עוצמת הקרינה של מבנה השליטה לידי ביטוי באותם תנאים להגביל וריאציות ניסיוני הקרינה הפנימית של הנוגדן מצומדות fluorophore. שני חלבונים בממברנה נחקרו בהצלחה באמצעות assay: למקטע יוצרים הנקבובי של תעלות סידן L- סוג המתח מגודרת Ca V 1.2 14,22 ו בסדרה שונה שלניסויים, למקטע תאיים עזר Ca V α2δ1 22,23. הפרוטוקול הבא שמש כדי לקבוע את הביטוי על פני קרום התא של למקטע Ca V α2δ1 של L-סוג הלב Ca V 1.2 ערוץ בתנאים מלאים לאחר מוטציות המשפיעות על שינוי posttranslational של ערוץ היון. תחת תנאי ניסוי סטנדרטיים, הקרינה פני התא של FITC מגבירה מעין-ליניארי עם הביטוי של cDNA מקודדי חלבוני mCherry-Ca V α2δ1-HA (האיור 5 בהפניה 22). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54732/54732fig2.jpg" /> איור 2:. ייצוג סכמטי של תיוג סך קרום בזרימת cytometry פרוטוקול הניסוי התוכנית מתאר כמה מן השלבים העיקריים הדרושים כדי לכמת את הביטוי הכולל ותא השטח היחסי של תעלות יונים רקומביננטי ידי flow cytometry. תאים הם transfected עם בניית פעמים מתויגות mCherry-Ca V α2δ1-HA בתאי TSA-201 (1) ו מוכתמים לפני או אחרי permeabilization (2). נתוני פרמטרים מרובים נרכשים cytometer זרימה (3) עבור ניתוח רב משתנה (4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54732/54732fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>Q5 ערכת מוטגנזה מכוונת אתר</td> ניתן להחליף את <td>New England Biolabs</td><td>E0554S</td><td>בערכת מוטגנזה מכוונת אתר של QuickChange (Agilent, #200523).</td></tr><tr><td>שפופרות 1.5 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72-690-001</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות 15 מ"ל&nbsp;</td><td>סרסטדט</td><td>&nbsp; 62-554-002</td><td></td></tr><tr><td>צנרת Tranfer חד פעמית מדורגת &nbsp;</td><td>VWR</td><td>160001-192&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 100 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>430167</td><td>לתרבית סטנדרטית של תאי HEKT.</td></tr><tr><td>צלחת תרבית 35 מ"מ</td><td>פלקון</td><td>353001</td><td>לתרבית סטנדרטית של תאי HEKT.</td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 1 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>86.1251.001</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 5 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 10 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 25 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>86.1285.001</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הגלוקוז הגבוה של Dulbecco</td><td>Life Technologies</td><td>12100-046</td><td>חם ב 37 & דג; C אמבט מים לפני השימוש.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מאושר, מושבת בחום, ממקור ארה"ב</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>לטרנספקציה ליפוזומלית. ניתן להחליף בטרנספקציה של סידן פוספט.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש.</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (1x) 0.05%, פנול אדום</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו-שפופרות</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; פוספט חוצץ מלח 1x</td><td>פישר</td><td>BP661-10</td><td>יכול להיות "תוצרת בית".</td></tr><tr><td>נוגדן מצומד Anti-HA FITC</td><td>Sigma</td><td>H7411</td><td></td></tr><tr><td>IgG1& FITC נוגדן לבקרת איזוטיפים</td><td>Sigma</td><td>F6397</td><td></td></tr><tr><td>BD ערכת פתרון קיבוע/פרמיביליזציה ציטופיקס/ציטופרם</td> BD <td>Biosciences</td><td>554714</td><td>קיבוע/חדירה. תמיסת פרמיביליזציה/שטיפה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>המציטומטר</td><td>פישר</td><td>49105161</td><td></td></tr><tr><td>טריפן בלו</td><td>פישר</td><td>15250061</td><td>כדי לגשת לכדאיות התא.</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה מקוררת, 5430R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>A14H172200</tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubator</td><td>Fisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Platform Rocker</td><td>Fisher</td><td>545034</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>VWR</td><td>89032-216</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSARIA III&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>648282</td><td>ציטומטר זרימה.</td></tr><tr><td>FlowJo Software v10</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo v10 Dongle</td><td>לניתוח נתונים.</td></tr></tbody></table>

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה&quot;כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

מוטציות תורשתיות או דה נובו בערוצים סלקטיביים של קטיון עלולות להוביל למוות לבבי פתאומי. לעתים קרובות מניחים ששינוי בסחר בקרום הפלזמה של חלבונים טרנסממברניים מרובי מתפרשים אלה, עם או בלי שינוי בשער התעלה, תורם באופן משמעותי לתהליך זה. לכן זה הפך להיות קריטי לפתח שיטה לכימות השינוי בביטוי פני התא היחסי של תעלות יונים לבביות בקנה מידה גדול. כאן, ניתן פרוטוקול מפורט לקביעת הביטוי הכולל היחסי ופני התא של תעלות סידן לבביות מסוג L CaV1.2 ותת-יחידות הקשורות לממברנה בתאי tsA-201 באמצעות מבחני ציטומטריה פלואורסצנטיים דו-צבעוניים. בהשוואה לשיטות איכותניות אחרות המבוססות על מיקרוסקופיה או מבוססות אימונובלוטינג, ניסויי זרימה ציטומטריה הם מבחנים מהירים, ניתנים לשחזור ובנפח גדול המספקים נקודות קצה ניתנות לכימות על דגימות גדולות של תאים חיים (הנעים בין 104 ל -106 תאים) עם מאפיינים תאיים דומים בזרימה אחת. המבנים תוכננו לבטא באופן קונסטרוקטיבי mCherry בקצה C התוך-תאי (ובכך לאפשר הערכה מהירה של ביטוי החלבון הכולל) ולבטא אפיטופ המגלוטינין חוץ-תאי (HA) כדי להעריך את ביטוי פני התא של חלבוני ממברנה באמצעות נוגדן מצומד פלואורסצנטי נגד HA. כדי למנוע שלילי כוזב, נערכו ניסויים גם בתאים חדירים כדי לאשר את הנגישות והביטוי התקין של אפיטופ HA. הנוהל המפורט מספק: (1) תכנון של מבני DNA מתויגים (חומצה דאוקסיריבונוקלאית), (2) טרנספקציה מתווכת שומנים של מבנים בתאי tsA-201, (3) תרבית, קציר וצביעה של תאים לא חדירים וחדירים, ו-(4) רכישה וניתוח של אותות פלואורסצנטיים. בנוסף, העקרונות הבסיסיים של זרימה ציטומטרית מוסברים ותכנון הניסוי, כולל בחירת פלואורופורים, טיטרציה של נוגדן HA וניסויי בקרה, נדון ביסודיות. גישה ספציפית זו מציעה כימות יחסי אובייקטיבי של הביטוי הכולל ופני התא של תעלות יונים שניתן להרחיב לחקר משאבות יונים ומובילי קרום פלזמה.

מאמר זה מתאר פרוטוקול אמין לכמת פנים כולל ותא של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי TSA-201cells ידי זרימת שני צבעים cytometry assay. כדוגמה, פני התא ביחס וביטוי החלבון הכולל היה לכמת עבור α2δ1subunit ע&quot;א. על מנת לבצע את זרימת שני צבעי cytometry assay, Ca V α2δ1 תויג כפליים להביע HA epitope ללא ניאון תאי שיכול להיות מזוהה על ידי נוגדן אנטי HA FITC- מצומדות ו fluorophore mCherry מכונן פלורסנט התאי. ספקטרום עירור ופליטה עבור...

הפרעות בקצב לב בירושה לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות המשנות את מסירת השטח של תעלות יונים אחד או יותר. הנה, אנחנו מתאימים זרימת cytometry מבחני לספק כימות של ביטוי החלבון הכולל ותא יחסית משטח של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאים TSA-201.

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא לכמת את הביטוי של חלבונים ממברנליים על פני השטח של התא באמצעות בדיקה פלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבדיקות ציטומטריה זרימה מספקות נקודות קצה כמותיות על נפחים גדולים של תאים חיים בניסוי בודד. המשמעויות של טכניקה זו משתרעות על פני אבחון וטיפול בהפרעות קצב של החדרים בלב, מכיוון שפתולוגיות אלו קשורות לעיתים קרובות למוטציות גנטיות הגורמות לפגמים בהובלה (trafficking) של תעלות יונים בלב.באופן כללי, אנשים שאינם מכירים שיטה זו מתקשים לזהות אתר הכנסה חוץ-תאי מתאים עבור האפיטופ, אשר לא יפגע בתפקוד החלבון שלהם וייצור אות פלואורסצנטי חזק בנוכחות הנוגדן המשולב. את הפרוצדורה זו ידגים Benoite Bourdin, עוזר מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, יש לתגג באופן כפול קונסטרוקטים של DNA עם mCherry בקצה ה-C התוך-תאי.בנוסף, בטאם אפיתופ של hemmagglutinin הפונה כלפי חוץ, אותו ניתן למדוד באמצעות נוגדן פלואורסצנטי כדי להעריך את הביטוי של חלבוני ממברנה על פני התא. לאחר מכן, תרבטו פלטה של תאי TSA201 בשיטות סטנדרטיות עד להגעה ל-90% confluence. עבור כל דגימה, הכינו את ריאגנטים הטרנספקציה בשתי מבחנות.הכינו מבחנה אחת בנפח 1.5 מיליליטר המכילה ארבעה מיקרוגרמים של DNA ו-250 מיקרוליטר של מצע סרום מופחת, ומבחנה שנייה עם 10 מיקרוליטר של סוכן טרנספקציה מתווך ליפוזומים ו-250 מיקרוליטר של מצע תרבית עם סרום מופחת. ערבבו בעדינות את שתי המבחנות והדגירו אותן למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שלבו בעדינות את תכולת מבחנה אחת ומבחנה שתיים והדגירו את קומפלקסי הליפוזום-DNA למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.הוסיפו את הקומפלקסים לתאי התרבית וניעו בעדינות את צלחת התרבית. החזירו את הצלחת לטמפרטורה של 37 °C ובאטמוספירה של 5% carbon dioxide למשך 24 שעות. 24 שעות לאחר הוספת סוכן הטרנספקציה, הסירו את המצע מצלחת התרבית ושטפו בזהירות את התאים עם 400 µL של Trypsin-EDTA שחומם מראש.לאחר מכן, הוסיפו 400 µL של Trypsin-EDTA והדגירו את הצלחת למשך חמש דקות כדי לאפשר לתאים להיפרד מהצלחת. לאחר ההיפרדות, עצרו את עיכול האנזים על ידי הוספה של 1 mL של מצע גידול קר ללא פניצילין או סטרפטומייצין לתאים. העבירו בעדינות את המצע בעזרת פיפט מעל הצלחת ארבע עד חמש פעמים כדי לשטוף את כל התאים מהמשטח.לאחר מכן, אספו את התאים לשפופרות סטריליות של 1.5 milliliter והניחו אותם מיד על קרח. בשלבים הבאים, השתמשו בתמיסות קרות מאוד ושמרו את התאים בטמפרטורה של ארבע מעלות כדי למנוע את הפנימיות (internalization) של האפיטופ שעל פני השטח. כמו כן, הפחיתו את חשיפת התאים לאור כדי להגביל את דהיית הצבע (photobleaching) של האות הפלואורסצנטי.בשלב הבא, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה כדי להשקיע את התאים. לאחר מכן, שאבו בזהירות והשליכו את העלייה שנוצרה. השביו את המשקע כדי להכין תרחיף של תאים בודדים באמצעות 1 mL של PBS.לאחר מכן, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך זמן קצר. השקיעו ותלו את התאים פעם נוספת כדי להסיר לחלוטין את מצע התרבית. לאחר מכן, תלו את משקע התאים ב-600 microliters של PBS.מדדו את ריכוז התאים והתאימו אותו ללפחות שלושה מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, חלקו את התאים למבחנות חדשות של 1.5 מיליליטר. הקפידו לכלול את הביקורות המתאימות כדי להבחין בין צביעה ספציפית לצביעה לא ספציפית, וכן עבור צביעה חוץ-תאית וצביעה תוך-תאית.הנוגדן הבקר של האיזוטופ יעזור להעריך את רמת הצביעה של הרקע ויחייב התאמה לנוגדן הראשוני, לאיזוטופ ולפלואורופור. חשוב להשתמש בנוגדן האיזוטופ הבקר ובנוגדן הפלואורסצנטי בריכוז זהה. כדי להעריך את הביטוי של חלבונים ממברנליים על פני השטח של התא, סמנו תחילה רק את האפיטופ של HA הפונה כלפי חוץ באמצעות נוגדן המשורשר למסמן פלואורסצנטי.לאחר מכן, הוסף למבחנה נוגדן מונוקלונלי anti-HA המשוער ב-FITC בריכוז של five micrograms per milliliter. ערבב את התאים קצרה בעזרת וורטקס ולאחר מכן דגור אותם על פלטפורמת נדנדה בחושך. הוצא את התאים מהחושך והוסף 900 microliters של PBS.לאחר מכן, סובב את המבחנה בצנטריפוגה כדי לשקע את התאים ושאב את הנוזל העליון. בשלב הבא, שטוף את התאיים על ידי ריסוס מחדש של המשקע ב-1 mL של PBS וערבוב קצר במכשיר וורטקס. לאחר מכן, חזור על שלב הצנטריפוגה כדי לשקע שוב את התאים.חזור על שלב שטיפה זה שלוש פעמים בסך הכל כדי להסיר נוגדנים שאינם קשורים. לאחר השטיפה האחרונה, השהה מחדש את התאים ב-500 microliters של PBS והעבר את תרחיף התאים הבודדים למבחנה של flow cytometry בנפח חמישה מיליליטר. שמור את התאים בחושך בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius עד להרצת הדגימה.כדי להעריך את הביטוי התוך-תאי של חלבון כולל, סמנו כעת את התאים המאופרים (permeabilized). פעולה זו מבוצעת באמצעות פרוטוקול דומה לסימון החוץ-תאי, אך בתוספת של תמיסת חדירה (permeabilization buffer) לתאים המבוססת על ספונין. שקיעו את התאים, השליכו את העליון ותלו את התאים מחדש ב-100 µL של תמיסת קיבוע וחדירה ישירות מהמלאי שהוכן.דגרו את התאים בחושך בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של בופר שטיפה לחדירה (permeabilization washing buffer) שהוכן טרי, וערבבו את התאים קצרה במכשיר וורטקס. לאחר מכן, השקיעו את התאים ושטפו אותם פעמיים נוספות באמצעות בופר השטיפה לחדירה.לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדן המונוקלונלי anti HA המשורשר ל-FITC בריכוז של 5 µg/mL ו-100 µL של תמיסת שטיפה להחדרה (permeabilization washing buffer). ערבבו את התאים קצרות במערבל Vortex והדגירו את התאים בחושך בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת שטיפה להחדרה.שקעו את התאים ושטפו אותם שלוש פעמים ב-100 µL מהבופר שהוצג קודם לכן. לאחר השטיפה האחרונה, השעיו שוב את התאים ב-500 µL של PBS והעבירו את תרחיף התאים הבודדים לתוך מבחנה של 5 mL המיועדת לציטומטריה זרימה. העבירו את התאים הבלתי-חדירים (non-permeabilized) ואת התאים החדירים (permeabilized) בציטומטר הזרימה באותו היום.ראשית, הפעילו את התוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה וייבאו את קבצי ה-fcs שנוצרו במהלך הציטומטריית זרימה. לחצו על הדגימה הראשונה והתחילו בתהליך ה-gating בגרף של side scatter לעומת forward scatter. לאחר מכן, ציירו את שער P1 באמצעות סמל האליפסה מסביב לתאי החיים כדי להסיר שרירים, תאים מתים או צבירים.לאחר מכן, שרטט את תרשים המתאר (contour plot) של פרמטרי המבחנה עבור עוצמת הפלואורסצנציה של mCherry מול FITC. הגדר את שער P2 סביב התאים החיוביים ל-FITC ו-mCherry ואת שער P3 סביב אוכלוסיית התאים השליליים לפלואורסצנציה. לאחר מכן, בחר את השערים P2 ו-P3 ולחץ על סמל הוספת הסטטיסטיקה בחלון סביבת העבודה המקורית.לחצו על count ולאחר מכן לחצו על mean. לבסוף, החילו את פרמטרי השערים (gates) והסטטיסטיקה על כל הדגימות שנבדקו על ידי הציטומטר. פרוטוקול זה שימש לאפיון תפקידה של N-glycosylation בביטוי הכולל ובביטוי על פני השטח של התא של CaV Alpha 2 Delta 1 בתאי TSA201.כדי לבחון את ביטוי החלבון על פני השטח של התא, נמדדה כמות HA בתאים שאינם חדירים (non-permeabilized) שבהם הופסקו אתרי N-glycosylation בארבעה אתרים, ב-16 אתרים או ללא הפסקה כלל. רמות ה-FITC היו גבוהות בטיפוס הפרא (wild type) ובתאים שבהם הופסקו אתרי N-glycosylation בארבעה מיקומים, אך בתאים שבהם הופסקו 16 מיקומים נמצאו רמות רקע בלבד. עבור התאים החדירים (permeabilized), פלואורסצנציית ה-FITC עלתה בכל התנאים, מה שמעיד על כך שכל חלבוני ה-CaV Alpha 2 Delta 1 עם תג HA שעברו טרנספקציה נצבעו וזוהו על ידי הנוגדן anti HA FITC.בנוסף, רמות הפלואורסצנציה של mCherry היו דומות עבור תאים מומרחים (permeabilized) ותאים שאינם מומרחים, מה שמעיד על כך שההמרחה אינה משנה את אות ה-mCherry היחסי. בדיקות שנערכו לאחר המרחאת התאים הראו כי ביטוי החלבון הכולל בתאים שבהם 16 מיקומים היו משובשים פחת באופן משמעותי, בין אם נגזר זאת מהפלואורסצנציה של FITC בתאים מומרחים או מהפלואורסצנציה הקבועה (constitutive) של mCherry שנמדדה בתאים שאינם מומרחים ובתאים מומרחים. בנוסף להליך זה, ניתן לבצע הקלטות פיזיולוגיות נוספות כדי לבחון את המתאם בין הביטוי לבין התפקוד של תעלות יונים.טכניקה זו מסללת את הדרך עבור חוקרים בתחום הרפואה ללמוד על השפעתן של מוטציות גנטיות, מודיפיקציות לאחר תרגום, microRNAs, Small GTPases ותפקידם של chaperones בהובלה של חלבוני ממברנה המובעים בתאים רקומביננטיים או תאים טבעיים. לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להגיע להבנה טובה של אופן ביצוע טרנספקציית DNA בתאים רקומביננטיים, צביעת NTAC ותאים פרמיליביליים, וכן ביצוע ניתוח נתונים על הדגימות. זכור שעבודה עם תאים חיים מחייבת נקיטת אמצעי זהירות, כגון עבודה במבの流れ למסננת (laminar flow) לצורך הטרנספקציה וחבישת כפפות בעת טיפול בחומרים כימיים.

determination-relative-cell-surface-total-expression-recombinant-ion

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מדגימים את האינטראקציה בין חלבונים לבין שלפוחיות פוספוליפידים מלאכותיות באמצעות ציטומטריית זרימה כמותית. קשירת חלבונים המסומנים בפלואורסצנטיות לשלפוחיות פוספוליפידים המסומנים בפלואורסצנטיות מגבירה את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת, ועלייה זו מזוהה על ידי ציטומטר זרימה.

ציטומטריית זרימה כמותית לחקר אינטראקציות שלפוחית חלבון-פוספוליפידים

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular מספק שיטה כמותית תפוקה גבוהה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על אתרי קישור ומיפוי חלבון לסינון גורמים המווסתים את האינטראקציה בין חלבונים.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

אנו מספקים תיאור מפורט של פרוטוקול לניתוח זרימה ציטומטרי של אנטיגנים פני השטח ו/או אנטיגנים תוך-תאיים בסוגי תאים עצביים. היבטים קריטיים של תכנון ניסויים, הליכים מתודולוגיים שלב אחר שלב ועקרונות בסיסיים של ציטומטריית זרימה מוסברים על מנת לאפשר לנוירוביולוגים לנצל טכנולוגיה רבת עוצמה זו.

ניתוח cytometry זרימת פרוטוקולים למשטח והתאי Antigen של סוגי תאים עצביים

מאמר זה מתאר שיטה למדידת alloreactivity באוכלוסייה מעורבת של תאי T באמצעות זרימת הדמית cytometry.

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

זרם איגוד הסלולר מבוססי cytometry assay מתואר זה משמש בעיקר ככלי מיון כדי לזהות תרכובות המעכבות את הכריכה של ליגנד כימוקין CXC fluorescently שכותרתו 12 (CXCL12) לקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4).

וזמינותו מבוססי Cytometry זרימה כדי לזהות תרכובות לשבש קשירה של ליגנד כימוקין שכותרתו Fluorescently CXC 12 לקולטן כימוקין CXC 4

מאמר זה מתאר זרימה מבוססת-סריג cy, מבוסס הפרוטוקול כדי לכמת הרכבה עצמית חלבון בשני S. cerevisiae ס ו HEK293T תאים.

גילוי ואפיון הרכבה עצמית של חלבון בVivo על-ידי הזרמת הקיטומטל

מטרת שיטה זו היא לקבוע את צפיפות CR1 ב אריתרופוציטים של כל נושא על ידי השוואת עם שלושה נושאים שצפיפות הCR1 של erythrocyte ידועה. השיטה משתמשת cy, לאחר כתמים חיסוני של הנבדקים ' אריתרופוציטים על ידי נוגדן אנטי CR1 שבטיים מצמידים למערכת מוגברת באמצעות phycoארימתרין (PE).

מדידת קולטן אריתרופוציט 1 באמצעות שימוש בשיטת זרימה

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

כאן, אנו מתארים קבוצה של שיטות לאפיון האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות של תאים או microvesicles.

ניתוח האינטראקציה של חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית עם מיקרו-וסיקלים מלאכותיים של פוספוליפידים באמצעות ציטומטריה כמותית של זרימה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקר חלבוני ממברנה אלקטרוגניים על ידי מדידת שינויים בפוטנציאל הממברנה. בדיקה זו מספקת פלטפורמה לקריאה פונקציונלית של תעלות יונים מרובות המבוטאות אנדוגנית בשורות תאי אפיתל.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות של פוטנציאל ממברנה למחקר פונקציונלי בתפוקה גבוהה של שתי תעלות יונים אנדוגניות בשני קווי תאי אפיתל

זרם סידן, מדד לאיתות תאי T, הוא דרך יעילה לנתח תגובות לגירוי קולטן תאי T. פרוטוקול זה לריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא מנצל את היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא.

ניתוח של זרימת סידן המושרה על ידי קולטן תאי T בתאי T מורין ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא

למדו לכמת ביטוי חלבוני קרום על פני תאים בשיטת cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של תאים חיים לחקר ערבוביות לבביות ותעלות יונים.

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה"כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

גלה סרטונים נוספים