קביעת פני התא יחסית והביטוי סה"כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לכמת את ביטוי פני התא של חלבוני ממברנה באמצעות מבחן מרווח פלואורסצנטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבדיקות ציטומטריית זרימה מספקות נקודות קצה ניתנות לכימות על כמויות גדולות של תאים חיים בניסוי יחיד. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון וטיפול בהפרעות קצב חדריות לב מכיוון שפתולוגיות אלו קשורות לרוב למוטציות גנטיות הגורמות לפגמים בסחר בתעלות יונים לבביות.

בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו מתקשים לזהות אתר החדרה חיצוני מתאים לאפיטופ שאינו פוגע בתפקוד החלבון שלהם ומייצר אות פלואורסצנטי חזק בנוכחות הנוגדן המצומד. מי שידגים את ההליך הזה יהיה בנואה בורדין, עוזר מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, מבני DNA כפולים עם mCherry בקצה C התוך-תאי.

כמו כן, בטא אפיטופ המגלוטינין נוסף הפונה לתאים, אותו ניתן למדוד באמצעות נוגדן פלואורסצנטי כדי להעריך את ביטוי פני התא של חלבוני הממברנה. לאחר מכן, תרבית צלחת של תאי TSA201 בטכניקות סטנדרטיות עד שהם מגיעים למפגש של 90%. עבור כל דגימה הכינו את ריאגנטים הטרנספקציה בשני צינורות.

הכן צינור אחד של 1.5 מיליליטר עם ארבעה מיקרוגרם של DNA ו-250 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת, וצינור שני עם 10 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה בתיווך ליפוזום ו-250 מיקרוליטר של מדיום תרבית מופחת בסרום. מערבבים בעדינות את שני הצינורות ומדגרים אותם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שלבו בעדינות את התוכן של צינור 1 וצינור 2 ודגרו על קומפלקסי ה-DNA של הליפוזום למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

מוסיפים את הקומפלקסים לתאים המתורבתים ומנענעים בעדינות את צלחת התרבות. מניחים את המנה בחזרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ותחת אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. 24 שעות לאחר הוספת מגיב הטרנספקציה, הוציאו את המדיום מכלי התרבות ושטפו בזהירות את התאים עם 400 מיקרוליטר של טריפסין-EDTA מחומם מראש.

לאחר מכן, הוסיפו 400 מיקרוליטר של טריפסין-EDTA ודגרו על המנה למשך חמש דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק מהצלחת. לאחר הניתוק, עצור את עיכול האנזים על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום תרבית קרה ללא פניצילין או סטרפטומיצין לתאים. פיפטה בעדינות את המדיום מעל הצלחת ארבע עד חמש פעמים כדי לשטוף את כל התאים מהמשטח.

לאחר מכן, אספו את התאים בצינורות סטריליים של 1.5 מיליליטר והניחו אותם מיד על קרח. לשלבים הבאים, השתמשו בתמיסה קרה כקרח ושמרו על התאים בארבע מעלות כדי למנוע הפנמה של אפיטופ פני השטח. כמו כן, הפחיתו את חשיפת התאים לאור על מנת להגביל את ההלבנה של האות הפלואורסצנטי.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות כדי לגלול את התאים. לאחר מכן, שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט שהתקבל. השעו מחדש את הגלולה כדי להכין תרחיף תא בודד באמצעות מיליליטר אחד של PBS.

לאחר מכן, צנטריפוגה קצרה את הצינורות. גלולה והשעיה מחדש של התאים פעם נוספת על מנת להסיר לחלוטין את מדיום התרבית. לאחר מכן, השעו מחדש את גלולת התא ב-600 מיקרוליטר של PBS.

מדוד את ריכוז התא והתאם אותו לפחות לשלושה מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, חלקו את התאים לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר. הקפד לכלול את הבקרות המתאימות כדי להבחין בין כתמים ספציפיים לצביעה לא ספציפית ולצביעה תאית נוספת וגם לצביעה תוך-תאית.

נוגדן בקרת האיזוטופים יעזור להעריך את רמת צביעת הרקע ואמור להתאים לנוגדנים הראשוניים, איזוטופ מבשר טובות ופלואורופור. חשוב להשתמש בנוגדני איזוטופ הבקרה ובנוגדן הפלואורסצנטי באותו ריכוז. כדי להעריך את ביטוי פני התא של חלבוני ממברנה, תחילה סמן רק את אפיטופ ה-HA הנוסף הפונה לתאים באמצעות נוגדן מצומד באור פלואורסצנטי.

לאחר מכן, הוסף נוגדן חד שבטי נגד HA מצומד FITC בחמישה מיקרוגרם למיליליטר לשפופרת. מערבל את התאים לזמן קצר ואז דוגר אותם על משטח נדנדה בחושך. הסר את התאים מהחושך והוסף 900 מיקרוליטר PBS.

לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור כדי לגלול את התאים ולשאוף את הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את התאים על ידי השעיית הגלולה במיליליטר אחד של PBS ומערבולת קצרה של התאים. לאחר מכן, חזור על שלב הצנטריפוגה כדי לגלול שוב את התאים.

חזור על שלב שטיפה זה בסך הכל שלוש פעמים כדי להסיר כל נוגדן לא קשור. לאחר הכביסה הסופית, השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר PBS והעבירו את תרחיף התא הבודד לצינור ציטומטריה זרימה של חמישה מיליליטר. שמור את התאים בחושך בארבע מעלות צלזיוס עד להפעלת הדגימה.

כדי להעריך את הביטוי התוך-תאי של החלבון הכולל לאחר מכן, סמן את התאים החדירים. זה מושג באמצעות פרוטוקול דומה לתיוג החוץ-תאי, אך בתוספת מאגר חדירות תאים מבוסס ספונין. גלולה את התאים, השליך את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים ב -100 מיקרוליטר של תמיסת חדירות קיבוע ישירות מהמלאי המוכן.

דגרו על התאים בחושך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר שטיפת פרמיביליזציה טרי שהוכן ומערבל לזמן קצר את התאים. לאחר מכן, גלו את התאים ושטפו אותם פעמיים נוספות באמצעות מאגר הכביסה של החדירה.

לאחר מכן, הוסף את נוגדן האנטי HA החד-שבטי המצומד ל-FITC ב-5 מיקרוגרם למיליליטר ו-100 מיקרוליטר של מאגר הכביסה של החדירה. לזמן קצר מערבולת התאים ודוגרת על התאים בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר הכביסה של החדירה.

גלולה את התאים ושטוף אותם שלוש פעמים ב -100 מיקרוליטר של אותו מאגר כפי שהוצג קודם לכן. לאחר הכביסה הסופית, השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר PBS והעבירו את תרחיף התא הבודד לצינור ציטומטריה זרימה של חמישה מיליליטר. הפעל את התאים הלא חדירים והחדירים דרך ציטומטר הזרימה באותו יום.

כדי להתחיל, הפעל את תוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה וייבא את קבצי ה-fcs שנוצרו במהלך ציטומטריית זרימה. לחץ על המדגם הראשון והתחל את תהליך השער בתרשים של פיזור צד לעומת פיזור קדימה. לאחר מכן, צייר את שער P1 באמצעות סמל האליפסה סביב התאים החיים כדי לחסל כל פסולת, תאים מתים או אגרגטים.

לאחר מכן, צייר את עלילת קווי המתאר של פרמטר הצינור של ה-mCherry לעומת עוצמת הקרינה של FITC. הגדר את שער P2 סביב התאים החיוביים FITC ו-mCherry ואת שער P3 סביב אוכלוסיית התאים השליליים הקרינה. לאחר מכן, בחר את השערים P2 ו-P3 ולחץ על סמל הוסף סטטיסטיקה בחלון סביבת העבודה המקורי.

לחץ על ספירה ולאחר מכן לחץ על ממוצע. לבסוף, החל את פרמטרי השערים והסטטיסטיקה על כל הדגימות שנבדקו על ידי הציטומטר. פרוטוקול זה שימש לאפיון התפקיד של N-glycosylation על הביטוי הכולל ופני התא של CaV Alpha 2 Delta 1 בתאי TSA201.

כדי לגשת לביטוי החלבון על פני התא נמדד HA על תאים לא חדירים שהיו להם אתרי N-glycosylation משובשים בארבעה אתרים, 16 אתרים או ללא אתר. רמות ה-FITC היו חזקות בסוג הבר ותאים עם תאי N-glycosylation שיבשו בארבעה מקומות, אך רק רמות רקע נמצאו בתאים עם 16 מיקומים משובשים. עבור התאים החדירים, הקרינה של FITC עלתה עבור כל המצבים, מה שמצביע על כך שכל חלבוני CaV Alpha 2 Delta 1 שעברו טרנספטציה, מתויגים ב-HA, נצבעו וזוהו על ידי נוגדן אנטי HA FITC.

בנוסף, רמות הקרינה של mCherry היו דומות עבור תאים חדירים ולא חדורים, מה שמצביע על כך שהחדירות אינה משנה את אות ה-mCherry היחסי. בדיקות שנערכו לאחר חדירות תאים הראו כי ביטוי החלבון הכולל עבור התאים עם 16 מיקומים משובשים ירד גם הוא באופן משמעותי, בין אם הוא הוסק מהפלואורסצנציה של FITC בתאים חדירים או מהפלואורסצנציה המכוננת של mCherry שנמדדה בתאים לא חדירים ובתאים חדורים. בנוסף להליך זה, ניתן לבצע הקלטות פיזיולוגיות נוספות על מנת לתאם את הביטוי והתפקוד של תעלות יונים.

טכניקה זו גם סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הרפואי לחקור את ההשפעה של מוטציות גנטיות, שינויים פוסט-תרגומיים, מיקרו-RNAs, GTPases קטנים ותפקידם של צ'פרונים בסחר בחלבוני ממברנה המתבטאים בתאים רקומביננטיים או בתאים מקומיים. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור לקבל הבנה טובה כיצד לבצע טרנספקציה של DNA בתאים רקומביננטיים, לצבוע NTAC ותאים חדירים, כמו גם לבצע ניתוח נתונים על הדגימות. אל תשכח שעבודה עם תאים חיים דורשת אמצעי זהירות כמו עבודה בנוזל ההלמינלי לצורך הטרנספיקציה ולבישת כפפות בעת טיפול בכימיקלים.