קביעת פני התא יחסית והביטוי סה"כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

המטרה הכללית של שיטה זו היא לכמת את הביטוי של חלבונים ממברנליים על פני השטח של התא באמצעות בדיקה פלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבדיקות ציטומטריה זרימה מספקות נקודות קצה כמותיות על נפחים גדולים של תאים חיים בניסוי בודד. המשמעויות של טכניקה זו משתרעות על פני אבחון וטיפול בהפרעות קצב של החדרים בלב, מכיוון שפתולוגיות אלו קשורות לעיתים קרובות למוטציות גנטיות הגורמות לפגמים בהובלה (trafficking) של תעלות יונים בלב.

באופן כללי, אנשים שאינם מכירים שיטה זו מתקשים לזהות אתר הכנסה חוץ-תאי מתאים עבור האפיטופ, אשר לא יפגע בתפקוד החלבון שלהם וייצור אות פלואורסצנטי חזק בנוכחות הנוגדן המשולב. את הפרוצדורה זו ידגים Benoite Bourdin, עוזר מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, יש לתגג באופן כפול קונסטרוקטים של DNA עם mCherry בקצה ה-C התוך-תאי.

בנוסף, בטאם אפיתופ של hemmagglutinin הפונה כלפי חוץ, אותו ניתן למדוד באמצעות נוגדן פלואורסצנטי כדי להעריך את הביטוי של חלבוני ממברנה על פני התא. לאחר מכן, תרבטו פלטה של תאי TSA201 בשיטות סטנדרטיות עד להגעה ל-90% confluence. עבור כל דגימה, הכינו את ריאגנטים הטרנספקציה בשתי מבחנות.

הכינו מבחנה אחת בנפח 1.5 מיליליטר המכילה ארבעה מיקרוגרמים של DNA ו-250 מיקרוליטר של מצע סרום מופחת, ומבחנה שנייה עם 10 מיקרוליטר של סוכן טרנספקציה מתווך ליפוזומים ו-250 מיקרוליטר של מצע תרבית עם סרום מופחת. ערבבו בעדינות את שתי המבחנות והדגירו אותן למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שלבו בעדינות את תכולת מבחנה אחת ומבחנה שתיים והדגירו את קומפלקסי הליפוזום-DNA למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

הוסיפו את הקומפלקסים לתאי התרבית וניעו בעדינות את צלחת התרבית. החזירו את הצלחת לטמפרטורה של 37 °C ובאטמוספירה של 5% carbon dioxide למשך 24 שעות. 24 שעות לאחר הוספת סוכן הטרנספקציה, הסירו את המצע מצלחת התרבית ושטפו בזהירות את התאים עם 400 µL של Trypsin-EDTA שחומם מראש.

לאחר מכן, הוסיפו 400 µL של Trypsin-EDTA והדגירו את הצלחת למשך חמש דקות כדי לאפשר לתאים להיפרד מהצלחת. לאחר ההיפרדות, עצרו את עיכול האנזים על ידי הוספה של 1 mL של מצע גידול קר ללא פניצילין או סטרפטומייצין לתאים. העבירו בעדינות את המצע בעזרת פיפט מעל הצלחת ארבע עד חמש פעמים כדי לשטוף את כל התאים מהמשטח.

לאחר מכן, אספו את התאים לשפופרות סטריליות של 1.5 milliliter והניחו אותם מיד על קרח. בשלבים הבאים, השתמשו בתמיסות קרות מאוד ושמרו את התאים בטמפרטורה של ארבע מעלות כדי למנוע את הפנימיות (internalization) של האפיטופ שעל פני השטח. כמו כן, הפחיתו את חשיפת התאים לאור כדי להגביל את דהיית הצבע (photobleaching) של האות הפלואורסצנטי.

בשלב הבא, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה כדי להשקיע את התאים. לאחר מכן, שאבו בזהירות והשליכו את העלייה שנוצרה. השביו את המשקע כדי להכין תרחיף של תאים בודדים באמצעות 1 mL של PBS.

לאחר מכן, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך זמן קצר. השקיעו ותלו את התאים פעם נוספת כדי להסיר לחלוטין את מצע התרבית. לאחר מכן, תלו את משקע התאים ב-600 microliters של PBS.

מדדו את ריכוז התאים והתאימו אותו ללפחות שלושה מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, חלקו את התאים למבחנות חדשות של 1.5 מיליליטר. הקפידו לכלול את הביקורות המתאימות כדי להבחין בין צביעה ספציפית לצביעה לא ספציפית, וכן עבור צביעה חוץ-תאית וצביעה תוך-תאית.

הנוגדן הבקר של האיזוטופ יעזור להעריך את רמת הצביעה של הרקע ויחייב התאמה לנוגדן הראשוני, לאיזוטופ ולפלואורופור. חשוב להשתמש בנוגדן האיזוטופ הבקר ובנוגדן הפלואורסצנטי בריכוז זהה. כדי להעריך את הביטוי של חלבונים ממברנליים על פני השטח של התא, סמנו תחילה רק את האפיטופ של HA הפונה כלפי חוץ באמצעות נוגדן המשורשר למסמן פלואורסצנטי.

לאחר מכן, הוסף למבחנה נוגדן מונוקלונלי anti-HA המשוער ב-FITC בריכוז של five micrograms per milliliter. ערבב את התאים קצרה בעזרת וורטקס ולאחר מכן דגור אותם על פלטפורמת נדנדה בחושך. הוצא את התאים מהחושך והוסף 900 microliters של PBS.

לאחר מכן, סובב את המבחנה בצנטריפוגה כדי לשקע את התאים ושאב את הנוזל העליון. בשלב הבא, שטוף את התאיים על ידי ריסוס מחדש של המשקע ב-1 mL של PBS וערבוב קצר במכשיר וורטקס. לאחר מכן, חזור על שלב הצנטריפוגה כדי לשקע שוב את התאים.

חזור על שלב שטיפה זה שלוש פעמים בסך הכל כדי להסיר נוגדנים שאינם קשורים. לאחר השטיפה האחרונה, השהה מחדש את התאים ב-500 microliters של PBS והעבר את תרחיף התאים הבודדים למבחנה של flow cytometry בנפח חמישה מיליליטר. שמור את התאים בחושך בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius עד להרצת הדגימה.

כדי להעריך את הביטוי התוך-תאי של חלבון כולל, סמנו כעת את התאים המאופרים (permeabilized). פעולה זו מבוצעת באמצעות פרוטוקול דומה לסימון החוץ-תאי, אך בתוספת של תמיסת חדירה (permeabilization buffer) לתאים המבוססת על ספונין. שקיעו את התאים, השליכו את העליון ותלו את התאים מחדש ב-100 µL של תמיסת קיבוע וחדירה ישירות מהמלאי שהוכן.

דגרו את התאים בחושך בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של בופר שטיפה לחדירה (permeabilization washing buffer) שהוכן טרי, וערבבו את התאים קצרה במכשיר וורטקס. לאחר מכן, השקיעו את התאים ושטפו אותם פעמיים נוספות באמצעות בופר השטיפה לחדירה.

לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדן המונוקלונלי anti HA המשורשר ל-FITC בריכוז של 5 µg/mL ו-100 µL של תמיסת שטיפה להחדרה (permeabilization washing buffer). ערבבו את התאים קצרות במערבל Vortex והדגירו את התאים בחושך בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת שטיפה להחדרה.

שקעו את התאים ושטפו אותם שלוש פעמים ב-100 µL מהבופר שהוצג קודם לכן. לאחר השטיפה האחרונה, השעיו שוב את התאים ב-500 µL של PBS והעבירו את תרחיף התאים הבודדים לתוך מבחנה של 5 mL המיועדת לציטומטריה זרימה. העבירו את התאים הבלתי-חדירים (non-permeabilized) ואת התאים החדירים (permeabilized) בציטומטר הזרימה באותו היום.

ראשית, הפעילו את התוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה וייבאו את קבצי ה-fcs שנוצרו במהלך הציטומטריית זרימה. לחצו על הדגימה הראשונה והתחילו בתהליך ה-gating בגרף של side scatter לעומת forward scatter. לאחר מכן, ציירו את שער P1 באמצעות סמל האליפסה מסביב לתאי החיים כדי להסיר שרירים, תאים מתים או צבירים.

לאחר מכן, שרטט את תרשים המתאר (contour plot) של פרמטרי המבחנה עבור עוצמת הפלואורסצנציה של mCherry מול FITC. הגדר את שער P2 סביב התאים החיוביים ל-FITC ו-mCherry ואת שער P3 סביב אוכלוסיית התאים השליליים לפלואורסצנציה. לאחר מכן, בחר את השערים P2 ו-P3 ולחץ על סמל הוספת הסטטיסטיקה בחלון סביבת העבודה המקורית.

לחצו על count ולאחר מכן לחצו על mean. לבסוף, החילו את פרמטרי השערים (gates) והסטטיסטיקה על כל הדגימות שנבדקו על ידי הציטומטר. פרוטוקול זה שימש לאפיון תפקידה של N-glycosylation בביטוי הכולל ובביטוי על פני השטח של התא של CaV Alpha 2 Delta 1 בתאי TSA201.

כדי לבחון את ביטוי החלבון על פני השטח של התא, נמדדה כמות HA בתאים שאינם חדירים (non-permeabilized) שבהם הופסקו אתרי N-glycosylation בארבעה אתרים, ב-16 אתרים או ללא הפסקה כלל. רמות ה-FITC היו גבוהות בטיפוס הפרא (wild type) ובתאים שבהם הופסקו אתרי N-glycosylation בארבעה מיקומים, אך בתאים שבהם הופסקו 16 מיקומים נמצאו רמות רקע בלבד. עבור התאים החדירים (permeabilized), פלואורסצנציית ה-FITC עלתה בכל התנאים, מה שמעיד על כך שכל חלבוני ה-CaV Alpha 2 Delta 1 עם תג HA שעברו טרנספקציה נצבעו וזוהו על ידי הנוגדן anti HA FITC.

בנוסף, רמות הפלואורסצנציה של mCherry היו דומות עבור תאים מומרחים (permeabilized) ותאים שאינם מומרחים, מה שמעיד על כך שההמרחה אינה משנה את אות ה-mCherry היחסי. בדיקות שנערכו לאחר המרחאת התאים הראו כי ביטוי החלבון הכולל בתאים שבהם 16 מיקומים היו משובשים פחת באופן משמעותי, בין אם נגזר זאת מהפלואורסצנציה של FITC בתאים מומרחים או מהפלואורסצנציה הקבועה (constitutive) של mCherry שנמדדה בתאים שאינם מומרחים ובתאים מומרחים. בנוסף להליך זה, ניתן לבצע הקלטות פיזיולוגיות נוספות כדי לבחון את המתאם בין הביטוי לבין התפקוד של תעלות יונים.

טכניקה זו מסללת את הדרך עבור חוקרים בתחום הרפואה ללמוד על השפעתן של מוטציות גנטיות, מודיפיקציות לאחר תרגום, microRNAs, Small GTPases ותפקידם של chaperones בהובלה של חלבוני ממברנה המובעים בתאים רקומביננטיים או תאים טבעיים. לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להגיע להבנה טובה של אופן ביצוע טרנספקציית DNA בתאים רקומביננטיים, צביעת NTAC ותאים פרמיליביליים, וכן ביצוע ניתוח נתונים על הדגימות. זכור שעבודה עם תאים חיים מחייבת נקיטת אמצעי זהירות, כגון עבודה במבの流れ למסננת (laminar flow) לצורך הטרנספקציה וחבישת כפפות בעת טיפול בחומרים כימיים.