Name: עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: למדו פרוטוקולי האכלה עתירי שומן לזחלי דג הזברה Danio rerio עם אנלוגים פלואורסצנטיים לדימוי חי וכימות צריכת מזון. שיטה זו מאפשרת חקר מטבוליזם שומנים תזונתיים ורגולציית קליטת מזון בביולוגיה מטבולית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למנג-צ'יה שן על התמונות, לג'ניפר אנדרסון על ההערות המועילות על כתב היד, ולחברי מעבדת פרבר על תרומתם לפיתוח הטכניקות האלה. מחקר זה מומן על ידי RO1DK093399 פרסי NIDDK-NIH (S.A.F.), RO1GM63904 (קונסורציום הגנומיקה הפונקציונלית של דג הזברה: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F) ו-F32DK096786 (J.P.O). תוכן זה הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של ה-NIH. תמיכה נוספת ניתנה על ידי קרן הצדקה ע"ש ג. הרולד וליילה י. מאת'רס למעבדה של S.A.F וקרן קרנגי למדע.

<ol><li>Carten, J. D., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+system+swims+into+focus%3A+using+the+zebrafish+to+visualize+intestinal+metabolism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo.</a> Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).</li>
<li>Babin, P. J., Vernier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+lipoproteins+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma lipoproteins in fish.</a> J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).</li>
<li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).</li>
<li>Marza, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+and+nutritional+regulation+of+a+zebrafish+gene+homologous+to+mammalian+microsomal+triglyceride+transfer+protein+large+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit.</a> Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).</li>
<li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+lipid+accumulation%2C+lipoprotein+oxidation%2C+and+macrophage+lipid+uptake+in+hypercholesterolemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish.</a> Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+effects+of+high-carbohydrate+feeding+of+larvae+on+adult+glucose+metabolism+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio.</a> Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+a+combined+high+cholesterol+diet+and+high+glucose+environment+on+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature.</a> PLoS One. 8 (12), 81485(2013).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+and+attenuation+of+oxidized+lipid+accumulation+in+hypercholesterolemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish.</a> J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li>
<li>Matthews, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFalpha-dependent+hepatic+steatosis+and+liver+degeneration+caused+by+mutation+of+zebrafish+S-adenosylhomocysteine+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase.</a> Development. 136 (5), 865-875 (2009).</li>
<li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC Physiol. 10, 21(2010).</li>
<li>Chu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Akt1+enhances+adipogenesis+and+leads+to+lipoma+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (5), 36474(2012).</li>
<li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).</li>
<li>Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+approaches+to+the+study+of+zebrafish+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition.</a> ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).</li>
<li>Farber, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+digestive+physiology+using+fluorescent+phospholipid+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters.</a> Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).</li>
<li>Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+yolk+lipid+processing%3A+a+tractable+tool+for+the+study+of+vertebrate+lipid+transport+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism.</a> Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).</li>
<li>Otis, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+apolipoprotein+biology%3A+comprehensive+expression+analysis+and+a+role+for+ApoA-IV+in+regulating+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).</li>
<li>Bligh, E., Dyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).</li>
<li>Otis, J. P., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+vertebrate+digestive+function+and+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism.</a> Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).</li>
<li>Andre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fatty+acid+binding+protein+gene+expression+reveals+the+cephalocaudal+patterning+during+zebrafish+gut+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis.</a> Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PLoS One. 7 (12), 52549(2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הטכניקות המתוארות כאן לאפשר לחוקרים לטיפול דג זברת זחל עם הזנת שומנים עשירים, לדמיין עיבוד שומנים תזונתי זחלים חיים, ולכמת את צריכת מזון זחל. כדי להבטיח הצלחה, תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן כמה שלבים קריטיים. ביצי תרנגולת מסחריות להשתנות; אנו למזער השתנות פוטנציאל לבצע את כל מבחני על ביצים אורגניות מתרנגולות כלוב ללא שלא היה מועשר עבור חומצות שומן אומגה -3. שיעורי האכלה עשויים להיות נמוכים בדגים מתחת לגיל 6 DPF עם יתרת אספקת אנרגית חלמון אנדוגני, דגים בריאים, או דג עם מוטציות התפתח...

את המנגנונים שבאמצעותם המעי מסדיר עיבוד שומנים בתזונה, הכבד שולט מטבוליזם סינתזה ליפופרוטאין שומנים מורכב, ואיך האיברים האלה לעבוד עם מערכת העצבים המרכזית לשלוט על צריכת מזון מובן. מעניין ביו להבהיר ביולוגיה זה לאור המגיפות הנוכחיות של השמנת יתר, מחלות לב וכלי דם, סוכרת, מחלת כבד שומני לא אלכוהולי. מחקרים בתרבות ועכברים תא סיפקו את רוב הבנתנו את היחסים מכניסטית בין שומנים תזונתיים ומחלות, ו דג הזברה (Danio rerio) הם מתעוררים כמו מודל אידיאלי כדי להשלים את העבודה הזאת. דג הזברה יש עיכול דומה (GI) איברים, מטבוליזם של שומנים, תחבורה ליפופרוטאין לבעלי חוליות גבוהות 1,2, לפתח במהירות, והם גנטיים צייתנים. בהירות אופטית של דג הזברה הזחל הופך לפשוט במחקרים vivo, particulaיתרון r עבור חקר מערכת העיכול כמו הסביבה התאית שלה (כלומר, מרה, חיידקים, איתות האנדוקרינית) היא כמעט בלתי אפשרי לבנות מודל vivo לשעבר. בהתאם, גוף מחקר המשלב את העקיבות הגנטיות conduciveness לחיות הדמיה של זחלי דג זברה עם מגוון רחב של מניפולציות תזונתיות (עתיר שומן 3,4, -cholesterol 5, ודיאטות -carbohydrate 6,7), ומודלים של מחלות לב וכלי דם 8, סוכרת 9,10, בכבד steatosis 11-13, והשמנת 14-16, הם מתעוררים, כדי לספק שורה של תובנות מטבולית. היבט חיוני של מעבר דג הזברה זחל לתוך מחקר מטבולית הוא אופטימיזציה של טכניקות שפותחו בחיות מודל אחרות אל דג הזברה לבין ההתפתחות של מבחני רומן המנצלים את נקודות החוזק הייחודיות של דג הזברה. פרוטוקול זה מציג טכניקות שפותחו והותאמו במיוחד להאכיל דג הזברה הזחל lipiד-עשיר הארוחה, לדמיין עיבוד השומנים תזונתיים מהגוף כולו ברזולוציה subcellular, ולמדוד את צריכת המזון. חלמון עוף ביצה נבחר להלחין הארוחה עשיר שומנים בדם כפי שהוא מכיל רמות גבוהות של שומנים וכולסטרול (ליפידים להלחין ~ 58% של חלמון עוף ביצה, מתוכם ~ 5% הוא כולסטרול, 60% הם טריגליצרידים, ו -35% הם פוספוליפידים ). חלמון עוף ביצה מספק יותר שומן מאשר מזונות micropellet דג זברה מסחריים טיפוסיים (~ 15% שומנים) ויתרון שזה הזנה סטנדרטית עם אחוזים ידועים של מיני חומצות שומן ספציפיים, כמו דיאטות דג זברה וגדודי האכלה טרם טופלו על פני מעבדות 17. יתר על כן, תחליפי שומני ניאון שנקבעו חלמון הביצה לדמיין תחבורה וצבירת שומנים תזונתיים 18, מרכיבים תאיים תמונה כולל טיפות שומנים ידי ששמש הוא צבעים חיוניים כמו 3 ובאמצעות שילוב קוולנטיים לתוך שומנים מורכבים, לחקור את חילוף חומרים באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) 19 </sup&gt; ו כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) (נתונים שלא פורסמו SAF), ולספק assay כמותיים צריכת המזון הכולל 20.

<table><tbody><tr><td>טריקאין (מלח אתיל 3-אמינובנזואט מתאןסולופנט)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5040-25G</td><td>הרדמה לזחל דג זברה</td></tr><tr><td>ביצי עוף</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>ביצים אורגניות, ללא כלובים, לא מועשרות לחומצות שומן omege-3</td></tr><tr><td>מעבד אולטרסאונד 3000 סוניקטור</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>להכנת ליפוזומי חלמון ביצה</td></tr><tr><td>מארז אקוסטי Sonabox</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>להכנת ליפוזומים של חלמון ביצה</td></tr><tr><td>1/8 אינץ' מיקרו-קצה מחודד</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>להכנת ליפוזומי חלמון ביצה</td></tr><tr><td>בקבוקוני ענבר (4 מ"ל, זכוכית)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>אחסון שומנים; כולל בקבוקונים, מכסים פתוחים ומחיצות</td></tr><tr><td>כובע Incu-Shaker Mini&nbsp;</td><td>בנצ'מרק</td><td>1222U12</td><td>שייקר דגירה להזנות</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>אנלוגי שומנים פלואורסצנטיים; (4,4-דיפלואורו-5,7-דימתיל-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-אינדצן-3-חומצה הקסדקנואית)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>אנלוגי שומנים פלואורסצנטיים; (4,4-דיפלואורו-5,7-דימתיל-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-אינדצן-3-חומצה דודקנואית)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>אנלוגי שומנים פלואורסצנטיים; (4,4-דיפלואורו-5,7-דימתיל-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-אינדצן-3-חומצה פנטנואית)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>אנלוגי שומנים פלואורסצנטיים; (4,4-דיפלואורו-5,7-דימתיל-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-חומצה אינדצנית-3-פרופיונית)</td></tr><tr><td>כולסטרול TopFluor&nbsp;</td><td>אוונטי פולאר ליפידים בע"מ</td><td>810255</td><td>אנלוגי שומנים פלואורסצנטיים; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol</td></tr><tr><td>ללא חומצות שומן BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>עבור TopFluor מסיס כולסטרול</td></tr><tr><td>מתיל תאית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>אמצעי הרכבה להדמיית זחלים חיה; 75 x 25 x 1 מ"מ</td></tr><tr><td>אגרוז נמס נמוך</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>אמצעי הרכבה לזחל חי דימות; 22 x 30</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ VWR&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>16004-422</td><td>הרכבה של זחלים להדמיה חיה</td></tr><tr><td>Coverslips&nbsp;</td><td>כיסוי זכוכית</td><td>12-544A</td><td>זחלי הרכבה להדמיה חיה</td></tr><tr><td>דבק סופר</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>זחלי הרכבה להדמיה חיה</td></tr><tr><td>FluoroDish (צלחת תחתית זכוכית)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>זחלי הרכבה להדמיה חיה; צלחת 35 מ"מ, זכוכית 23 מ"מ, עובי זכוכית 0.17 מ"מ&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, מיקרוסקופ SP-5</td><td>להדמיה חיה בהגדלה גבוהה</td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>Nikon</td><td>SM21500</td><td>מיקרוסקופ להדמיה חיה בהגדלה נמוכה</td></tr><tr><td>צינורות תרבית זכוכית&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>מיצוי שומנים; (13 x 100 מ"מ; 13 מ"ל)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Plus&nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>מיצוי שומנים</td></tr><tr><td>צלחות TLC מתועלות Whatman</td><td>Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>בדיקת צריכת מזון; LK5D סיליקה ג'ל 150 A, 20 x 20 ס"מ, עובי 250 אום; </td></tr><tr><td>לוחות TLC מתוקשרים שהופסקו</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>בדיקת צריכת מזון; החלפה ישירה לצלחות Whatman Scientific TLC</td></tr><tr><td>טייפון 9410 מצב משתנה Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>קורא צלחות פלורסנט לבדיקת צריכת מזון</td></tr><tr><td>תוכנת ImageQuant GE</td><td>Healthcare</td><td>29000605</td><td>ניתוח צריכת מזון מבחן</td></tr><tr><td>5 3/4' פיפטות פסטר חד פעמיות בורוסיליקט רחבות&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>העברת זחלים</td></tr></tbody></table>

עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

דג הזברה מתגלה כמודל לעיבוד שומנים תזונתי ומחלות מטבוליות. פרוטוקול זה מתאר כיצד להאכיל את דג הזברה בארוחה עשירה בשומנים, המורכבת מתחליב של ליפוזומי חלמון ביצת עוף שנוצר על ידי סוניקציה של חלמון ביצה במדיה עוברית. ניתנות הוראות מפורטות לסינון זחלים לצריכת חלמון ביצה כך שזחלים שלא מצליחים להאכיל לא יבלבלו את תוצאות הניסוי. ניתן לשלב את הליפוזומים של חלמון ביצת העוף עם אנלוגים של שומנים פלואורסצנטיים, כולל חומצות שומן וכולסטרול, מה שמאפשר הדמיה מערכתית ותת-תאית של עיבוד שומנים תזונתיים. מתוארות מספר שיטות להרכבה של זחלים התורמים להדמיה חיה לטווח קצר וארוך עם מטרות זקופות והפוכות בהגדלה גבוהה ונמוכה. בנוסף מוצגת בדיקה לכימות צריכת המזון של הזחלים על ידי חילוץ השומנים של אנלוגים ליפידים פלואורסצנטיים המוזנים בזחלים, איתור השומנים על צלחת כרומטוגרפיה בשכבה דקה וכימות הקרינה. לבסוף, נדונים היבטים קריטיים של הנהלים, בקרות חשובות, אפשרויות לשינוי הפרוטוקולים כדי לענות על שאלות ניסוי ספציפיות ומגבלות פוטנציאליות. ניתן ליישם טכניקות אלה לא רק לחקירות ממוקדות המונעות על ידי השערות, אלא גם למגוון מסכים וטכניקות הדמיה חיה כדי לחקור את חילוף החומרים של השומנים בתזונה ואת הבקרה על צריכת המזון.

כאשר מוזן על כיסא נדנדה ב 29-31 מעלות צלזיוס, רוב הזחלים בריאים (≥95%) יאכל בתוך השעה 1. עם רב תחליב חלמון ביצה, מעי הזחל מכהה בצבע. מאוד מעיים כהים ניתן להבחין ב -2 שעות (איור 1). אם זחלים הם יאכילו אותם או לא מוזנים, מעי שרידים ברור. זחלים נמאסים ביצת תערוכה לבנה לומן מעי נפוח שאינו להכהות בצבע. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54735/54735fig1.jpg" /><br ...

דג הזברה מתגלה כמודל רב ערך של עיבוד שומנים תזונתי ומחלות מטבוליות. מתוארים פרוטוקולים של הזנת זחלים עשירה בשומנים, הדמיה חיה של אנלוגים של שומנים פלואורסצנטיים תזונתיים וכימות צריכת מזון. ניתן ליישם טכניקות אלו במגוון טכניקות סינון, הדמיה וחקירה מונעת השערות.

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

המטרה הכללית של פרוטוקול ניסיוני זה היא להאכיל זחלי דגי זברה במיסב עשיר בליפידים, אותו ניתן להעשיר באנלוג ליפידי פלואורסצנטי, כדי להפוך את הזחלים לנראים ויזואלית במעקב אחר דינמיקה של ספיגת ליפידים ולכמת את צריכת הליפידים התזונתיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי המטבוליזם והביולוגיה של מערכת העיכול, כגון כיצד מטובללים ליפידים תזונתיים וכיצד מווסתת צריכת המזון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שאנלוגים ליפידיים פלואורסצנטיים יכולים להימסר ביעילות בתוך ליפוזומים תזונתיים.השקיפות האופטית של הזבראפיש (Zebrafish) בשלב הזחלים מאפשרת למיקרוסקופיה לחשוף עיבוד ליפידים סוב-צלולרי. ראשית, השעו מיליגרם אחד של אנלוג ליפידי פלואורסצנטי באבקה בתוך שני מיליליטר של 100% chloroform כדי להגיע לריכוז סופי של 0.5 micrograms per microliter. חלקו את האנלוג למבחנות זכוכית בענבר עם פקקי הברגה התואמים לממס ומכילים אטם Teflon.יש לאחסן ת stocks הללו במקפיא. העברו 10.4 µL של ת stock של אנלוג ליפיד פלואורסצנטי בריכוז 0.5 µg/µL למבחנה של 1.5 mL וייבשו תחת זרם חנקן, תוך הקפדה לא להעיף את הליפיד אל מחוץ למבחנה. השביתו מיד את הליפיד המיובש ב-5 µL של 100% ethanol על ידי הזרקת זרם לאורך דפנות המבחנה.לאחר מכן, הוסיפו 95 µL של מצע לעוברים וערבבו היטב באמצעות פיפוט למעלה ולמטה עד שהתערובת נראית הומוגנית. הגנו על המבחנה מפני אור ואחסנו אותה על קרח עד למועד השימוש. כדי להכין תמיסת ליפוזומי כולסטרול פלואורסצנטיים, הוסיפו למבחנה בנפח 1.5 mL כמות מספקת של תמיסת סטוק של אנלוג כולסטרול פלואורסצנטי, כך שריכוזו הסופי יהיה 2.5 µg/mL בעת הוספתו לאמוסיית חלמון הביצה.ייבשו את מלאי הכולסטרול תחת זרם חנקן, כפי שנעשה קודם לכן. השעיקו מיד את האנלוג הפלואורסצנטי של הכולסטרול ב-15 microliters של 100% ethanol בטמפרטורת החדר, על ידי הזרמה של הנוזל עם פיפטה לאורך דופן המבחנה. ערבבו עם 85 microliters של 1% BSA ללא חומצות שומן ומים.חיוני להמיס לחלוטין את האנלוג הליפי הפלואורסצנטי באתנול ובמדיום לעוברים לפני הוספתו לאמולסיית חלמון הביצה, וזאת כדי להבטיח פיזור הומוגני של הליפיד במזון וזמינות שווה לכל הזחלים. הגנו על המבחנה מפני אור באמצעות נייר אלומיניום ושמרו אותה על קרח. להכנת תמיסת ההזנה, הוסיפו 19 מיליליטר של מדיום לעוברים למבחנה קונית של 50 מיליליטר, ולאחר מכן הוסיפו אליקוט של מיליליטר אחד של חלמון ביצה.ערבבו את התערובת באמצעות וורטקס למשך דקה עד שתי דקות כדי ליצור אמולסיה הומוגנית. שפכו את התערובת דרך מסננת דקה כדי להסיר גושי חלבון ואספו אותה לתוך מבחנה קונית נקייה בנפח 50 milliliter. לאחר מכן, בצעו סוניקציה בפולסים לתערובת הביצים חמש פעמים, שנייה אחת פעיל ושנייה אחת כבוי, באמצעות microtip קוני ברוחב 1/4 inch בהספק של ששה watts.חזור על תוכנית הסוניקציה ארבע פעמים נוספות. פעולה זו יוצרת את הליפוזומים, אותם יש לטלטל ברציפות במכשיר נדנדה עד לשימוש כדי לשמור על הומוגניות. הוסף את הכמות המתאימה של אנלוגים של ליפידים פלואורסצנטיים לחמישה מיליליטר של תערובת הליפוזומים מיד לאחר הסוניקציה.ערבבו במערבל Vortex במהירות גבוהה למשך 30 שניות כדי לשלב את האנלוגים של הליפידים הפלואורסצנטיים לתוך הליפוזומים. הגנו על התערובת מאור על ידי עטיפת המבחנה בנייר אלומיניום, והחזירו אותה למערבל הנדנדה (rocker). העבירו חמישים זחליים לצלחת האכלה, הסירו את מצע העוברי והוסיפו 5 milliliters של מזון.כדי לעודד צריכת מזון, נערו בעדינות את הzlarvae ברוקר (rocker) דגירה והגנו אותם מהאור במידה שנעשה שימוש באנלוגים ליפידיים פלואורסצנטיים. בתום תקופת ההאכלה, שטפו את הzlarvae במצע עוברים (embryo medium) בנפח של 5 mL שלוש פעמים. כדי לקבע את הzlarvae, הניחו בלוק מתכת על קרח, כסו אותו ברקמה כדי למנוע קירור מופרז, ולאחר מכן הניחו את הzlarvae בצלחת עם מצע עוברים מעל לבלוק לצורך קירור.בחנו את הזחלים תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של 10x, וקבעו מי מהם צרכו את ההזנה מהליפוזומים. לזחלים שצרכו ליפוזומים יהיה מעי כהה. קריטי לקבוע האם הזחל ניזון על ידי בדיקה של הצבע הכהה במעי.בדרך כלל, אחוז אחד עד חמישה מהזחלים לא יאכלו, ועלולים להטעות את תוצאות הניסוי אם לא יזוהו ויסוקרו. לצורך דימות ארוך-טווח בהגדלה גבוהה עם עדשה הפוכה, קרירו תחילה את הזחלים על גבי בלוק מתכת על קרח. העבירו זחל לכלי בעירבוב זכוכית, והסִירו את מצע העוברים באמצעות ספיגה עם נייר סופג.הנח טיפה של agarose בריכוז 1.2% עם נקודת התכה נמוכה בטמפרטורה של 42 °C על גבי הזחל, וייצב אותו באופן מיידי באמצעות מוט דחיפה (poker). הוצא את הצלחת מהבלוק הקר והמתן שתיים עד שלוש דקות להתגבשות ה-agarose. לבסוף, הוסף נפח מספיק של מצע עוברים טרי כדי לכסות את ה-agarose ולמנוע התייבשות.הדגימות מוכנות כעת לדימות. בסיום ההזנה בליפוזומים, רכזו לפחות 10 זחלים שטופים בשפופרת של 1.5 מיליליטר. הסירו את מצע העוברים ולאחר מכן הקפיאו את הזחלים בהקפאה מהירה (snap freeze).חזור על הפעולה במבחנה נפרדת עם 10 זחלים שלא הוכרעו כביקורת. תוך שמירה על הדגימה על קרח, הוסף 100 µL של חוצץ הומוגניזציה לכל מבחנה, ולאחר מכן בצע הומוגניזציה באמצעות סוניקטור עם מיקרוטיפ. העבר את הרקמה למבחנת תרבית של 13 milliliters.הוסיפו 375 µL של תמיסת כלורופורם למתנול ביחס של 1:2 לכל תמיסת בוץ של בופר הומוגניזציה. ערבבו במכשיר וורטקס למשך 30 עד 60 שניות, ולאחר מכן דגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו 125 µL נוספים של כלורופורם, וערבבו בוורטקס למשך 30 שניות.בשלב הבא, הוסיפו 125 µL של 200 mM TRIS pH 7.5, ערבבו במערבל vortex למשך 30 שניות, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-2000 ×g למשך חמש דקות במיגון מאור. הוציאו את הדגימות מהצנטריפוגה בזהירות כדי למנוע הפרעה לשלבים המופרדים. בעזרת פיפטת זכוכית נקייה, אספו את השלב האורגני התחתון והעבירו אותו לנבובת זכוכית נקייה בנפח 13 mL.הימנעו בזהירות מהעברת השכבות העליונות של הפאזה המימית או של שאריות ה larvae מהשכבה האמצעית והשליכו אותן. ייבשו את הפאזה האורגנית תחת ואקום בלחץ של 0.12 atmospheric pressure, תוך הגנה עליה מאור, והקפידו להפסיק ברגע שהנוזל התאדה. השביו דגימה אחת ב-10 µL של תערובת כלורופורם למתנול ביחס של שניים לאחד, והטילו את כל נפח הדגימה על לוחית כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) בעלת תעלות.חזרו על הפעולה עם שאר הדגימות, תוך טפטוף במרווחי זמן שווים. לבסוף, סרקו את הפלטה באמצעות קורא פלטות פלואורסצנטי. בחינה של זחלים שהוזנו על נדנד (rocker) בתנאים ניסיוניים מראה מעיים כהים, המאפיינים דגים שצרכו את ת emulsion של חלמון הביצה.לזחלים שאינם מוזנים יש בדרך כלל מעיים שקופים, ולכן ניתן להבחין בקלות באלה שלא צרכו את תמיסת התזונה במהלך תקופת ההאכלה. זחל שהוזן באנלוג ליפיד פלואורסצנטי מאפשר ויזואליזציה של ההובלה וההצטברות של ליפיד תזונתי זה. במקרה זה, האות הפלואורסצנטי נראה לאורך כל איברי העיכול לאחר שמונה שעות של האכלה.אנלוגים שונים של ליפידים נטמעים בתוך מערכים ייחודיים של מבנים תאיים ובכך מאפשרים את ויזואליזצייתם, שכן הם עוברים מטבוליזם שונה לליפידים מורכבים. כאן, אנלוגים פלואורסצנטיים של C16 ו-C12 מסמנים טיפות ליפידים. Fluorescent-C5 מסמן צינורות בכבד ובלבלב, טיפות ליפידים, ממברנות תאיות ורשתות עורקיות.אנלוגי Fluorescent-C2 מסמן את תעלות הכבד והלבלב ואת הממברנות התאיות. בדיקות צריכת מזון של זחליים שימשו למחקר ההזנה של זחליי פרא (wild-type) לעומת זחליים טרנסגניים המבטאים באופן יתר את Apolipoprotein A4B1, והראו כי במהלך האכלות של ארבע שעות, הזחליים הטרנסגניים אכלו פחות מאשר זחליי הפרא. ההזנות נורמלו באמצעות זחליי ביקורת זוגיים שלא הוזנו.כימות הפלואורסצנציה של זחלי פרא (wild-type) וזחלי טרנסגניים, המבטאים באופן יתר את Apo A4 לאחר האכלה, מראה הפחתה משמעותית בבליעה של הזחלים הטרנסגניים בהשוואה לזחלי הפרא. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להכין את המזון המכיל אנלוג שומני פלואורסצנטי של חלמון ביצה בערך תוך 15 דקות. ניתן לכמת את צריכת המזון מ-10 עד 12 דגימות מאוחדות בערך בארבע שעות.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לסרוק את הזחלים לאיתור פגמים התפתחותיים שעלולים לפגוע בצריכת המזון, כגון לסת מעוותת, מעי לא מפותח או ירידה בניידות. ניתן לשלב בפרוטוקול ניסיוני זה שיטות כגון טיפולים תרופתיים או הנדסה גנומית כדי לענות על שאלות נוספות, כמו האופן שבו חלבונים ספציפיים ומסלולי איתות תאיים מווסתים את צריכת המזון ואת מטבוליזם הליפידים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי הפיזיולוגיה של מערכת העיכול וביולוגיה של התא להדמיה של הובלה והצטברות של ליפידים תזונתיים בזחלי Zebrafish.לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של אופן הכנת מזון עשיר בליפידים עבור זחלי דג זברה, סינון זחלים לצורך בדיקת צריכת מזון, קיבוע זחלים להדמיה לטווח קצר וארוך, וכמות צריכת המזון. זכרו כי עבודה עם סוניקטור עלולה להיות מסוכנת. יש להשתמש במגני אוזניים בעת ביצוע הליך זה.

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים שיטה חדשנית למיקרו-גבג' (microgavage) של זחלי דגי זברה תוך שימוש בציוד סטנדרטי להזרקה של עוברים ובמיקרוסקופ סטריאו. אנו מדגימים כי מיקרו-גבג' היא טכניקה בטוחה ויעילה, המועילה להחדרה של כמויות מבוקרות של חומרים מגוונים באופן ספציפי אל תוך חלל המעי של זחלי דגי זברה.

Microgavage של זחלי דג זברה

הסרטון מתאר את ההימנעות ובדיקת thigmotaxis של זחלי דגי זברה. הסרטון בוחן את התנהגותם של זחלי דגי זברה בתגובה לגירוי חזותי מרתיע.

הימנעות מדגי זברה ובדיקת תיגמוטקסיס: שיטה בעלת תפוקה גבוהה לבחינת התנהגות הזחלים בתגובה לגירוי חזותי מרתיע

המעבדה שלנו פיתחה מערכת שהיא שימושית לצורך זיהוי של כמה התנהגויות שונות בזחלי דג הזברה 7 ימים בת הדמיה אוטומטית תפוקה גבוהה רומן. המערכת יכולה לשמש לאיתור שינויים עדינים בהתנהגות לאחר הזחלים שנחשפו לרעלים או תרופות סביבתיים.

ניתוח התנהגות תפוקה גבוהה אוטומטי בזחלי דג הזברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחון פעילויות זחל דג זברה, פאטהד מינו גינקולוגיות ותגובות photomotor (PMR) באמצעות תוכנת מעקב אוטומטי אנטי. כאשר שולבו במשותף הרעלים bioassays, ניתוחים של התנהגויות אלו מספקים כלי אבחון לבחון אתריים כימי. פרוטוקול זה מתואר באמצעות קפאין, neurostimulant מודל.

נסיוני לבחינת תגובה התנהגותית פרופילים בדגים זחל: ליישום הקפאין נוירו-ממריץ

המטרה של פרוטוקול זה היא למדוד את זמן העברה של fluorescently עם תוויות מזון דרך המעי של הזחל דג זברה אופנה תפוקה גבוהה.

מדידת תפוקה גבוהה הבטן מעבר הזמן באמצעות זחל דג זברה

דג זברה (רזבורה rerio) הופכים נפוץ חוליות במודל חיה מושבת חיידקים, פתוגנזה. פרוטוקול זה המתאר את השימוש protozoan סנדלית caudatum כרכב שמקורם במזון זיהום בדג זברה הזחלים. Caudatum פ ברצון ולהרזיה חיידקים, לקבל נלקח על ידי דג זברה זחל דרך ההתנהגות טרף ושהם הטבעיים.

באמצעות את Protozoan סנדלית caudatum כמו רכב עבור זיהומים שמקורם במזון הזחלים דג זברה

כאן אנו להפגין שיטה לכמת את גודל הכבד בזחל zebrafish, מתן דרך להעריך את ההשפעות של מניפולציות גנטיות ופרמקולוגית על גידול בכבד ופיתוח.

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

במאמר זה אנו מציגים כיצד ליצור מודל של דגי זברה הקשורים למחלת כבד שומני שאינו אלכוהולי (NAFLD) כדי לחקור את ההשפעה של עודף כולסטרול על המיקרו-סביבה של הכבד ועל הנוף של תאי מערכת החיסון.

ניתוח של מיקרו-סביבה של הכבד במהלך התקדמות מוקדמת של קרצינומה הפטוצלולרית שאינה אלכוהולית הקשורה למחלת הכבד השומני בדגי זברה

בהירות אופטית היא יתרון משמעותי לעבודה הביולוגית והפיזיולוגית של התא בדגי זברה. מתוארות שיטות חזקות למדידת צמיחת תאים בבעלי חיים בודדים המאפשרות תובנות חדשות על האופן שבו צמיחת שרירי השלד והרקמות השכנות משולבת עם צמיחת כל הגוף.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

למדו פרוטוקולי האכלה עתירי שומן לזחלי דג הזברה Danio rerio עם אנלוגים פלואורסצנטיים לדימוי חי וכימות צריכת מזון. שיטה זו מאפשרת חקר מטבוליזם שומנים תזונתיים ורגולציית קליטת מזון בביולוגיה מטבולית.

עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון

גלה סרטונים נוספים