Name: שיטה מבוססת חוק ארכימדס של קביעת רמות שומן תסיסנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:15:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: למדו שיטת מדידת שומן מבוססת ציפה בזבובי פירות Drosophila melanogaster בשלב הזחל L3. שיטה זו מאפשרת סינון מהיר וכלכלי של שינויים ברמות האחסון השומני בחקר מטבוליזם וגנטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

K.E.H. נתמך על ידי מענק ההכשרה בביולוגיה מולקולרית NIH-T32-GM08730. עבודה זו נתמכה על ידי NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 ופרס AHA 12BGIA11930014 ל-T.R.

1. איסוף ביצים מפני זבובים עם גנוטיפים של ריבית הערה: צלבים אידיאליים המורכבים של 150 זבובי בתולה ולפחות 75 גברים. אוספי צילומים צריכים להיות מורכבים של 200 זבובים לפחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחות ענבים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אגר 37.5 גרם ל -1.5 מים מזוקקים L בבקבוק 4 L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים / אגר חיטוי לערבב למשך 50 דקות ב 121 מעלות צלזיוס (250 פרנהייט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מים / לערבב אגר הוא מעוקר, להוסיף סוכרוז 50 גרם מיץ ענבים 500 מ&quot;ל ומערבבים עם בר ומערבבים בצלחת ומערבבים מחומם עד להמסה סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכבים את האש וממשיכים לבחוש כדי לקרר את התערובת מיץ ענבים / סוכרוז אל מתחת ל -70 מעלות צלזיוס. בדוק את הטמפרטורה הפנימית עם מדחום אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3 גרם תסיסנית סוכן אנטי פטרייתי (למשל, Tegosept) לחמם מיץ ענבים / תערובת סוכרוז ומערבבים לפזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מים / תערובת אגרה הוא מתוך החיטוי, לאפשר את הבקבוק כדי לקרר למגע ידי מתערבל מדי פעם. </li><li&gt; שלב מים / תערובת אגר מיץ ענבים / תערובת סוכרוז ומערבבים עד גם מעורב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה סרולוגיות להוסיף 8 - 10 מ&quot;ל של תערובת הענבים את המכסה של צלחת פטרי קטנה (35 x 10 מ&quot;מ בסגנון). אפשר התערובת להכתיר גבוהה יותר מאשר גובה הקירות המכסים כדי ליצור צורה קמורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר צלחות ענבים להתקרר במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לאחסן בכלי אטום על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן להדביק שמרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 מ&quot;ל פתרון חיץ פוספט (PBS) ל -4 שמרים יבשים פעילים חי g בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל חרוטי ומערבבים במרית עד שהתערובת חלקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרים חנות ולהדביק ב 4 ºC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מנה קטנה (כ 1/8 כפית) של רסק שמרים לאמצע צלחת ענבים. להחליק כל קצוות גסים עם מרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחות ענבים באינקובטור עד שהם הגיעו לטמפרטורת הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר זבובי עניין לתוך צלחת ענבי תא מורכב ביצה ומניח wלהדביק שמרים ה- i מול פנימה על גבי. צלחת ענבי סרט לתא אוסף ביצה כדי להימנע מהמצב שבו הצליח לנשור. הקפד לכתוב מידע גנוטיפ ותאריך חשוב על החלק התחתון של צלחת ענבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעמיד על הקצה את תא אוסף ביצה לאפשר הזבובים להטיל ביצים על צלחת ענבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים קופסה או לכסות על תאי אוסף ביצה ומניחים אותם באינקובטור ב 25 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר זבובים להטיל ביצים עבור 4 - 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של אוסף ידי לקיחת צלחת ענבים מתוך החדר אוסף ביצה והעברת הזבובים בחזרה לתוך בקבוק מזונם. השתמש מרית לנגב את רסק שמרים עודף מהצלחת הענבים. צלחת ענבי חנות בצלחת פטרי גדולה בתוך חממת humidified ב 25 ºC עבור ~ 24 שעות. </li></ol> העברת 2. זחלי מזון הניסיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין אוכל ניסיוני. הערה: מתכון אוכל זה מבוסס על מתכון מרכז מניות Bloomington 18. שינויים חשוביםכוללים העלאת כמות השמרים כדי לייעל את הערך התזונתי של המזון לפי הערכת עיתוי של נדודי במה (בין 112 - 120 שעות לאחר איסוף הביצים ב 25 ºC). בעוד שמצאנו המתכון הזה אידיאלי עבור הבריאות וההתפתחות של זחלי הניסוי שלנו, כל מתכון אוכל כיול נתון מקובל עם בקרות חיוביות ושליליות, דוגמאות של ורשומי צעד 3.10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 1,600 מ&quot;ל מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 134 גרם קמח תירס, 10.6 גרם תסיסנית אגר Type II, ואת חלק מהמים (~ 500 מ&quot;ל) בכוס L 1. ערבבו 2 דקות עם מערבל יד ממונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 70 גרם שמרים יבשים פעילים חי, 18.4 גרם קמח סויה, 84.8 גרם תמצית מאלט, וחלק מהמים (~ 500 מ&quot;ל) ב 1 אחר כוס L. ערבבו 2 דקות עם מערבל יד ממונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת כל כוס ויוצקים לתוך בקבוק 4 L. השתמש שאריות מים כדי לשטוף את הכוסות ולהוסיף לתוך הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד סירופ תירס בהיר 140 מ&quot;ל ולהוסיף את הבקבוק, ומערבבים על ידי מתערבל. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיטוי במשך 50 דקות ב 121 מעלות צלזיוס (250 פרנהייט) בסביבה הנוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מעוקר, לשפוך מזון לתוך מבחנה 4 L להתקרר. עזרה בתהליך הקירור על ידי מיזוג עם מיקסר יד ממונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הבקבוק מתקרר מספיק לגעת, להוסיף 8.8 מ&quot;ל חומצה propionic ו -16.8 מ&quot;ל תסיסנית אנטי פטרייתי פתרון סוכן / אתנול. לערבב היטב. (בצע פתרון סוכן אנטי פטרייתי תסיסנית על ידי הוספת 380 גרם תסיסנית אנטי פטרייתי סוכן עד 1 L 200 אתנול הוכחה ערבוב על צלחת חמה עד שהיא נמסה, מוודא הפתרון אינו עולה על 70 מעלות צלזיוס.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מזון לתוך צלוחיות עד שהאוכל הוא כ 1 ס&quot;מ עמוק להתקרר ב RT במשך 2 - 3 שעות. חבר צלוחיות בחנות באינקובטור ב 25 ºC. השתמשו בהם במשך השבוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול מרית מספר פעמים לתוך השכבה העליונה של בקבוקון מזון להבקיע אותו. זה יעזור הזחלים להתחפר ולהאכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 22 - 24 שעות לאחר איסוף ביצים ישהסתיים, להשתמש במכחול קטן כדי לאסוף 50 instar הראשונים (L1) זחלים באותו הגודל למידע. מניח זחלים במזון הניסיוני. נקה את המכחול על מעבדה לנגב ולהבטיח שאין זחלים הנותרים על המכחול לפני שאתה ממשיך גנוטיפ אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בקבוקון של הזחלים באינקובטור ב 25 ºC ולאפשר לפתח. </li></ol> 3. לקבוע רמות שומן זחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 L 10x מניית PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גרם Na 2 HPO 4, ו -2.4 גרם KH 2 PO 4 כדי 800 מ&quot;ל מים בכוס L 2 המכיל בר ומערבבים. מערבבים ללא חום עד שכל המלחים משולבים. תביא pH ל -7.4. הגבר את עוצמת 1 ליטר עם מים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 2 L 1x PBS. הוספת 200 מ&quot;ל פתרון 10x PBS המניות 1,800 מ&quot;ל מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במלאי זה של 1x PBS לעשות 20% w / v סוכרוז. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבקבוקון של זחלים מןחממה אחת יש 20 - 40 זחלים פסעו במעלה הצדדים של הבקבוקון (בדרך כלל ביום החמישי לאחר אוספי ביצה). רשמו את התאריך והשעה של assay, כמו גם את מספר נודד הזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון ניסיוני על ידי הוספת 11.5 מ&quot;ל PBS ו -9 מ&quot;ל סוכרוז 20% צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20% סוכרוז הבקבוקון עד 0.5 - 1 ס&quot;מ מהחלק העליון של המכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במרית לעורר את השכבה העליונה בעדינות מזון הזחלים בחינם שעדיין מתחפרים האוכל. כל הזחלים יעלו אל פני השטח של הפתרון סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים להעביר את הזחלים בעדינים לתוך ריכוז סוכרוז הראשוני משלבים 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במרית לעורר הזחלים בעדינות בפתרון זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי או צינור חרוטי להעמיד על הקצה כמה פעמים כדי לערבב הפתרון ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uncap צינור החרוטים ו מערבולת ליצור מערבולת עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הזחלים להתיישב, או צף העליון של פתרון או סיnking לתחתית. חכה 2 - 5 דקות עבור הזחלים להתיישב. הערה: אם יש עדיין זחלים שאינם בהחלט גם צפו או שוקע, להרים קו להשתמש כנקודת חיתוך לתייג את הזחלים כמילת מצוף או משקולת. החל אותה אמת מידה זו לכל גנוטיפים. אנו משתמשים הזווית בתחתית צינור החרוטים כמו זחלים שלנו 17 מוטצית גבול. ADP או Sir2 ניתן להשתמש כביקורת חיובית lsd2 19 מוטציות עשויות לשמש כביקורת שלילית לכיול של assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספר הזחלים צף ואת ריכוז מסוים נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל סוכרוז 20% לפתרון ניסיוני להגדיל צפיפות שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.7 כדי 3.10. רשום את מספר זחלים צפו והריכוז החדש הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך הצעדים 3.12 ו 3.13 עד לפחות 95% של הזחלים הם צפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי לאסוף את כל הזחלים לתוך צלחת לנתיחה מלאה PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> obsזחלי erve תחת מיקרוסקופ הערה אם יש זחלים קטנים,-גלמים מראש, גלמים, או הבדלים אחרים בין גנוטיפים. הערה: באופן אידיאלי, כל הזחלים אמורים להופיע הומוגנית ובאותו השלב ההתפתחותי. ראינו רק מדידות שומן עקביות בתנאים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספר הזחלים הכולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להעביר 10 זחלים למעבדה לנגב להתייבש. לייבל צינור microcentrifuge ומניח 10 זחלים בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש להקפיא את הזחלים בחנקן נוזלי. אחסן את הצינור ב -20 ºC. </li></ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li>
<li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila+development+and+disease+Using+Drosophila+System+to+Study+Lipid+Metabolism+Lipids+Function+in+Drosophila+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Ruden, D. M., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+conservation+of+metabolism+explains+howDrosophila+nutrigenomics+can+help+us+understand+human+nutrigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Nutr%22%5BJournal%5D)">Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics.</a> Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).</li>
<li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+genetic+screens%2C+and+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circ. Res. 109, 794-806 (2011).</li>
<li>Trinh, I., Boulianne, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+obesity+and+its+associated+disorders+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila.</a> Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).</li>
<li>Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+body%2C+fat+pad+and+adipose+tissues+in+invertebrates+and+vertebrates%3A+the+nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus.</a> Lipids Health Dis. 13, 71(2014).</li>
<li>Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+transport+proteins+in+disease%3A+New+insights+from+invertebrate+models%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models.</a> Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).</li>
<li>Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+Drosophila+body+fat+quantification+by+a+coupled+colorimetric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay.</a> PLoS One. 6 (9), e23796(2011).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68, 105-115 (2014).</li>
<li>Al-Anzi, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+measurement+of+triglycerides+cannot+provide+an+accurate+measure+of+stored+fat+content+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila.</a> PLoS One. 5 (8), e12353(2010).</li>
<li>Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Lipids+in+Animal+Tissues+by+High-Performance+Thin-Layer+Chromatography+with+Densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Planar+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry.</a> J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).</li>
<li>Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).</li>
<li>Shui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+one+step+analysis+of+cellular+lipidomes+using+liquid+chromatography+coupled+with+mass+spectrometry%3A+application+to+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics.</a> Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).</li>
<li>Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+adiponectin+and+resistin+with+adipose+tissue+compartments%2C+insulin+resistance+and+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes.+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia.</a> Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).</li>
<li>Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+force+deficit+in+skeletal+muscles+of+old+rats+is+partially+explained+by+the+existence+of+denervated+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).</li>
<li>Mosher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+Drosophila+Arc1+and+a+specific+population+of+brain+neurons+regulates+organismal+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat.</a> Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).</li>
<li>Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+buoyancy-based+screen+of+drosophila+larvae+for+fat-+storage+mutants+reveals+a+role+for+Sir2+in+coupling+fat+Storage+to+Nutrient+Availability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001206(2010).</li>
<li>Current Bloomington Recipe for Drosophila Medium. , Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University. Available from:
 <a target="_blank" href="http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm">http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm</a> (2014).</li>
<li>Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Perilipin%2FADRP+homologue+Lsd2+regulates+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism.</a> Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).</li>
<li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+13C+Isotope+Labeling+Strategy+Reveals+the+Influence+of+Insulin+Signaling+on+Lipogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

ישנם מספר רב של טכניקות אשר פותחו כדי למדוד את רמות השומנים 8 - 10. עם זאת, כל אחת משיטות אלה מגיעה עם כמה חסרונות עיקריים שמטופלות על ידי assay מבוססי הציפה שתוארו לעיל. ראשית, assay זה הוא מהיר מאוד. בדיקת מפל ריכוזים מלא לוקחת לא יותר מ 30 - 60 דקות. זהו שיפור עצום על רוב הטכניקות הנמצאות בשימוש כיום. לדוגמה, quantitation השומנים ידי MS לוקח 7 - 9 שעות לבודד את השומנים ועוד כמה שעות לנתח אותם. זוהי הרתעה חזקה בעת ביצוע מסך על מספר רב של בעלי חיי...

תסיסנית שימש במשך יותר ממאה שנה בחקר הגנטיקה שאלות ביולוגיות בסיסיות אחרות. בעשורים האחרונים, זה הפך להיות ברור כי תסיסנית הוא כלי רב עוצמה בחקר מחלות אנושיות רבות. כמו 70 - 80% של גנים הקשורים למחלות בבני אדם יש ortholog זבוב מזוהה 1 - 4, תסיסנית מספקת מערכת לתרגום פשוט עדיין שבה כדי לחקור מחלות מורכבות. מטבוליזם בפרט הרוויח ממחקר כזה. לא רק הגנטיקה של מטבוליזם נשמרת היטב בין זבובים ובני אדם, אך האורגנים הרלבנטיים סוגי תאים הם גם מאוד דומים 2,5. לדוגמא, את השומן בגוף של חנויות הזבוב הוא triacylglycerides (TAG) וגליקוגן, פונקציות דומות לאלה שבוצעו בכבד יונקי שומן לבן רקמות 6. שימוש תסיסנית כמודל שמנת אדם בהרבה השתפר הבנתנו השומניםחילוף החומרים ואת הגנטיקה של ההשמנה 7. בשלב הזחל של פיתוח שימושי במיוחד ללימוד הפרדה של חומרים מזינים אחסון או ניצול כפי שהוא מוקדש אכילה לבין האחסון של אנרגיה כדי לשמש במהלך pupariation. נכון לעכשיו, יש הרבה שיטות כמותיות שונות של קביעת רמות אחסון שומן תסיסנית. השיטה הנפוצה ביותר היא assay colorimetric המצמיד (CCA) 8,9. CCA פותח לקביעת רמות TAG בסרום אדם ופועל על ההנחה כי גליצרול ששוחרר עמוד השדרה של טריגליצרידים יעברו כמה תגובות, בסופו של דבר וכתוצאה מכך תגובת חיזור מצמידי יצירת מוצר בצבע. ספיגה של אורכי גל מסוימים של אור נמדדה אז כדי לקבוע את הסכום הראשוני של הווה גליצרול. עם זאת, גליצרול יכול להיות משוחרר גם ובי-diacylglycerides בנוסף TAG ולכן לא יכול להיות מדד מדויק של יםtored השומן בגוף 9. יתר על כן, פיגמנט עין של זבובים בוגרים כתושים יכול להפריע כמה קריאות ספיגות ומסבכי תוצאות 9,10. לכן, CCA חייב להיות מלווה ומאומתים על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC), המאפשר הפרדה של רוב המשפחות השומנים שניתן ונרשמת על ידי צפיפות 10,11. עם זאת, כמה שיעורי שומנים כמו סטרולים לא ניתן לנתח וצריכים לכמת בצורה שונה 12. ספקטרומטריית מסה (MS) היא דרך מדויקת לכמת את כל סוגי ליפידים סלולריים גדולים 12,13. עם זאת, הליכי שומני החילוץ צורכים לנתח ידי MS הם גם זמן רב (רוב הלקיחה כמעט יום שלם) ויקר. כאן אנו מציגים שיטה חלופית במהירות ובזול לקבוע רמות שומן האורגניזם ב זחלי L3 של תסיסנית. השיטה המוצגת להלן מנצלת את ההבדל בצפיפות בין רקמת שומן ורקמה רזה. fa יונקיםיש t רקמות בצפיפות של כ 0.9 גר &#39;/ מ&quot;ל 14 תוך שרירי השלד כמו צפיפות של 1.06 גרם / מ&quot;ל 15. הבדל זה הוא שבעלי חיים עם חנויות גבוהות יותר של שומן יהיו צפיפות נמוכה יותר מחיות עם חנויות נמוכות יותר של שומן, אשר תאפשרנה להם לצוף טוב יותר בתמיסה של צפיפות קבועה. מאפיין זה מאפשר הקרנה מהירה מאוד של מספר רב של בעלי חיים בעת היותו גם זול ולא פולשנית. ניתוח מבוסס חוק ארכימדס נעשה שימוש הוא כדי לאשר את פנוטיפים של שינוי רגולטורים ידועים של רמות שומן, כמו גם לזהות רגולטורים גנטיים הנוירולוגי חדשים של השמנה 16,17.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Welch's Original 100% מיץ</td><td></td><td></td><td></td>ענבים</tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td></td><td></td><td>200 הוכחה</td></tr><tr><td>שמרי אופה</td> צהוב <td>פלייכמן</td><td></td><td></td></tr><tr><td> קמח תירס</td><td>קוואקר</td><td></td><td>מועשר</td></tr><tr><td>דרוזופילה אגר סוג II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>קמח סויה</td><td>ADM מרכיבים מיוחדים</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>תמצית מאלט</td><td>ברייס</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>סירופ תירס קל</td> חומצה <td>קארו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרופיונית</td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>50147491</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט נטול מים</td><td>פישר</td><td>S3933</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 35 x 10 מ"מ</td><td>פישר</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל פישר חרוטי</td><td></td><td>50-869-569</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה מבוססת חוק ארכימדס של קביעת רמות שומן<em&gt; תסיסנית</em

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Drosophila melanogaster היא מערכת ניסויית מרכזית בחקר ויסות השומן. קיימות כיום טכניקות רבות למדידת רמות השומן המאוחסן בדרוזופילה, אך רובן יקרות ו/או מייגעות ויש להן מגבלות ברורות. כאן, אנו מציגים שיטה לקביעת רמות השומן האורגניזם במהירות ובזול בזחלי L3 Drosophila. הטכניקה מסתמכת על ההבדלים בצפיפות בין רקמות שומן לרקמות רזות ומאפשרת זיהוי מהיר של פנוטיפים של שומן ורזה. אימתנו את הדיוק של שיטה זו על ידי השוואה לאחוז השומן בגוף כפי שנקבע על ידי מיצוי שומנים ניטרלי וכרומטוגרפיית גז יחד עם ספקטרומטריית מסה (GCMS). בנוסף, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לאיסוף וסנכרון של זחלים וכן מתכונים ניסיוניים רלוונטיים. הטכניקה המוצגת להלן מתגברת על החסרונות העיקריים בשיטות כימות השומנים הנפוצות ביותר ומספקת דרך רבת עוצמה לסנן במהירות וברגישות את זחלי L3 לפנוטיפים לוויסות שומן תוך שמירה על שלמות הזחלים. לבדיקה זו יש יישומים נרחבים לחקר חילוף החומרים וויסות השומן באמצעות דרוזופילה.

איור 1 מייצג דוגמא כיצד assay מבוסס הציפה יכול לזהות הן ממאגרי השומן גבוהים ונמוכים זחלי מניפולציות גנטיות. איור 1A מראה כי עירור או השתקה של קבוצת משנה מסוימת של נוירונים (E347) במוח זחל הגורם נמוך וגבוה שומן חנויות בהתאמה. שליטת הרקע הגנטית הזהה שמשה בשני המקרים. איור 1B מספק דוגמא לאופן פנוטיפ זה שהשיג assay הצפיפות מקבל תימוכי מיצוי שומנים ניטראליים וכימות ידי GCMS. <p class="jove_content" ...

כאן אנו מציגים שיטה למדידת רמות שומן האורגניזם ב instar השלישי (L3) בשלב הזחל של תסיסנית. שיטה זו מנצלת את הצפיפות נמוכה יחסית של רקמת שומן להבדיל בין זחלים עם ממאגרי שומן שונים. ניתוח מבוסס ציפה הוא כלי רב ערך עבור לסינון מהיר, לשחזור, וחסכוני.

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

המטרה הכללית של בדיקה זו היא לקבוע האם חלו שינויים ברמות אגירת השומן שעשויים להיגרם משינוי גנטי, תזונה או טיפול. שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המטבוליזם, כגון תרומות גנטיות או נוירונליות לנטייה להשמנה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה, כלכלית ובעלת הדירות גבוהה מאוד בהשוואה לשיטות אחרות המשמשות כיום.אנשים שאינם מכירים שיטה זו או שאינם מורגלים בעבודה עם זחלים בשלב הנדודים עשויים להיתקל בקושי בביצוע פרוטוקול זה, כיוון שלוח הזמנים ההתפתחותי של גנוטיפים שונים עשוי להיות משתנה מאוד. כדי להתחיל בהליך זה, הוסיפו כמות קטנה של משחת שמרים למרכז של פיתח עם רשת. השטיחו קצוות מחושלים בעזרת שפכטל.בשלב הבא, העבירו את הזבובים הרלוונטיים לתא איסוף ביצים, והניחו מעליהם את פלטת הרשת עם משחת השמרים כאשר הפנים פונה פנימה. לאחר מכן, הדביקו בעזרת סרט הדבקה את פלטת הרשת לתא איסוף הביצים כדי למנוע ממנה ליפול. הקפידו לרשום את פרטי הגנוטיפ והתאריך החשובים בתחתית פלטת הרשת.לאחר מכן, הפכו את תא איסוף הביצים כדי לאפשר לזבובים להטיל ביצים על פלטת הרשת. לאחר מכן, כסו את תא איסוף הביצים בקופסה פתוחה והניחו את תא איסוף הביצים המכוסה באינקובטור בטמפרטורה של 25 degrees celsius למשך ארבע עד שש שעות כדי לאפשר לזבובים להטיל ביצים. בסיום התהליך, הוציאו את פלטת הרשת מתא איסוף הביצים והעבירו את הזבובים בחזרה לבקבוק המזון המקורי שלהם.השתמשו בשפכטל כדי לנקות שאריות של משחת שמרים מלוח הסריג. לאחר מכן, אחסנו את לוח הסריג בתוך צלחת פטרי גדולה יותר בתוך אינקובטור לח בטמפרטורה של 25 degrees celsius למשך 24 שעות. בשלב זה, חרצו את השכבה העליונה של המצע על ידי דקירה של השפכטל מספר פעמים, כדי לאפשר לזחלים לחפור ולהזין.22 עד 24 שעות לאחר איסוף הביצים, השתמשו במכחול קטן כדי לאסוף 50 זחלים בשלב instar ראשון, בעלי גודל מקורב זהה, והעבירו אותם למבחורת ההזנה הניסויית. חשוב מאוד לבחור ולהעביר למזון הניסויי זחלים בעלי גודל מקורב זהה. פעולה זו תבטיח סנכרון הדוק של התפתחות הזחלים.בשלב הבא, נקו את מכחול הצבע באמצעות ניגון מעבדה וודאו שלא נותרו פשפשים על המכחול לפני ההמשך לגנוטיפ אחר. לאחר מכן, הניחו את מבחורת הפשפשים באינקובטור בטמפרטורה של 25 degrees celsius והניחו להם להתפתח. הוציאו את מבחורת הפשפשים מהאינקובטור ברגע שיהיו 20 עד 40 פשפשים הנודדים על דפנות המבחורה.רשמו את התאריך והשעה של הבדיקה וכן את מספר הזחלים הנודדים. לאחר מכן, הכינו את התמיסה הניסויית על ידי הוספת 11.5 milliliters של PBS ותשעה milliliters של 20%sucrose למבחנה קונית של 50 milliliters. הוסיפו 20%sucrose לבקבוקון עד שייגיע למרחק של one inch מהחלק העליון של הבקבוקון.השתמשו בשפכדל כדי לערבב בעדינות את השכבה העליונה של המזון כדי לשחרר את הזחלים שעדיין חופרים בתוכה. כל הזחלים יעלו לפני השטח של תמיסת הסוכרוז. לאחר מכן, העבירו בעדינות את הזחלים לתמיסת הסוכרוז הראשונית וערבבו אותם בעדינות.בעת העברת הזחלים לתמיסה הניסויית, יש להיזהר לא למעוך או לנקב את הזחלים. פעולה זו עלולה לשנות את תוצאות הבדיקה. סגרו את המבחנה הקונית והפכו אותה מספר פעמים כדי לערב את התמיסה ביסודיות.לאחר מכן, הסירו את הפקק מהמבחנה הקונית וסובבו אותה כדי ליצור מערבולת עדינה. המתינו שתי עד חמש דקות עד שהזחלים ישקעו, בין אם על ידי ציפה לחלק העליון של התמיסה או שקיעה לתחתית. רשמו את מספר הזחלים הצפים ואת ריכוז הסוכרוז הספציפי שנבדק.לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של 20% sucrose לתמיסת הניסוי כדי להגביר את צפיפותה. לאחר מכן, השתמשו בשפכטל כדי לערבב בעדינות את הלרובות. לאחר מכן, סגרו את הפיה של המבחנה הקונית והפכו אותה מספר פעמים כדי לערבב את התמיסה ביסודיות.לאחר מכן, הסירו את המכסה מהמבחנה הקונית וסובבו אותה כדי ליצור מערבולת עדינה. רשמו את מספר הזחלים הצפים ואת הריכוז החדש. המשיכו בתהליך זה עד שלפחות 95% מהזחלים יצופו.הוסיפו סוכרוז 20% לבקבוק הקוני עד שיישאר רווח של אינץ' אחד מהחלק העליון. לאחר מכן, אספו את כל הזחלים לצלוחית דיסקציה מלאה ב-PBS. בחנו את הזחלים תחת מיקרוסקופ כדי לאתר זחלים קטנים, טרום-בובנאות, בובנאות או כל הבדל אחר בין הגנוטיפים, וזאת כדי לוודא שהפרוצדורות בוצעו כראוי.לאחר מכן, רשמו את מספר הזחלים הכולל. לאחר מכן, העבירו 10 זחלים למטלית מעבדה לצורך ייבוש. סמנו מבחנה למיקרוצנטריפוגה והכניסו את הזחלים למבחנה.לאחר מכן, הקפיאו את הזחליים בהקפאה מהירה (flash freeze) בחנקן נוזלי ואחסנו את המבחנה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. מוצגת כאן דוגמה לאופן שבו הבדיקה המבוססת על ציפה יכולה לזהות רמות שומן מאוחסנות גבוהות ונמוכות יותר בזחליים שעברו מניפולציה גנטית. איור זה מראה כי עירור או השתקה של תת-קבוצה מסוימת של נוירונים במוח הזחל גורמים להפחתה או להגדלה של השומן המאוחסן, בהתאמה.אותה בקרת רקע גנטי שימשה בשני המקרים. להלן דוגמה לאופן שבו פנוטיפ זה, שהתקבל באמצעות בדיקת הצפיפות, מאושש על ידי מיצוי ליפידים ניטרליים וכמת hóa באמצעות GCMS. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה תוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי, וניתן לבצעה במקביל עבור גנוטיפים אחרים.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לסנכרן ככל האפשר את התפתחות הזחלים הניסיוניים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להקפיא את הזחלים בהקפאה מהירה (snap frozen) בחנקן נוזלי כדי להשתמש בהם בשיטות אחרות, כגון כרומטוגרפיית גזים עם ספקטרומטריית מסות (GC-MS), במטרה להשיג מידע נוסף, כמו סוגי מחלקות ליפידים ספציפיות בזחלים. לאחר פיתחוה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרי מטבוליזם לבחון את התרומה הגנטית ו/או הנוירונלית להשמנה ב-Drosophila.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה על האופן שבו ניתן לסרוק במהירות גנוטיפים כדי לזהות שינויים ברמות של שומנים מאוחסנים.

a-buoyancy-based-method-of-determining-fat-levels-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים בדיקה לניטור החמצת המעי בזבובי דרוזופילה. לאחר בליעה של מזון בתוספת צבע מחוון pH, החמצה של לומן המעי גורם לשינוי בצבע של צבע. בדיקה ויזואלית של מערכת העיכול של הזבובים כדי לבחון את שינוי הצבע מספקת עדות להחמצה.

בדיקת ניטור החמצת מעיים: טכניקה לחקר החמצת לומן המעי בדרוזופילה באמצעות צבע כחול ברומופנול

אנו מציגים שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות חזקות...

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

כאן אנו מתארים שיטה למדידה מהירה ומדויקת של ביצועי טיסה בדרוזופילה, המאפשרים תפוקה גבוהה הקרנה.

שיטה משופרת למדידה מדויקת והמהירה של טיסה בביצועים<em&gt; דרוזופילה</em

הפרעות מטבוליות הן בין אחת המחלות הנפוצות ביותר בבני אדם. אורגניזם המודל גנטי הצייתן ד melanogaster יכול לשמש כדי לזהות גנים רומן שמווסתים את חילוף חומרים. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה יחסית המאפשרת ללמוד את קצב חילוף חומרים בזבובים על ידי מדידת ייצור CO 2 שלהם.

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

דג הזברה מתגלה כמודל רב ערך של עיבוד שומנים תזונתי ומחלות מטבוליות. מתוארים פרוטוקולים של הזנת זחלים עשירה בשומנים, הדמיה חיה של אנלוגים של שומנים פלואורסצנטיים תזונתיים וכימות צריכת מזון. ניתן ליישם טכניקות אלו במגוון טכניקות סינון, הדמיה וחקירה מונעת השערות.

עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון

בדיקת FEeder (CAFE) היא שיטה פשוטה, ידידותית לתקציב ואמינה ביותר לחקירת מנגנונים העומדים בבסיס צריכת מזון. בשימוש עם אורגניזם המודל הגנטי הרב-תכליתי Drosophila melanogaster, הוא מספק אמצעי רב עוצמה להשגת תובנות חדשות לגבי מנגנוני ויסות צריכת מזון.

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em&gt; תסיסנית</em

עבודה זו מציגה שיטה במהירות ובמדויק לכמת את הפיגמנטציה הבטן של תסיסנית melanogaster באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלית. שיטה זו מייעלת את ההליכים בין רכישת פנוטיפ וניתוח נתונים וכולל הדגימה הרכבה, רכישת תמונה, מיצוי ערך פיקסל, ומדידה תכונה.

כימות פיגמנטציה בטן ב<em&gt; תסיסנית מלנוגאסטר</em

זוהי דיאטה שומן גבוהה האכלה פרוטוקול לזירוז ההשמנה דרוזופילה, דוגמנית על הבנת המנגנונים המולקולריים יסודי מעורב lipotoxicity. הוא גם מספק assay triacylglyceride של תפוקה גבוהה למדידת הצטברות שומן דרוזופילה ואת פוטנציאל אחרים מודלים (חרק) בתנאים תזונתיים, סביבתיים, גנטי או פיזיולוגיים שונים.

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

הציגו כאן הן שיטות מפורטות לחיתוך וליפיד droplet כתמים של oenocytes ב הזחלים Drosophila ילה באמצעות BODIPY 493/503, שומנים בצבעי פלורסנט ספציפי לשומנים.

לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

להלן פרוטוקול המאפשר כימות צבעוני של כמות המזון הנאכל בתוך פרק זמן מוגדר על ידי זחלי מלנוגאסטר דרוזופילה שנחשפו לדיאטות באיכות מקרונוטריאנטית שונה. מבחנים אלה מתבצעים בהקשר של מסך תרמוגנטי עצבי.

כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השראת האוטופגיה בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster באמצעות דלדול חומרי מזון ומנתח שינויים באוטופגיה באמצעות זני זבובים טרנסגניים.

ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster

למדו שיטת מדידת שומן מבוססת ציפה בזבובי פירות Drosophila melanogaster בשלב הזחל L3. שיטה זו מאפשרת סינון מהיר וכלכלי של שינויים ברמות האחסון השומני בחקר מטבוליזם וגנטיקה.

שיטה מבוססת חוק ארכימדס של קביעת רמות שומן

גלה סרטונים נוספים