Name: -Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למד את שיטת החתך ההיברידי לשיפור שלמות רקמות צמחים סרבנים בעלי סיבים קשים וגבישי סיליקה. טכניקה זו משמרת מבנים אנטומיים ומאפשרת היברידיזציה in situ ו-FISH באיכות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה על התמיכה הטכנית של גב' הונג שיאן הסינג, מר מין ג'נג לי ומר אריק סי.פ. וו. אנו מביעים את הערכתנו למירנדה לוני על העריכה באנגלית.

<ol><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. 3, 1-2 (2008).</li>
<li>Knox, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-sectioning+of+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Freeze-sectioning of plant tissues.</a> Stain Technol. 45, 265-272 (1970).</li>
<li>Ruan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cryosection+method+for+polyethylene+glycol+hydrogels+used+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.%3A+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved cryosection method for polyethylene glycol hydrogels used in tissue engineering.</a> Tissue Eng.: Part C Methods. 19, 794-801 (2013).</li>
<li>Prychid, C. J., Rudall, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oxalate+crystals+in+monocotyledons%3A+A+review+of+their+structure+and+systematics%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Bot%22%5BJournal%5D)">Calcium oxalate crystals in monocotyledons: A review of their structure and systematics.</a> Ann Bot. 84, 725-739 (1999).</li>
<li>Prychid, C. J., Rudall, P. J., Gregory, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematics+and+biology+of+silica+bodies+in+monocotyledons%5BTitle%5D)+AND+%22Bot.+Rev%22%5BJournal%5D)">Systematics and biology of silica bodies in monocotyledons.</a> Bot. Rev. 69 (4), 377-440 (2004).</li>
<li>Arnott, H. J., Pautard, F. G. E., Steinfink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+calcium+oxalate+monohydrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of calcium oxalate monohydrate.</a> Nature. 208, 1197-1198 (1965).</li>
<li>Mitani, N., Yamaji, N., Ma, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+maize+silicon+influx+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of maize silicon influx transporters.</a> Plant Cell Physiol. 50, 5-12 (2009).</li>
<li>Hayasaka, T., Fujii, H., Ishiguro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+silicon+in+preventing+appressorial+penetration+by+the+rice+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">The role of silicon in preventing appressorial penetration by the rice blast fungus.</a> Phytopathology. 98, 1038-1044 (2008).</li>
<li>Ma, J. F., Yamaji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+uptake+and+accumulation+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Silicon uptake and accumulation in higher plants.</a> Trends Plant Sci. 11, 392-397 (2006).</li>
<li>Chen, W., Tang, C., YL, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+doubling+by+in+vitro+culture+of+excised+protocorms+or+protocorm-like+bodies+in+Phalaenopsis+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Tiss+Org%22%5BJournal%5D)">Ploidy doubling by in vitro culture of excised protocorms or protocorm-like bodies in Phalaenopsis species.</a> Plant Cell Tiss Org. 98, 229-239 (2009).</li>
<li>Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Hybridization+for+the+Precise+Localization+of+Transcripts+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants.</a> J. Vis. Exp. (57), e3328(2011).</li>
<li>Park, D. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">PCR Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 687, (2011).</li>
<li>Lin, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+annotation%2C+expression+profiling%2C+and+protein+interaction+studies+of+the+core+cell-cycle+genes+in+Phalaenopsis+aphrodite%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide annotation, expression profiling, and protein interaction studies of the core cell-cycle genes in Phalaenopsis aphrodite.</a> Plant Mol Biol. 84, 203-226 (2014).</li>
<li>Lee, Y. -I., Yeung, E. C., Lee, N., Chung, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryology+of+Phalaenopsis+amabilis+var.+formosa%3A+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Bot+Stud%22%5BJournal%5D)">Embryology of Phalaenopsis amabilis var. formosa: embryo development.</a> Bot Stud. 49, 139-146 (2008).</li>
<li>Endo, M., Ikusima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+rhythm+and+characteristics+of+photosynthesis+and+respiration+in+the+leaf+and+root+of+a+Phalaenopsis+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant.</a> Plant Cell Physiol. 30, 43-47 (1989).</li>
<li>Guo, W. J., Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+leaf+and+plant+age%2C+and+day%2Fnight+temperature+on+net+CO2+uptake+in+Phalaenopsis+amabilis+var.+formosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Amer.+Soc.+Hort.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2 uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa.</a> J. Amer. Soc. Hort. Sci. 131, 320-326 (2006).</li>
<li>Lewin, J., Reimann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+and+plant+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+of+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Silicon and plant growth.</a> Ann. Rev. of Plant Physiol. 20, 289-304 (1969).</li>
<li>Kaufman, P. B., et al. Silica in shoots of higher plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+PB+%22Silicon+and+siliceous+structures+in+biological+systems%22">Silicon and siliceous structures in biological systems</a>. Simpson, T. L., Valcani, B. E. , Springer-Verlag. 409-449 (1981).</li>
<li>Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Kranz+anatomy+to+understand+C4+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution.</a> J Exp Bot. 65, 3357-3369 (2014).</li>
<li>Liu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+transcriptional+dynamics+of+maize+embryonic+leaves+during+seed+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3979-3984 (2013).</li>
<li>Driscoll, S. P., Prins, A., Olmos, E., Kunert, K. J., Foyer, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+adaxial+and+abaxial+stomata%2C+epidermal+structure+and+photosynthesis+to+CO2+enrichment+in+maize+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Specification of adaxial and abaxial stomata, epidermal structure and photosynthesis to CO2 enrichment in maize leaves.</a> J Exp Bot. 57, 381-390 (2006).</li>
<li>Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundström, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-radioactive+in+situ+Hybridization+Protocol+Applicable+for+Norway+Spruce+and+a+Range+of+Plant+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species.</a> J. Vis. Exp. (26), (2009).</li>
<li>Hejatko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+technique+for+mRNA+detection+in+whole+mount+Arabidopsis+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization technique for mRNA detection in whole mount Arabidopsis samples.</a> Nat Protoc. 1, 1939-1946 (2006).</li>
<li>Javelle, M., Timmermans, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+small+RNAs+in+plants+by+using+LNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In situ localization of small RNAs in plants by using LNA probes.</a> Nat Protoc. 7, 533-541 (2012).</li>
<li>Drea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of gene expression in plants.</a> Methods Mol Biol. 513, 229-242 (2009).</li>
<li>Drea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+method+for+systematic%2C+high+resolution+in+situ+analysis+of+mRNA+distribution+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A streamlined method for systematic, high resolution in situ analysis of mRNA distribution in plants.</a> Plant Methods. 1, 8(2005).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

יש צמחי תאים קירות תא נוקשים, סיבים קשים, קריסטלים, ואת תכולת מים גבוהה כי לגרום לבעיות קריעת רקמות במהלך חתך רקמות צמח. למרות חתך מבוסס פרפין משמש לעתים קרובות עבור רקמות צמח, את הגבישים אנדוגני לעתים קרובות לקרוע את רקמת הצמח במהלך החתך (איור 1). בגלל תכולת מי מטבעם הגבוה בתוך בתאי הצמח, חתך מבוסס cryostat לעתים קרובות גורם לתאי שבור וחתכי רקמות סדוקים. במחקר הנוכחי, פרוטוקול פרפין הטבעה ו cryosection בשילוב בשם Hybrid-Cut פותח וקטעי רקמה באיכות טובות התקבלו. פרוטוקול זה פותר את הבעיה קשורה תכולת מים גבוהה על ידי החדרת הטבעת פרפין, ומצמצם את אפקט הקריעה על ידי הקשחת פראפין תחת בטמפרטורה נמוכה במהלך החתך (איור 3). לכן, פרוטוקול שונה זו יש יתרון על פני משני sectio פרפין המבוססנינג או Cryosectioning עבור שמירה על שלמות רקמות הצמח. כתב יד זה מדגים כי השיטה ההיברידית-Cut משמר שלמות רקמות ברקמות רבות של סחלב Phalaenopsis כגון ניצן השחי, זרע, ו PLB, וכו &#39;המכילות רמות גבוהות של גבישים (איורים 3-4). יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן פלח כגון איברי רבייה ועלים של אורז, תירס, חיטה המכילים סיליקה גבוהה (איורים 5-6). יש להניח, פרוטוקול זה ניתן להחיל את וודי צמחים המכילים סיבים תזונתיים גבוהים. באופן כללי, רקמת תיקון ביסודיות חשובה מאוד על Cut ההיברידי. מצאנו כי חומצת פורמלדהיד-חומצי-אלכוהול (FAA) מקבע עדיף PFA כדי לשמור על שלמות הרקמה של רקמות סרבניות מסוימות כגון בלוטות axially, שורשים, וכו &#39;עם זאת, PFA עובד טוב יותר מאשר ה- FAA בשימור שלמות RNA. לכן PFA מומלץ לתקןמדגם עבור כלאה באתרו (שאני עורך) עבודה. הפרוטוקול המתואר כאן נועד לניסוי RNA שאני עורך. לכן, כל ריאגנטים הוכנו כדי למנוע השפלה RNA על ידי ביטול זיהום RNase ידי טיפול DEPC. אם סעיף Hybrid-Cut הוא ללימודי אנטומיים, אוסמוזה ההפוכה רגילים (RO) מי חיץ הנגזרות שלה או ריאגנטים כשרים. צמצום דגימת גודל ועובי כדי פחות מ -3 מ&quot;מ מועיל עבור חדירה. יתר על כן, זמן טבילה גובר התייבשות וחדירה נחוץ רקמות מרקם קשות. הגבלת פרוטוקול זה עלולה עקב בעיות שנגרמות על ידי קיבעון לקוי, התייבשות, וחדירה של דגימה. לכן, התאים זמן עיבוד בכל צעד קריטי לייצר בלוק פרפין באיכות טובה. בדרך כלל, רקמה קשה צריכה עוד זמן עיבוד מאשר רקמה רכה. בנוסף, הראינו כי Hybrid-Cut עבד בהצלחה wi שילובשאני עורך ה לספק פריסה המרחבית של התמלילים שנבחרו (איור 7). לסיכום, פרוטוקול זה שימושי לחקר אנטומיה של צמח ומספק מפת RNA ספציפי רקמות של הגנים הנבחרים. בנוסף הוא עשוי להיות מיושם על מחקרים מולקולריים אחרים כגון תיוג סוף מסוף deoxynucleotidyl transferase dUTP ניק (TUNEL) assay, הקרינה הכלאה באתרו (FISH), וטכניקות immunostaining. לסיכום, פרוטוקול חתך רקמות משופר זו הוא גם שימושי ומועיל לחוקרים בקהילות צמח.

שיטת החתך מבוסס פרפין היא טכניקה בשימוש נרחבת עבור מחקרים אנטומיים. שימור האנטומיה רקמות שלמות חשוב ללימודי מורפולוגיים וביולוגיים. הטכניקה חתכה-מוטבע פרפין יש יתרון משום-הטבעת פרפין שומרת מורפולוגיה תאים ורקמות. בנוסף, בלוקי פרפין ניתן לאחסן בנוחות לתקופות זמן ארוכות. עם זאת, חתך-מוטבע פרפין אינו מתאים רקמות הצמח המכיל גבישי תאיים. קריסטלים בתוך התאים לעתים קרובות לקרוע סרטים פרפין שלמות רקמות נזק במהלך חתך. בניגוד חתך פרפין, cryosectioning הוא מהיר יחסית וחתכים ניתן להשיג ללא קיבוע, התייבשות סדרתי או הטבעה חדירה 1 בינוני. Cryosections תואם יישומים רבים כגון אימונוהיסטוכימיה, כלאה באתרו, ואנזים היסטוכימיה. היתרון השני של cryosectioning הואהשיטה זו אינה עוברת תהליכי denaturation פוטנציאל כגון טמפרטורה גבוהה טיפולים כימיים, כך מולקולות הסלולר נשמרות היטב בתוך קטעי הרקמה 2. Cryosectioning מעדיף בדרך כלל מעל מבוססי פרפין חתך ללימודים ברקמות בעלי חיים. עם זאת, cryosectioning הוא לא הבחירה הראשונה בצמחים כי טמפרטורה מקפיאה לפעמים גורם להיווצרות גבישי קרח המשפיעים על איכות שלמות סעיף. למרות ויסות האוסמוטי כגון פתרונות סוכרוז, פוליאתילן גליקול (PEG), או גליצרול 3 דווחה להפחית היווצרות קרח קריסטל בתנאי הקפאה, השיפור רחוק מלהיות אופטימלי. כדי להסתגל לסביבות שונות, צמחים שונים יש לעתים קרובות תאי מרקם צמח רקמות ברורים התפתחו כדי ליצור קירות תא נוקשים, סיבים קשים, וקריסטלים 4,5. לדוגמא, גבישים אוקסלט מסיסים וגופים סיליקה הם די נפוציםצמחים 6. גופי סיליקט / דווחו גבישים כדי לסייע לשמור על אדריכלות צמח, תְמִירוּת, ולמנוע מחלות או מזיקים בצמחי דגנים 7-9. הסחלבים בעציץ וחותך-הפרח בשוק הסחלב פורח וזה ענף צומח. אפרודיטה Phalaenopsis (סחלב עש) היא אחד צמחי נוי יצוא החשובים ביותר בטייוואן. במאמצים משמעותיים נעשו כדי להבין את השינויים מורפולוגיים פיסיולוגיים של התהליכים הפורחים סחלבי Phalaenopsis. קוצים פרחוניים של סחלבי Phalaenopsis יזומים מן ניצני בית השחי בבסיס עלה. לאחר תקופה של טמפרטורת סביבה מגניבה (כ אחת וחצי חודשים), בלוטות בית השחי להגדלה, לשבור תרדמת, ו לבלוט מהבסיס עלה להתפתח קוצים פרחוניים צעירים. כדי להבין את פיזיולוגיים, הסלולר, ותהליכים מולקולריים חניכת ספייק, זה הכרחי כדי לפתח טכניקת אנטומיים חזקה כדי visuaרקמות או סמנים Lize מבעוד מועד. עם זאת, הנוכחות של גבישים בכל מקום ברקמות סחלב, במיוחד ניצני בית השחי, עושה עבודה אנטומיים קשה. כאן אנו בקשנו לשפר שלמות סעיף של רקמות צמח סרבניות כי כבר ראו עד כה מאתגר מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים פרוטוקול משופר בשם Hybrid-Cut. זוהי שיטת חתך מבוסס פרפין כי מתבצעת באמצעות cryostat. הטבעת פרפין פותר תכולת מים גבוהה ברקמות צמח. חתך מתחת לטמפרטורה נמוכה מקשה את בלוק פרפין, מפחית קריסטל קורע בעיה, ומשפר שלמות רקמות משמעותית. פרוטוקול זה משפר שלמות רקמות משמעותית עבור דגימות צמח סרבניות.

<table><tbody><tr><td>מרכז הטבעה דגם EC780-1</td><td>CSA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome דגם RM2255</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat דגם CM 1950</td><td>מיקרוסקופ Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Scope A1&nbsp;</td><td>זייס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מוראשיג'ה & Skoog בינוני כולל ויטמינים</td><td>Duchefa Biochemia</td><td>M0222.0050</td><td></td></tr><tr><td>RNase Free Surface Decontaminant</td><td>Apex</td><td>10-228</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td> <td>Bio Basic Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>D801154</tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>MDBio, Inc.</td><td>101-7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי, קריסטל (KCl)</td><td>J.T. Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>Showa</td><td>19430160</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית (H2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת גלוטראלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>פוליאוקסיאתילן 20 סורביטן מונולאורט (Tween 20)</td><td>J.T. Baker</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>אוקטיל פנול אתוקסילט (טריטון X100)</td><td>J.T. בייקר</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני נצנוץ זכוכית</td><td>Newastar</td><td>DG60805-00020</td><td></td></tr><tr><td>ואקום ייבוש</td><td>Violet Bioscience Inc.</td><td>TS-402030</td><td></td></tr><tr><td>משאבת שבשבת סיבובית RZ2.5</td><td>Vacuubrand</td><td>36149406</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>J.T. Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Sub-X&nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>3803670</td><td>תחליף קסילן</td></tr><tr><td>Paraplast Plus&nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>39602004</td><td>רקמות הטמעת פרפין</td></tr><tr><td>SUPERFROST זכוכית מיקרו שקופית</td><td>Matsunami</td><td>S7441</td><td></td></tr><tr><td>FSC 22 Clear&nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>3801480</td><td>תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylenes, Purified</td><td>Leica Surgipath</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Merck</td><td>HX305311</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Micromount</td><td>Leica Surgipath</td><td>3801731</td><td>הרכבה בינונית</td></tr><tr><td>pGEM וקטור T-easy</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td></td><td></td>3115879001</tr><tr><td>SP6 / T7 DIG RNA ערכת תיוג</td><td>Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>NBT / BCIP פתרון מלאי</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr></tbody></table>

-cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

סעיף צמח שמירה על שלמות חיונית ללימוד מבנים אנטומיים מפורטים על הסלולר, הרקמות, או אפילו ברמת איברים. עם זאת, תאים ולשתול יש קירות תא נוקשים, סיבים קשים וקריסטלים (סידן אוקסלט, סיליקה, וכו &#39;), ואת תכולת מים גבוהה כי לעתים קרובות לשבש שלמות רקמות במהלך חתך רקמות הצמח. מחקר זה קובע שיטת חתך רקמות פשוט חותך-היברידיות. פרוטוקול זה משנה טכניקת חתך מבוסס פרפין משפר את שלמות סעיפי רקמות מצמחים שונים. רקמות צמח היו מוטבעות פרפין לפני החתך בתוך cryostat ב C -16 °. חתך מתחת לטמפרטורה נמוכה מוקשה האבנית פרפין, קריעה מופחתת מגרדת, שלמות רקמות השתפרה משמעותית. פרוטוקול זה יושם בהצלחה לרקמות סחלב Phalaenopsis עשירי סידן אוקסלט וכן רקמות סרבניות כגון orga רבייהns ועלים של אורז, תירס, חיטה. בנוסף, באיכות גבוהה של קטעי רקמה מן-Cut היברידי יכול לשמש בשילוב עם הכלאה באתרו (שאני עורך) כדי לספק דפוסי הביטוי המרחבי של הגנים של עניין. לסיכום, פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור רקמות צמח סרבניות המכילות תוכן קריסטל או סיליקה גבוה. איכות טובה סעיפי רקמות לאפשר מחקרים ביולוגיים מורפולוגיים אחרים.

Hybrid-Cut משפרת את שלמות סעיפי רקמות הבנת האנטומיה של המבנה הפרחוני הרבייה חשובה על חקירת המנגנון הבסיסי של חניכת פרחי סחלבים. עם זאת, הצטברות של גבישי אוקסלט תאיים סחלבים Phalaenopsis עושה מחקרים כאלה משימה מאתגרת. כדי לעקוף את הבעיות הקשורות קריעה הנגרמת על ידי גבישים במהלך תהליך חתך (איור 1), פיתחנו מערכת והענקנו Hybrid-Cut. פרוטוקול זה משלב טכניקות הטבעת פרפין מסורתיות cryosection. ראשון בדקנו Hybrid-חותך ניצני בית השחי של סחלב Phalaenopsis כי הם ידועים לשמצה קשיחה רקמות ותוכן קריסטל גבוה. רקמת ניצן השחי נקבעה 4% PFA (ראה פרוטוקול, צעד 1.3). לאחר התייבשות אתנול סדרה ואני שעוות פרפיןnfiltration, באיבו בבית השחי ננעץ בלוק פרפין. הבלוק היה מטופח עד לגודל מתאים לפני החתך (איור 2 א). כמות קטנה של אוקטובר יושמה אז למרכז הבמה cryostat (איור 2 ב). בלוק פרפין אז דבק הבמה באמצעות OCT. הבמה הייתה מודגרות cryostat במשך 10 דקות כדי לאפשר התמצקות מלאה של אוקטובר לפני חתך (איור 2 ג) ולאחר מכן cryosection בוצעה בתוך -16 תא ° C (איור 2 ד). לשם השוואה, בלוק פרפין המכיל ניצן השחי של סחלב Phalaenopsis היה נתון חתך microtome קבוע. כפי שניתן לראות בתרשים 1 א &#39;, קריעה חמורה של סרטי פרפין נצפתה לאחר חתך microtome. שלמות רקמות המבנה התאי נפגע גם (איור 1B). Hybrid-Cut, ומצד שני,סעיפי רקמות ללא פגע פיק (איור 3 א) עם שלמות מבנית השתמרה (האיור 3B). יישום של Hybrid-גזור רקמות שונות של פ אַפְרוֹדִיטָה כדי להמשיך לבדוק רמת המוכנות של-Cut היברידי, בדקנו רקמות שונות של סחלבים Phalaenopsis. היא לעתים קרובות קשה להשיג חלקים של זרעים עם שלמות רקמות טובה בגלל מעטת הזרע הקשוחה. שימוש בפרוטוקול זה, מבנים מפורטים של זרעים נשתמרו לאחר החתך (איור 4 א). כפי שניתן לראות בתרשים 4A, גופים חלבון, מוצרי אחסון משותף 14, ניתן היה לזהות בבירור. Hybrid-Cut גם עבד בהצלחה והראה המבנים המפורטים של meristem פסגת לירות של protocorm הישן של חודש אחד (המבנה ניבט מזרע) (איור 4 ב) וprotocorm כמו- גופים (PLBs, איור 4C). הגבישים תאיים נצפו קטעי PLB. סחלבים Phalaenopsis יש עלים עבים ועסיסיים, והם מבצעים מטבוליזם של חומצת הטבוריתיים (CAM) -type הפוטוסינתזה 15. הסעיף הרוחבי של להב עלה הראה תאי mesophyll גדולים חבילות וסקולרית המכיל עצה ואת השיפה (איור 4D). פתחי הפיוניות מעטים נצפו על פני העלה abaxial בשעות היום (4D איור). למעשה, צמחי CAM התפתחו על מנת למקסם רווח פחמן אך בו זמנית להקטין את איבוד מים על ידי פתיחת stomates שלהם בלילה בתנאים צחיחים 15,16. Meristem פסגת שורש פ אפרודיטה מוצגת באיור 4E. תאי קצה השורש הופיעו להכיל מספר לא מבוטל של גבישים, אשר מאוד השתמרו היטב לאחר החתך (4E איור). סעיפים אורכים של קוצים פרחוניים צעירים היוו אינפורמטיון על הארכיטקטורה של primordials הפרחוני הצעיר (איור 4F). יתר על כן, עלי גביע, עלי כותרת, שפית, ו pollinia ניתן היה לזהות בבירור ממדור האורך של ניצני פרחים צעירים שסיימו בידול זה 5 מ&quot;מ ניצן של פרח (איור 4G). שים לב כי גבישים שנצברו עליי הגביע של בלוטות פרחוניות צעירות. בקיצור, פרוטוקול זה עובד באופן עקבי כדי לשמור על שלמות רקמות מייצר מורפולוגיה שלמה המאפשר מחקרים הסלולר אנטומיים והאפשריים. Hybrid-Cut שומר שלמות רקמות ב פלח גם בדקנו Hybrid-גזור על פלחה כגון אורז, חיטה ותירס המכילים תוכן סיליקה גבוהה 17,18. כפי שניתן לראות בתרשים 5, על שלמות רקמות סעיפים הרוחביים של אורז, חיטה, תירס ועלים שופרה באופן משמעותי על ידי Hy<html> Brid-Cut השיטה. העצה, השיפה, תאי mesophyll, stomates, ותאי bulliform שולט מתגלגל של הלהב עלה כדי למנוע אובדן מים זוהו בבירור ממקטעים של עלים אורזים. האנטומיה קרנץ, תאי mesophyll, וצרורות כלי דם של עלה התירס 19,20 זוהו בבירור. זה היה מסקרן למצוא צפיפות גבוהה של stomates משני צדדי adaxial ו abaxial עלי תירס (איור 5). יחס הפיוניות adaxial ו abaxial של 0.7 תירס דווח בעבר 21. בנוסף, פרוטוקול זה גם עבד בהצלחה לספק את מורפולוגיה התא המפורטת של spikelets מאורז, חיטה, תירס (איור 6). Spikelets ידוע מכיל סיליקה 9 בשפע. בדרך כלל, דבר גורם קושי בקיום חתך רקמות. ב הכלאה באתרה = &quot;1&quot;&gt; הגנום וגישות transcriptomic משמשים כדי ויסמנו את הפונקציות של גנים. מתן פריסה המרחבית של תמלילי הגנים של עניין בהקשרים התפתחותיים או סביבתיים חשוב להוסיף תובנה חדשה הפונקציות האפשריות של הגנים. In-situ כלאה (שאני עורך) פותח כדי למקם דפוסי ביטוי גנים ברמת הרקמה 11, 22-25. בנוסף, שאני עורך יכול לספק הסלולר, ובמקרים מסוימים משנה הסלולר, ברזולוציה של הפצת mRNA באורגניזמים רב-תאי 26. במהלך שאני עורך, רנ&quot;א שלם רקמות הוא חיוני כדי להשיג מידע מרחבים אמין על התמליל שנבחר. בדקנו שאני עורך באמצעות פרוטוקול היברידי-Cut הגן אקטין (PATC157348) שובט באמצעות פריימרים 5&#39;-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 &#39;ו 5&#39;- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3&#39; כדי לקבל amplicon 242 נ&quot;ב PCR B1 Cyclin:.. 1 (PATC146999) גן ספציפי רצף קידוד פריימרים באמצעות 5&#39;-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 &#39;ו 5&#39;- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3&#39; כדי לקבל 327 נ&quot;ב amplicon PCR. אחרי שאני עורך, אקטין Cyclin B1: ביטוי גנים 1 היה פיקוח ב ניצני בית השחי צעירים בוגרים (איור 7). גני שניהם באו לידי ביטוי בתאי meristematic של 2 nd ו -3 ניצני rd השחי, עם זוהו אותות חזקים ב 3 rd ניצני בית השחי. תוצאות אלו הראו כי Hybrid-Cut לשמור האנטומיה טובה ולספק דפוס ביטוי גנים מרחבית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig1.jpg" /> איור 1: סעיף פרפין מסורתי גורם קריעה חמורה של רקמות בלוק פרפין המכיל ניצן השחי של סחלב Phalaenopsis היה נתון חתך microtome קבוע.. קריעה חמורה של סרטי פרפין נצפתה לאחר חתך microtome מסורתי (א) </strong&gt;. שלמות רקמות המבנה התאי נפגע גם (B). החיצים מראים את הקריעה החמורה של פרוסת הרקמות. ראש החץ מציג את הגופות קריסטל. סרגל קנה מידה -100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig2.jpg" /> איור 2:. Hybrid-Cut חתך שיטת רקמת ניצן השחי נקבעה PFA והרקמות היו מיובשות, הסתננו עם שעוות פרפין, ומוטבעי בלוק פרפין. בלוק פרפין היה גזוז לגודל מתאים (א). מתחם חיתוך טמפרטורה אופטימלית (אוקטובר) היה מוחל על מרכז הבמה cryostat (B). בלוק פרפין מצורף ב- OCT על במת cryostat. תחת בטמפרטורה נמוכה, בלוק פרפין<html> ששקדו על הבמה cryostat באמצעות אוקטובר (C). בחתכי רקמה היו מחולקים בתא cryostat ב -16 ° C (D). ברים סולם מייצגים 0.5 ס&quot;מ (א), 1 ס&quot;מ (BD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig3.jpg" /> איור 3: Hybrid-Cut משפר Integrity סעיף בלוק פרפין המכיל ניצן השחי של סחלב Phalaenopsis היה נתון-Cut ההיברידי חתך (א) ואת השיטה ההיברידית-Cut פיק קטעים עם שלמות רקמות מצוינת (B).. ראש החץ מראה את גופות קריסטל אנדוגני משובצות ברקמת ניצן השחי. סרגל קנה מידה -100 מיקרומטר.r קבל = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig4.jpg" /> איור 4: יישום של Hybrid-חותך סעיפי רקמות שונים של סחלב Phalaenopsis סחלב שונה. רקמות היו מחולקות בשיטת Hybrid-Cut, כגון חתך לאורך של זרע סחלב בשלב הבוגר (א), סעיף אורך של protocorm (B), חתך לאורך של גופי protocorm דמוי (PLB) (ג), סעיף רוחבי של להב עלה (D), חתך לאורך של השורש (E), חתך לאורך של ספייק פרח הצעיר (F), וסעיף אורך של ניצני פרחים צעירים (G). סעיפי רקמות הוכתמו על ידי hematoxylin. SC, קליפת הזרע; PB, גוף חלבון; M,meristem; MP, אמא PLB; עקור, בת PLB; מודעות, משטח עלה adaxial; Ab, משטח עלה abaxial; St, הפיוניות; MC, תא mesophyll; VB, צרור וסקולרית; RC, כובע שורש; FB, ניצן של פרח; Se, עָלֶה גָבִיעַ; Pe, עלה כותרת; La, שפית; פו, pollinia; Ro, rostellum; Ca, יבלת. ראשי חץ להראות גבישים. ברי סולם מייצגים 20 מיקרומטר (AE) ו -200 מיקרומטר (FG). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig5.jpg" /> איור 5:. Hybrid-Cut שומר Integrity רקמת העלה ב פלחה מספר השוואה של רקמת העלה בשיטת פרפין המסורתית (בחלונית הימנית) ואת הטכניקה Hybrid-Cut שפותחה במחקר זה (פאנל הימני). תמונות להראות עלו סעיפים רוחביים של אורז, חיטה, תירס. MC, תא mesophyll; Ph, השיפה; St, הפיוניות; לפנה&quot;ס, bu<html> תא lliform. חצים מראים הקריעה של פרוסת רקמה. ראשי חץ להראות גופות סיליקה. העיגולים מקווקוים הכחולים עולים האנטומיה קרנץ ב תירס C4. סולם bars 20 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig6.jpg" /> איור 6:. Hybrid-Cut שומר שלמות רקמות Spikelet ב פלחה כמה השוואת שלמות רקמות סעיפים spikelet בין פרפין המסורתי ושיטות Hybrid-Cut. חצים מראים הקריעה של פרוסת רקמה. ראשי חץ עולה גופים סיליקה. ברי סולם 20 מיקרומטר (אורז), ו -200 מיקרומטר (חיטה ותירס). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig6large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> אף אוזן גרון &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig7.jpg" /> איור 7: באתרו הכלאה של אקטין CyclinB1; 1 דפוסי הביטוי של ובלוטות באד של סחלב Phalaenopsis בחתכי רקמה של ניצן 2 nd ניצנים בית השחי ו -3 rd השחי הוכנו תוך שימוש בשיטת Hybrid-Cut.. סך של 40 ng של אקטין CyclinB1; 1 חללית DIG שכותרתו שמש הכלאה. חללית התחושה שמשה כביקורת שלילית. החצים מצביעים על meristem הרבייה של ניצן השחי. סולם bars 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig7large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

פרוטוקול זה מתאר שיטת חיתוך רקמות פשוטה של חיתוך היברידי שימושית עבור רקמות צמחים סרבניות. קטעי רקמה באיכות טובה מאפשרים מחקרים אנטומיים ומחקרים ביולוגיים אחרים כולל הכלאה באתרה (ISH).

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

המטרה הכללית של שיטת חיתוך הרקמות ההיברידית היא לשפר את השלמות של חיתוכי רקמות צמחים עמידות, אלו בעלות סיבים קשיחים וגבישי סיליקה, כדי ליצור דגימות רקמה מתאימות למחקרים אנטומיים וביולוגיים. צמחים המכילים רמה גבוהה של גבישים וסיליקה עלולים לסבול מקריעות חמורות בפרפין ומבעיות במהלך החיתוך. שיטה זו משפרת באופן משמעותי את שלמות הרקמה.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהחיתוך בטמפרטורה נמוכה במיוחד בתוך הקריוסטט מקשיח את גוש הפרפין, ובכך מפחית משמעותית את בעיית גזירת הגבישים. ניתן להחיל טכניקה זו גם על היברידיזציה in situ, FISH והערכה פנימית, בין היתר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן השלבים להבטחת היצמדותו ההדוקה של גוש הפרפין למסבב עשויים להתגלות כבעייתיים.כדי להתחיל, בחרו צמחי סחלב פלנופסיס (phalaenopsis) בוגרים בשלב של חמישה עלים. הסירו בזהירות את העלים על ידי קריעתם לאורך העורק המרכזי. בעזרת סכין מנתחים חדה, הסירו בזהירות את הניצנים האקסילריים מבסיס העלה השלישי או הרביעי במערכת המונופודיאלית.העבירו מיד את הדגימות לבקבוק סקרינציה מזכוכית המכיל 15 milliliters של מקבע PFA קר כקרח. החילו ואקום על הדגימות שבתוך המקבע בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות. בועות קטנות ישוחררו מהדגימות.חזור על שלב זה עד שמרבית הדגימות שוקעות לאחר שחרור הוואקום. לבסוף, השאר את הוואקום לילה שלם ושחרר אותו באיטיות למחרת. לאחר מכן, טבול את הדגימות המקובעות ב-15 milliliters של PBS והנח על קרח למשך 15 דקות.בצעו דהידרציה לדגימות ב-15 מיליליטר של אתנול בסדרה של ריכוזים עולים: 30%, 50%, 70%, 85%, 95% ולבסוף 100%. חלחלו את הדגימות ב-15 מיליליטר של תערובת אתנול ותחליף קסילן ביחס נפחי של שתיים לאחת בטמפרטורת החדר. המשיכו בחלחול על ידי הנחה רצופית של הדגימות ב-15 מיליליטר מכל אחד מהחומרים הבאים.תערובת ביחס נפחי של 1:1 של אתנול ותחליף קסילן, תערובת ביחס נפחי של 1:2 של אתנול ותחליף קסילן, ולבסוף, תחליף קסילן טהור. לאחר מכן, יש להדגיר את הרקמות בתנור בטמפרטורה של 60 °C. יש להחדיר לדגימות 15 milliliters של תערובת תחליף קסילן ופראפין בטמפרטורה של 60 °C.לבסוף, בצעו חדירת פראפין ב-15 מילימטרים של פראפין טהור פעמיים, למשך 12 שעות בכל פעם בטמפרטורה של 60 °C. חזרו על שלב זה למחרת. כדי להתחיל את התהליך של ההטמעה (embedding), חממו תחילה את התבניות המתכתיות ל-62 °C, ולאחר מכן שפכו כ-13 מיליליטר של שעווה מותכת לבסיס התבנית.באמצעות פינצטה מחוממת, העבירו דגימת רקמה אל התבנית והכווינו אותה למצב הרצוי. העבירו את התבנית בזהירות אל לוח הקירור והשאירו אותה עד להתגבשות השעווה. לאחר מכן, השתמשו בסכין גילוח כדי לקצץ את בלוק דגימת הפרפין לעמודה בגודל מתאים עם משטח טרפז בחלק העליון.הוסיפו 800 µL של תרכובת חיתוך אופטית, או OCT, למרכז פלטת הקריוסטט. הניחו את בלוק הפרפין על הפלטה, וכוון במהירות את בלוק הרקמה למצב הרצוי. העבירו את בלוק הפרפין ואת הפלטה לתא הקריוסטט.הקפיאו במהירות את ה-OCT בטמפרטורה של 42- מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, קררו את מתאם הקריוסטט ואת טמפרטורת התא ל-20- מעלות צלזיוס ו-16- מעלות צלזיוס, בהתאמה. הצמידו את הבלוק ואת הבמה למתאם הקריוסטט.כעת, בצעו חיתוכי רקמה בעובי של 10 micrometers. באמצעות פינצטה, הסירו את חיתוכי הרקמה והניחו אותם כך שירחפו על 800 microliters של מים שעברו טיפול ב-DEPC על גבי שקופית מצופה ב-poly-l-lysine. העבירו את השקופיות ללוחית חימום המכוונת ל-42 degrees Celsius.יש להמתין עד שהחתכים יתשטחו ולהשתמש בנייר סינון כדי לספוג עודפי מים מהשוליים. יש להשאיר את הדגימה על לוח חימום בטמפרטורה של 42 °C למשך לילה כדי לאפשר לרקמה להיקשר לשקף. להסרת פאראפין מהדגימות, יש להניח תחילה את שקיפי הרקמה המקובעים לתוך מתקן צביעה.הוסיפו 150 milliliters של xylene לצנצנת צביעה, והטביעו את תושבת השקופיות למשך חמש דקות. לאחר מכן, בצעו רהידרציה לדגימות על ידי הנחתן בריכוזי ethanol יורדים, 150 milliliters של כל אחד, למשך שלוש דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. לבסוף, הטביעו את הדגימות במים מזוקקים כפולה למשך שלוש דקות.צבע את הדגימות על ידי הנחת השקופיות ב-150 milliliters של תמיסת hematoxylin למשך 1.5 דקות. שטוף למשך מספר שניות ב-150 milliliters של מים מזוקקים פעמיים המכילים טיפה אחת עד שתיים של N hydrochloric acid, ולאחר מכן שטוף את השקופיות קצרה במים מזוקקים פעמיים. ייבש את הדגימות שוב באמצעות סדרה של 150 milliliters בריכוזי ethanol עולים למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.טבלו את הדגימות ב-150 milliliters של xylene למשך חמש דקות. לבסוף, ביצעו הרכבה של הדגימות על ידי הוספה עדינה של 600 microliters של חומר הרכבה על בסיס xylene לכל שקופית, ולאחר מכן הנחת זכוכית כיסוי מעל הדגימה. באמצעות שיטה זו, הוכנו חתכי רקמה של סחליפי phalaenopsis, כולל הניצן הצמיגי שקשיי חיתוכו הוא טיפוסי, ומכיל רמות גבוהות של גבישים.מבנים מפורטים נשמרו, מה שאיפשר ויזואליזציה של גופי חלבון. החיתוך ההיברידי הניב גם חתכים ברורים לצורך ויזואליזציה של המריסטמה האפיתלית של הנבט בזרע שנבט. תמונות אלו מציגות את הכנתם של חתכים רוחביים של עלים מצמחי אורז וחיטה באמצעות טכניקות חיתוך מסורתיות בפרפין לעומת חיתוך היברידי.גידולים אלו מכילים בדרך כלל רמות גבוהות של סיליקה, דבר ההופך אותם למאתגרים לחיתוך. שלמות הרקמה בחתכים שבוצעו בשיטת החיתוך ההיברידי השתפרה באופן משמעותי, ומבנים מרכזיים שלעיתים קרובות מעוותים, או קשים לאיתור בדגימות פאראפין, נשמרו במלואם ברקמה שחותכה בשיטה ההיברידית. בנוסף, קריעות נצפו רק בדגימות שנותחו בפאראפין.בנוסף, השימור החזק של האנטומיה הופך רקמות שנחתכו בשיטת hybrid cut למועילות עבור מחקרים של תבניות ביטוי גנים מרחביות. כאן, בוצע היברידיזציה באתר (in situ hybridization) עבור Actin ו-Cyclin B1:1 על חתכים בשיטת hybrid cut של הנצצים הבטים השני והשלישי של סחלפי phalaenopsis. השימור האנטומי המשופר אפשר זיהוי של רמות ביטוי גבוהות יותר של הגנים המטרה בתאים המריסטמטיים המתפתחים של הנצצים הבטים השלישיים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על טמפרטורה של מינוס 16 מעלות צלזיוס כדי להקשיח את בלוק הפרפין. פעולה זו אמורה להוביל לסדרי רקמה באיכות גבוהה. הרעיון לשיטה זו עלה תחילה לאחר שנכשלנו פעמים רבות בביצוע חיתוך מוצלח של סחפון השחלה (orchid) באמצעות שיטות החיתוך המסורתיות בפרפין או בקידחוק (cryosection).בעקבות הליך זה, ניתן לבצע את כל הניסויים, כגון היברידיזציה in situ ו-FISH, במטרה לענות על שאלות נוספות, כולל חקירת הלוקליזציה המרחבית ותפקוד הגנים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכיבו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע חיתוך רקמות באיכות גבוהה עבור דגימות צמחים עמידות.

hybrid-cut-an-improved-sectioning-method-for-recalcitrant-plant

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

השיטה הנוכחית מאפשרת cryostat לשחזור של חתך, קשה לניהול, חתיכות קטנות רקמות, כגון ביופסיה, פרוסות המוח. אנו מנצלים אלומיניום פשוט מקפיא הבמה כדי להקל על הטיפול רקמות cryostat רגיל שגרתי לייצר חלקים 5-10 מיקרון סדרתי של פרוסות 400 מיקרון עבה המוח.

חתך דק של ההכנות פורסים עבור אימונוהיסטוכימיה

ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

פרוטוקול זה מטרות תאים ספציפיים ברקמות עבור הדמיה ברזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). תחילה עם תמונה של מספר גדול של טורי מקטעים של שרף-מוטבע בחומר ביולוגי במיקרוסקופ אור כדי לזהות את המטרה ולאחר מכן באופן היררכי ב- SEM.

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשפר את חלוקתה פרפין. שיטה זו משלבת חיתוך צף באמצעות תא תרמוסטטי פשוטות כדי למנוע את תהליך ההעברה הנדרש על-ידי השיטה המקובלת. כתוצאה מכך, את היעילות ואת מספר קטעים שלמים פרפין היו השתפרה מאוד.

חיתוך ושיטת צף בשביל לרקמות פרפין-מוטבע על חלוקתה

השתמשנו בפרוטוקול דגימה גיאולוגי (coring) כדי להשיג דגימות עצם קליפת המוח בגודל אחיד לניסויי SRμCT מההיבט הקדמי של הפמורה האנושית. שיטה זו היא הרסנית מינימלית, יעילה, גורמת לדגימות גליליות הממזערות את ממצאי ההדמיה מצורות מדגם לא סדירות ומשפרות את ההדמיה והניתוח המיקרו-ארכי-ארכיאולוגיים.

מדריך מקטעים, קורינג ועיבוד תמונה לרכש וניתוח מדגם עצם קליפת המוח בעל תפוקה גבוהה עבור מיקרו-CT של Synchrotron

מוצג כאן פרוטוקול עבור microdissection לכידת לייזר (LCM) של רקמות צמח. LCM היא טכניקה מיקרוסקופית לבידוד אזורים של רקמות באופן ללא זיהום. ההליך כולל קיבעון רקמות, הטמת פרפין, מקטע, LCM וחילוץ RNA. RNA משמש במורד הזרם ספציפי רקמה, ניתוח נפתר זמנית של transcriptomes.

לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

טכניקה זו מאפשרת הכנה מהירה ופשוטה של סעיף שרין בגודל זרע כולו לתצפית וניתוח של תאים, גרגרי ענבן, וגופים חלבון באזורים שונים של הזרע.

שיטת מקטע יבש פשוטה לקבלת מקטע שרב בגודל זרע שלם ויישומיו

ביאור דיגיטלי עם דיסקציה אוטומטית של רקמות מספק גישה חדשנית להעשרת הגידול במקרים של תכולת גידול נמוכה וניתן להתאמה הן לסוגי פרפין והן לסוגי רקמות קפואות. זרימת העבודה המתוארת משפרת את הדיוק, יכולת השכפול והתפוקה וניתן ליישם אותה הן על הגדרות המחקר והן על ההגדרות הקליניות.

פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה

פרוטוקול זה מציג שיטה להגדלת תכולת הגידול באחוזים של דגימות רקמה משובצות פרפין קבועות פורמלין.

שיפור תכולת הגידול באמצעות מקרו-דיסקציה של הגידול

פרוטוקול זה נועד לספק נהלים מפורטים לאיסוף, תיקון ותחזוקה של דגימות צמחים מיקוהטרוטרופיים, תוך יישום טכניקות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת והולכה, מיקרוסקופיית אור, קונפוקלית ופלואורסצנטית כדי לחקור התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים ובזרעים שנבטו בפטריות מיקוריזאליות.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

הערכת ההבדלים האנטומיים בין חתכי העלים C3 ו- C4 מסייעת להבין את יעילות הפוטוסינתזה. מאמר זה מתאר הכנה ובדיקה של חתכי עלים חופשיים ודקים למחצה, יחד עם האזהרות בהכנה למיני היבול Triticum aestivum ו-Zea mays.

הערכת תכונות מבניות ב- Triticum aestivum ו - Zea mays עבור התמיינות פוטוסינתטית C3 ו- C4 באמצעות חתכים חופשיים ודקים למחצה

למד את שיטת החתך ההיברידי לשיפור שלמות רקמות צמחים סרבנים בעלי סיבים קשים וגבישי סיליקה. טכניקה זו משמרת מבנים אנטומיים ומאפשרת היברידיזציה in situ ו-FISH באיכות גבוהה.

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

גלה סרטונים נוספים