-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

המטרה הכוללת של שיטת חיתוך רקמות בחיתוך היברידי היא לשפר את שלמותן של רקמות צמחים עקשניות חתוכות, אלה עם סיבים קשיחים וגבישי סיליקה, כדי ליצור דגימות רקמה מתאימות למחקרים אנטומיים וביולוגיים. צמחים המכילים רמה גבוהה של קריסטל וסיליקה עלולים לסבול מקרע פרפין חמור ובעיה במהלך החיתוך. שיטה זו משפרת משמעותית את שלמות הרקמות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהחיתוך בטמפרטורה נמוכה במיוחד בקריוסטט מקשה את גוש הפרפין, ומפחית משמעותית את בעיית גזירת הגבישים. היישום של טכניקה זו יכול להתרחב להכלאה באתר, FISH והערכה פנימית בין היתר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהשלבים להבטחת הדבקה הדוקה של גוש הפרפין לבמה יכולים להתגלות כמאתגרים.

כדי להתחיל, בחר צמחי סחלב phalaenopsis בוגרים בשלב חמשת העלים. הסר בזהירות את העלים על ידי קריעתם לאורך הצלע האמצעית. בעזרת אזמל חד, הסר בזהירות את ניצני בית השחי מבסיס העלה השלישי או הרביעי במערכת המונופודית.

הנח מיד את הדגימות לתוך בקבוקון נצנוץ זכוכית המכיל 15 מיליליטר של קיבוע PFA קר כקרח. מרחו ואקום על הדגימות בקיבוע בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות. בועות קטנות ישוחררו מהדגימות.

חזור על שלב זה עד שרוב הדגימות שוקעות לאחר שחרור הוואקום. לבסוף, החזיקו את הוואקום למשך הלילה ושחררו אותו לאט למחרת. לאחר מכן, טבלו את הדגימות הקבועות ב -15 מיליליטר PBS והניחו על קרח למשך 15 דקות.

לייבש את הדגימות ב-15 מיליליטר אתנול בסדרה של ריכוזים הולכים וגדלים. 30%50%70%85%95%ולבסוף 100%הסתננו לדגימות עם 15 מיליליטר של תערובת תחליפי אתנול וקסילן בנפח שניים לנפח בטמפרטורת החדר. המשך את ההסתננות על ידי הנחת הדגימות ברצף ב-15 מיליליטר מכל אחד מהבאים.

תערובת נפח לנפח אחד לנפח של תחליף אתנול וקסילן, תערובת של נפח עד שניים של אתנול ותחליף קסילן, ולבסוף, תחליף קסילן טהור. לאחר מכן דגרו את הרקמות בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס. הסתננו לדגימות עם 15 מיליליטר של תחליף קסילן ותערובת פרפין בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.

לבסוף, הסתנן פרפין ב-15 מילימטרים של פרפין טהור פעמיים למשך 12 שעות כל אחת ב-60 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה למחרת. כדי להתחיל להטמיע יש לחמם תחילה את תבניות המתכת ל 62 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשפוך כ -13 מיליליטר שעווה מותכת לבסיס התבנית.

בעזרת מלקחיים מחוממים, העבירו דגימת רקמה לתבנית וכוונו אותה למצב הרצוי. העבירו את התבנית בזהירות על צלחת הקירור והשאירו אותה לעמוד עד שהשעווה מתמצקת. לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי לקצץ את בלוק דגימת הפרפין לעמודה בגודל מתאים עם משטח טרפז בחלקו העליון.

הוסף 800 מיקרוליטר של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטית, או OCT, למרכז שלב הקריוסטט. הניחו את גוש הפרפין על הבמה, וכוונו במהירות את גוש הרקמה למיקום הרצוי. העבירו את גוש הפרפין והשלב לתא קריסטט.

הקפאה מהירה של ה-OCT במינוס 42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, יש לקרר את מתאם הקריסטאט ואת טמפרטורת החדר ל-20 מעלות צלזיוס שלילית, ולשלילית 16 מעלות צלזיוס בהתאמה. חבר את הבלוק וה-tagה למתאם ה-crystat.

כעת, חתכו את הרקמות לעובי של 10 מיקרומטר. בעזרת מלקחיים, הרם את חלקי הרקמה והניח אותם כך שהם יצופו על 800 מיקרוליטר של מים שטופלו ב-DEPC על מגלשה מצופה פולי-ליזין. מעבירים את השקופיות לפלטה חמה המכוונת ל-42 מעלות צלזיוס.

הניחו לחלקים להשתטח והשתמשו בנייר סינון כדי לספוג מים מהקצוות. השאירו את הדגימה על הפלטה החמה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר לרקמה לעלות למגלשה. כדי לנטרל את הדגימות, הנח תחילה את שקופיות הרקמה המותקנות לתוך מתלה מכתים.

מוסיפים 150 מיליליטר קסילן לצנצנת מכתים, וטובלים את מתלה השקופיות למשך חמש דקות. לאחר מכן, החזר את הדגימות על ידי הנחתן בריכוזי אתנול יורדים, 150 מיליליטר כל אחת למשך שלוש דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. לבסוף, טבלו את הדגימות במים מזוקקים כפולים למשך שלוש דקות.

צבעו את הדגימות על ידי הנחת השקופיות ב-150 מיליליטר של תמיסת המטוקסילין למשך 1.5 דקות. יש לשטוף מספר שניות ב-150 מיליליטר מים מזוקקים כפולים המכילים טיפה אחת עד שתיים של חומצה הידרוכלורית N, ולאחר מכן לשטוף את המגלשות לזמן קצר במים מזוקקים כפולים. ייבשו את הדגימות פעם נוספת באמצעות סדרה של 150 מיליליטר של ריכוזי אתנול הולכים וגדלים למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

טבלו את הדגימות ב -150 מיליליטר קסילן למשך חמש דקות. לבסוף, הרכיב את הדגימות על ידי הוספת 600 מיקרוליטר של מדיום הרכבה מבוסס קסילן על כל שקופית, ולאחר מכן הנחת החלקת כיסוי מעל הדגימה. בשיטה זו נוצרו קטעי רקמה של סחלבים phalaenopsis, כולל ניצן בית השחי הקשה בדרך כלל לחיתוך, המכיל רמות גבוהות של גבישים.

מבנים מפורטים נשמרו, המאפשרים הדמיה של גופי חלבון. החיתוך ההיברידי ייצר גם חתך ברור להדמיה של המריסטם האפיקלי של הזרע הנבט. תמונות אלה מציגות הכנת קטעי עלים רוחביים של צמחי אורז וחיטה באמצעות טכניקות חיתוך פרפין מסורתיות לעומת חיתוך היברידי.

גידולים אלה מכילים בדרך כלל רמות גבוהות של סיליקה, מה שהופך אותם למאתגרים לחיתוך. שלמות הרקמה בחתכים ההיברידיים שופרה משמעותית, ומבני מפתח מעוותים לעתים קרובות, או שקשה למצוא בדגימות פרפין, נשמרו בשלמותם ברקמת החיתוך ההיברידית. בנוסף, קרע נצפה רק בדגימות חתך הפרפין.

בנוסף, השמירה החזקה של האנטומיה הופכת רקמות חתוכות היברידיות לשימושיות למחקרים של דפוסי ביטוי גנים מרחביים. כאן, הכלאה באתרה עם אקטין וציקלין B1:1 בוצעה על קטעים חתוכים היברידיים של ניצני בית השחי השני והשלישי של סחלבי phalaenopsis. השימור האנטומי המשופר איפשר זיהוי רמות ביטוי גבוהות יותר של גני המטרה בתאים המריסטמטיים המתפתחים של ניצני בית השחי השלישי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על טמפרטורה של מינוס 16 מעלות צלזיוס כדי להקשיח את גוש הפרפין. זה אמור לגרום לחתך רקמות באיכות טובה. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה לאחר שנכשלנו פעמים רבות בביצוע חיתוך מוצלח בסחלב בשיטת הפרפין או ההקפאה המסורתית.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע את כל הניסויים כמו הכלאה באתרה ו-FISH על מנת לענות על שאלות נוספות, כולל חקירת לוקליזציה מרחבית ותפקוד של גנים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע חיתוך רקמות באיכות גבוהה בדגימת צמחים עקשנית.