מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה של צומת סין- פרוזדורי העכבר

המטרה הכללית של פרוטוקול ניסיוני זה היא לבצע מיפוי אופטי של קשרין הסינו-אטריאלי (sinoatrial node) בעכבר, מלב שלם המשוקשק בשיטת Langendorff או מהכנה מבודדת של העליות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האלקטרו-ופיזיופתולוגיה של הקשר הסינו-אטריאלי, בנוגע למנגנונים של הפרעות בקצב הלב (pacemaker abnormalities), תסמונת הסינוס החולה (sick sinus syndrome) והפרעות קצב שונות בעליות הקשורות למחלות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת חקירה של פרמטרים מרובים ברקמות שלמות ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה מאוד.

לאחר וידוא של רמת הרדמה מתאימה באמצעות צביטה בבוהן, השתמשו במספרי מאיו (Mayo) מעוקלים בגודל 5.5 אינץ' ובפינצטת קלי (Kelly) להמוסטזה בגודל 5.5 אינץ' כדי לבצע חתך של סנטימטר אחד בחלק הקדמי של בית החזה. בעזרת פינצטת איריס (Iris) מעוקלת בגודל ארבעה אינץ', תפסו במהירות את רקמת הריאה והשתמשו במספרי איריס בגודל ארבעה שליש אינץ' כדי להוציא יחד את הריאה, התימוס והלב, יחד עם פריקרדיום (קרום הלב). שטפו את הרקמות בתמיסת טיירוד (Tyrode) שעברה התאמה, מחומצנת ובטמפרטורה של 37 °C.

לאחר מכן, השתמשו במספריס Tubingen Vannas מעוקלים בגודל שלושה אינץ' ובפינצטות מספר 5 בגודל ארבעה שליש אינץ' כדי להסיר את הריאות, התימוס ורקמת השומן מהלב. לאחר מכן, השתמשו בקנולה מותאמת אישית בכילוי 21 ובשתי פינצטות B מספר 5 מעוקלות בגודל 4.3 אינץ' כדי לבצע קניולציה של האורטה ובמקביל לבצע פרפוזיה וסופר-פרפוזיה של הלב עם תמיסות Tyrode בטמפרטורה של 37 degree Celsius, כאשר התמיסה מועברת דרך מסנן ניילון של 11 micron המותקן בקו, לפני הפרפוזיה, על מנת למנוע חסימה של מחזור הדם הכלילי. לאחר מכן, חברו טרנסדוסר לחץ למחבר Luer lock בקו הפרפוזיה באמצעות ברז תלת-דרכי (three-way stopcock) כדי לנטר את הלחץ באורטה, תוך התאמת מהירות הפרפוזיה כדי לשמור על לחץ אורטלי שבין 60 ל-80 millimeters of mercury לפי הצורך.

לביצוע מיפוי אופטי של הצומת הסינו-עלידית מלב בפרפוזיה בשיטת לנגנדורף (Langendorff), מקם את האיבר במנח אופקי כאשר הצד האחורי פונה כלפי מעלה בתוך תא זכוכית לרחצה של רקמות, והשתמש בסיכות בעלות קוטר של 0.1 מ"מ כדי לקבע את חוד החדרים לתחתית התא המצופה בסיליקון, זאת כדי למנוע תזוזות הנגרמות מהזרם במהלך הניסוי. הכנס צינור סיליקון קטן אל תוך החדר השמאלי דרך הווריד הריאתי, העליות השמאליות והמסתם המיטרלי, והשתמש בתפר משי במידה 40 כדי לקבע את הצינור לרקמה החיברית הסובבת. לאחר מכן, השתמש בתפר משי נוסף במידה 40 כדי להדק את הוורידים החלולים העליון והתחתון, וקבע בסיכה את קצה התהליל של העליה הימנית לתחתית התא.

מתחו והדביקו את הקצה השני של התפר לתחתית התא והניחו אלקטרודת קוצבי לב בהתאמה אישית על קצה הנספח של העלייה הימנית. לאחר מכן, הניחו שתי אלקטרודות חד-קוטביות מסוג מחט במידה של 12 מילימטרים עבור אקג (electrocardiogram) סמוך לבסיס החדרים הימני והשמאלי, והניחו את אלקטרודת ההארקה של האקג סמוך לApex של החדר. כדי לצבוע את הרקמה, הזריקו את הצבע המדולל אל תוך פתח פרפוזיה מקוון של קו הפרפוזיה הכלילי למשך תקופה של חמש עד שבע דקות.

לאחר 20 דקות של התייצבות, הוסף 0.5 milliliters של blebbistatin בטמפרטורה של 37 degree Celsius אל הפרפוזט, ולאחר מכן הזרק 0.1 milliliters של blebbistatin המדולל ב-1 milliliter של תמיסת Tyrode בטמפרטורה של 37 degree Celsius אל קו הפרפוזיה הקורונרית במשך חמש עד שבע דקות נוספות, באמצעות יציאת הזרקה מסוג Luer lock המותקנת בקו. יש להשתמש ב-Blebbistatin בזהירות. כדי למנוע שקיעה של המעכב, המס תחילה את ה-blebbistatin במדיום שחומם ל-37 degrees ברור וערבב את התערובת בעוצמה.

כדי לבצע מיפוי אופטי של הדגימה, קבעו תחילה זכוכית כיסוי קטנה על פני השטח של התמיסה מעל הרקמה, כדי להפחית ארטיפקטים של תנועה הנובעים מהרעידות של התמיסה. לאחר מכן, בעזרת מוליך אור מפוצל וגמיש עם אור עירור המסופק על ידי נורת הלוגן בעלת זרם קבוע ורעש נמוך, כוונו את קרן האור המסוננת אל הרקמה ודגמו את אות הפלואורסצנציה שנוצר. לאחר קניולציה של הלב כפי שהודגמה כעת, נתקו את החדרים מהצד הקדמי ופתחו את העלייה הימנית דרך המסתם התלת-שפיצתי לאורך ציר הווריד הראשי העליון של המסתם התלת-שפיצתי, ולאחר מכן בצעו חיתוך דרך הזרוע המדיאלית של ה-crista terminalis.

כדי לפתוח את הדופן החופשית של העליה הקדמית, בצעו חתך מקו האמצע של חיתוך הזרוע המדיאלית ועד לקצה הפינה התחתונה הימנית של התהייכות העלייה הימנית, והצמידו בעזרת סיכות את הדופן החופשית השטוחה של העליה לתחתיתו של תא מצופה סיליקון. כדי לפתוח את התהייכות העליה השמאלית, חתכו דרך המסתם המיטרלי לאורך הפינה העליונה של המסתם המיטרלי של התהייכות העליה השמאלית. לאחר מכן, הצמידו בעזרת סיכות את העליה השמאלית הפתוחה כפי שנעשה קודם לכן עבור העליה הימנית.

לאחר מכן, הסר חלקית את רקמת הפרוקים. שמור על שוליים של רקמת פרוקים לצורך קיבוע הדגימה כדי למנוע נזק לעליות הלב, וקבע את הרקמה לתחתית תא מצופה ב-Sylgard. כעת, הרם את הדגימה הסופית בכ-0.5 מילימטרים מתחתית התא המצופה בסיליקון כדי לאפשר סופרפוזיה (superfusion) הן מהמשטח האפיקרדיאלי והן מהמשטח האנדוקרדיאלי, ובצע סופרפוזיה לדגימה עם תמיסת Tyrode בטמפרטורה של 37 degree Celsius.

לאחר מכן, מקמו אלקטרודת כסף-כלוריד לקוצבי לב בהתאמה אישית על קצה הנספח העליוני הימני המנוסח. מקמו אלקטרודה חד-קוטבית של אקג עם מחט של 12 מילימטר ליד כל אחד מהנספחים העליוניים, הימני והשמאלי, ומקמו את אלקטרודת ההארקה של האקג ליד החיבור שבין העליון למסוע (atrial ventricular junction). לצביעת רקמת הלב, השתמשו בפיפטה של 1 מילימטר כדי לשחרר לאט צבע רגיש למתח, המדולל בתמיסת Tyrode בטמפרטורה של 37 degree Celsius, ישירות על הרקמה.

לאחר מכן, קבעו את הדגימה על ידי יישום ישיר של blebbistatin מדולל על הרקמה, ולאחריו מתן של 0.5 milliliters נוספים של blebbistatin דרך הפרפוזאט, ובצעו מיפוי אופטי של הדגימה כפי שהודגם זה עתה. שלבי צביעת הרקמה ועקיבת ה-blebbistatin הם קריטיים ומחייבים יישום מדויק והליך צביעה קפדני, כדי שהפרמטרים הפיזיולוגיים של העליה, כולל קצב הלב, מיקום הקוצבי המוביל וההולכה העליותית, לא ייפגעו. כאן מוצגת מפת קונטור טיפוסית של הפעלה בעליה ימין ששוחזרה עבור קצב סינוס ספונטני בלב עכבר בפרפוזיה של Langendorff, יחד עם שתי מפות קונטור תואמות של העליה ימין שנרכשו בקצבי דגימה של 1 ו-0.5 milliseconds.

נקודת ההפעלה המוקדמת ממוקמת באזור הבין-חלול (intercaval region) סמוך לוריד החלול העליון, שם מוגדרת אנטומית הצומת הסינו-עלילית. בניסוי זה, לאחר קצב של התהייך העלייה הימנית (right atrial appendage) למשך דקה אחת לפחות בתדר של 10 עד 12 Hertz, הופסקה הגרייה החשמלית וזמן ההתאוששות של הצומת הסינו-עלילית חושב כפרק הזמן שבין פוטנציאל הפעולה הנתפס האחרון לבין פוטנציאל הפעולה הספונטני הראשון. הפעלה של תכשיר העליות המבודד במהלך קצב סינוס ספונטני מאפשרת לזהות את האזור המדויק של מיקום קווצ הלב המוביל.

אם נהלי הניתוח והטעינה בצבע בוצעו כראוי, לא אמורים להבחין בשינויים משמעותיים במאפיינים הפיזיולוגיים של העליה. למרות שצביעה עורקית עשויה לדרוש כמות גדולה יותר של צבע, נראה כי האות הפלואורסצנטי ברקמת אזור הצומת הסינו-עליותי יציב יותר בשיטת טעינה זו, עם זמן דעיכה של עוצמת האות לאחר צביעה כלילית ארוך כמעט פי שניים מזה שקיים לאחר צביעה שטחית. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 30 עד 40 דקות, אם היא מבוצעת כהלכה.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, יש להקפיד לאתר את האנטומיה של העליות לפני ביצוע חתך, כדי למנוע פגיעה ברקמת העליות ובצומת הסינוס. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע מדדים אחרים, כגון הקלטות עם אלקטרודות זכוכית מיטרליות קונבנציונליות, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי מאפייני פוטנציאל ממבנה התא (transmembrane potential) קומוטטיבי. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הפיזיולוגיה של האינטלקט לבחון הפרעות קצב בעליות, כולל תפקוד לקוי של צומת הסינו-אטריאלי בלב.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה של הרכבה של קשר סינוס מעכבר.