תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את השלד הציטולוגי של האקטין בתאי יונקים נצמדים ברמה האולטרה-מבנית, באמצעות שיטת מיקרוסקופיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה הנקראת iPALM. הדמיית iPALM מספקת רזולוציה מרחבית ננומטרית תת-מגמתית בכל שלושת הממדים. זה מאפשר לדמיין אולטרה-מבנים באמצעות בדיקות תפריחה, מה שמאפשר ספציפיות תיוג גבוהה.

ההליך המוצג בסרטון זה צריך להיות מותאם במהירות ומלמד להמחשת תכונות אולטרה-מבניות אחרות בתאים על ידי לוקליזציה של מולקולה בודדת המבוססת על מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר. התחל הליך זה על ידי הכנת התאים על כוסות כיסוי בצלחת שש בארות. כדי להרכיב את דגימת ההדמיה, השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר בעדינות את זכוכית כיסוי הדגימה מבאר המאגר.

לאחר מכן הקש במהירות ובעדינות על עודפי המאגר על ידי נגיעה בקצה זכוכית הכיסוי עם נייר מקופל וסופג. הנח את צד תא הזכוכית של המכסה כלפי מעלה על פיסת נייר עדשה נקייה. שטפו את הדגימה על ידי הנחת 30 עד 50 מיקרוליטר של מאגר ההדמיה על הדגימה.

הסר את המאגר העודף על ידי הטיה והקשה עם נייר סופג מקופל. לאחר חזרה על שלב השטיפה מספר פעמים, הנח 30 עד 50 מיקרוליטר של מאגר הדמיה על הדגימה. יש לייבש את קצה זכוכית הכיסוי ולהניח מספר נקודות קטנות מאוד של אפוקסי לריפוי מהיר על האזור המיובש.

הורד לאט לאט כיסוי מספר 1.5 נוספת שנוקה מראש על מרכז התא המכיל זכוכית כיסוי 22 מילימטר. תן למאגר ההדמיה להרטיב את שתי זכוכיות הכיסוי בפעולה נימית. הנקודות הקטנות של אפוקסי ריפוי מהיר צריכות להיצמד לשתי כוסות הכיסוי.

לחץ בעדינות על הדגימה המורכבת באמצעות נייר סופג מקופל כדי לפזר את הלחץ באופן שווה. השתמש בלחץ מספיק כדי להפוך את תא הדגימה לדק ואחיד, אך לא עד כדי ריסוק התאים. מדוד את העובי המתאים על ידי התבוננות בתבנית הטבעות של ניוטון.

הקפד לבצע שלב זה בעדינות כדי למזער בועות אוויר. במידת הצורך, התאמן עם משקפי כיסוי ריקים מספר פעמים לפני כן. לאחר מכן, אטמו את הדגימה בפרפין וזלין לנולין מומס.

לאחר מכן שטפו את הדגימה האטומה במים נטולי יונים. יבש את הדגימה באוויר דחוס כדי להכין אותה להרכבה על המיקרוסקופ. הזז את עדשת המטרה העליונה הקפיצית כלפי מעלה כדי לאפשר את הסרת מחזיק הדגימה.

הנח את הדגימה האטומה על מחזיק הדגימה ואבטח עם מספר מגנטים קטנים של אדמה נדירה. מרחו שמן טבילה משני צידי דגימת ההדמיה. הנח את מחזיק הדגימה בחזרה לנתיב האופטי והורד בעדינות את עדשת המטרה העליונה.

הפעל את לייזרי העירור. הפעל גם את מצלמות EMCCD במצב העברת פריימים. לאחר מכן, סובב את מסנני הפליטה המתאימים.

הפעל תריס מכני כדי לחסום את נתיב האלומה העליונה ולפתוח את נתיב האלומה התחתונה. הבא את עדשת המטרה התחתונה למיקוד על ידי תרגום במרווחים קטנים באמצעות מפעיל הפיזו. ברגע שה-fiducial נמצא בפוקוס, פתח את נתיב האלומה העליונה תוך חסימת נתיב האלומה התחתונה והביא את עדשת המטרה העליונה למיקוד באופן דומה.

עקוב אחר רוחב הפידוציאל בתצוגת המחשב למיקוד אופטימלי. לריכוז נכון, פתח את נתיבי הקורה העליונים והתחתונים. כוונן ידנית את עדשת המטרה העליונה בזמן שהמטרה התחתונה מוחזקת קבועה באמצעות זוג ברגים לסט מיקרו-עדין עד שהתמונות הפיקטיביות חופפות קרוב ככל האפשר, באופן אידיאלי בתוך פיקסל אחד.

לאחר מכן, בצע התאמות עדינות כך שהתמונות הנאמנות חופפות בטווח של עשירית מפיקסל EMCCD. כוונן את שתי המראות העליונות המותקנות על פייזו באמצעות תוכנת הבקרה תוך שמירה על שתי עדשות האובייקט ומראות ההשתקפות התחתונות קבועות. השווה את מרכזי הנאמנות של תצוגת המטרה העליונה והתחתונה באמצעות תצוגת המחשב כדי להנחות את התהליך.

כאשר הלייזרים פועלים, המצלמות זורמות ברציפות, ומסלולי האלומה העליונים והתחתונים פתוחים, מתנודדים את מחזיק הדגימה Z piezo באמצעות צורת גל מתח סינוסואידית שנוצרת על ידי תוכנת הבקרה עבור תנודה רציפה של ציר Z בסדר גודל של 400 ננומטר. תרגם ידנית את מכלול מפצל הקרן הממונע למעלה או למטה עד שעוצמת הנאמנות מתנודדת. בשל אפקט הפרעות הפוטון הבודד הרצוי, זה מסמל התאמה הדוקה של אורכי הנתיב האופטי.

ניתן להשיג יחס שיא לעמק של יותר מ-10 במקרים אופטימליים. כדי להבטיח שגם המשרעת וגם הפאזה בכל משטח יהיו אחידים ככל האפשר על פני השדה, כוונן את המראה התחתונה של מכלול מפצל הקורה בצעדים קטנים כדי לכוונן את הפער ואת זוויות ההטיה. בצע יישור עדין של מפצל אלומה על ידי תרגום הדגימה בשמונה צעדי Z ננומטריים על פני 800 ננומטר.

עקוב אחר עוצמת הנאמנות בין מצלמות אחת עד שלוש. התאם את הגובה, המיקום וההטיה של המראה התחתונה בתוך מכלול מפצל האלומה בצעדים קטנים כך ששלב התנודה של מצלמה אחת ביחס למצלמה שתיים יהיה מקסימלי, באופן אידיאלי ב-120 מעלות. לאחר השלמת היישור הראשוני, תרגם את הדגימה לסריקה לאיתור שדה ראייה מתאים המכיל גם תאים לתמונה וגם מספר נאמנים בקרבת מקום.

מקם מארז סביב המערכת כדי לחסום אור תועה והפרעות סביבתיות. לאחר מציאת אזור ההדמיה, תרגם שוב את הדגימה ורשום את עקומת הכיול לשימוש בחילוצי קואורדינטות Z הבאים. באמצעות הפקודה רכשו סריקות כיול לעומת מיקום piezo לדוגמה בממשק הראשי.

לאחר שנמצא אזור רצוי ומתקבלת עקומת הכיול, הזן את שמות הקבצים המתאימים לתוכנה. פתח את נתיבי האלומה העליונים והתחתונים, ולאחר מכן הגדל את עוצמת העירור של לייזר 642 ננומטר למקסימום. עבור Alexa Fluor 647, ייתכן שיהיה צורך בתקופה ראשונית של כיבוי Fluor-4.

חשוף עם עירור קבוע של 642 ננומטר למשך חמש דקות, או יותר במידת הצורך, עד שנצפה מולקולה בודדת מהבהבת. התוכנה מאפשרת הגדלה אוטומטית של 405 ננומטר פוטו-אקטיבציה במהלך הרכישה. בדרך כלל נדרשים מספר רב של מסגרות רכישה כדי שתכונות חוטיות יהיו גלויות בבירור.

כשתהיה מוכן, התחל ברכישה של ערכות תמונות גולמיות באמצעות הפקודה התחל רכישת iPALM בממשק הראשי. במהלך הרכישה, כוונן את רמת הפעלת הצילום על ידי התאמת עוצמת הלייזר של 405 ננומטר כדי לשמור על צפיפות ההבהוב הנכונה לפי הצורך. כאשר החלקת כיסוי הדגימה מורכבת כראוי, ניתן לצפות בטבעות של ניוטון בעיניים בלתי באור הסביבה או בתאורת פלורסנט סטנדרטית.

מיצוי המיקומים הציריים של פולטי פלואורסצנציה דורש הפרעות רב-פאזיות בו זמנית בהדמיית iPALM, אשר מכוילת על ידי שינויי העוצמה של פידוציאל נתון בשלושה EMCCD. לאחר מכן העוצמות מנורמלות ומתאימות לקביעת הבדלי השלב. הנה תמונת השחזור iPALM עם כל קואורדינטת לוקליזציה שעובדה על ידי גאוס דו-ממדי עם הרוחב המתאים לאי ודאות לוקליזציה.

קואורדינטת Z צבועה בהתאם לסרגל הצבעים. ניתן לראות אזורים בעלי תכונות חוטיות צפופות ודלילות. מוצגות כאן תמונות iPALM שחזור של שלד תא אקטין של תאי HUVEC המסומנים על ידי Alexa Fluor 647 phalloidin.

צבע התמונה מציין את קואורדינטות Z בהתאם לסרגל הצבע. היסטוגרמה של חתך רוחבי נוצרת מקואורדינטות הלוקליזציה XY לאורך הציר הארוך של האזור הסגור. התאמה גאוס מציגה רוחב מלא בחצי מקסימום של 43.88 ננומטר הקשור לחתך הרוחבי.

היסטוגרמה זו היא של מיקום Z של קואורדינטות לוקליזציה באזור התיבה. התאמה גאוס מציגה רוחב מלא בחצי מקסימום של 17.50 ננומטר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 90 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין כיצד לדמיין את השלד הציטולוגי של האקטין באולטרה-מבני באמצעות iPALM באמצעות הכנה והרכבה פשוטות, יישור אופטי, רכישת נתונים גולמיים והניתוח שלאחר מכן לשחזור תמונות ברזולוציה סופר. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור את הארכיטקטורה הננומטרית של שלד האקטין, כמו גם מבני הידבקות תאים כגון הידבקויות מוקדיות.