אֹרכִּי In vivo הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

כתב יד זה מתאר הליך לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במהלך הצטברות פלאק עמילואיד in vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ אורך. הכנה הגולגולת דליל מאפשר הדמיה של צבעי ניאון כדי להעריך את התקדמות הנזק כלי דם במוח במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר העיצוב מחדש של כלי הדם במוח העכבר במהלך התקדמות מחלה כרונית לאורך תקופות זמן ממושכות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון תפקידו של שיפוץ כלי דם במוח במחלות של מערכת העצבים המרכזית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא זעיר פולשנית וללא דלקת עצבית, מה שהופך אותה לאידיאלית לחקר פתולוגיות שבהן הדלקת מעורבת בפועל.

טכניקה זו מאפשרת הדמיה של פיאל וכלי קליפת המוח החודרים, ומשלימה טכניקות היסטולוגיות ישירות בהדמיה של מיקרו-נימים בפרנכימה של מחסום הדם-מוח. מי שתדגים את ההליך תהיה מרגריטה ארנגו-ליבנו. היא פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל בהליך זה, יש לנקות את הספסל הכירורגי ואת צלחת המיקרוסקופ עם אתנול 70% ולכסות אותם במטלית נקייה וסופגת. לאחר מכן, בדוק את רמת ההרדמה המתאימה עם צביטות כפות או זנב. לאחר מכן מרחו משחת עיניים סטרילית על העיניים וגלחו את הפרווה מהאף לאוזניים בעזרת סכין גילוח.

לאחר מכן, יש לעקר את העור בתמיסת חיטוי יוד פובידון. הניחו את העכבר מתחת למיקרוסקופ המשקפת ובצעו חתך בעור מהאוזניים לאף. משוך את העור הצידה כדי לחשוף את הגולגולת.

לאחר מכן קרעו את הפריאוסטאום ושטפו שוב ושוב את הגולגולת עם ACSF סטרילי כדי לעצור דימום אפשרי. בהליך זה, הסר את משחת העיניים בעזרת קצה כותנה. לאחר מכן יש למרוח טיפה של חומר הרדמה עיניים מקומי.

לחץ בעדינות על העור סביב ארובת העין כדי להשיג בלט. לאחר מכן, יש להזריק FITC מצומד עם דקסטרן בסינוס הרטרו-אורביטלי. לאחר מכן, יש למרוח משחת עיניים סטרילית על העיניים.

ודא שהעור נסוג והגולגולת נקייה ויבשה סביב אזור ההדמיה שנבחר. לאחר מכן מרחו כמות קטנה של דבק ציאנואקרילי סביב החלון של מכשיר הרכבה על הראש והדביקו את התקן תושבת הראש סביב אזור היעד. לאחר מכן, הפעל לחץ עדין על תושבת הראש למשך מספר שניות.

משוך את קצות העור לקצה החלון של התקן הרכבה על הראש, וודא שהאזור יבש. אבטח את העור ואת קצה החלון בכמות קטנה של דבק ציאנואקרילי והמתן עד לייבוש. לאחר מכן, אבטח את החיה בשלב באמצעות התקן הרכבה על הראש.

שטפו את העצם באזור היעד עם ACSF סטרילי וודאו שהבאר בין העור למכשיר הרכבה על הראש אטומה בצורה מושלמת. לאחר מכן, עטפו את העכבר בשמיכת הישרדות כדי לשמור על נורמותרמיה. כעת בצע דילול של הגולגולת בתמיסת ACSF כדי להחליש רעידות שנוצרו על ידי קידוח.

וזכור להחליף את ה-ACSF באופן קבוע כדי לנקות את שאריות העצם ולמנוע התחממות יתר של הרקמות. בעזרת מקדחה דנטלית, התחילו לדלל את פני הגולגולת באזור בקוטר של מילימטר אחד בתנועה אנכית רגילה במקביל לגולגולת, והסירו את רוב העצם הספוגית. שימו לב שהעצם ליד התפרים היא בעלת כלי דם גבוהים.

אם מתרחש דימום, יש למרוח קצף ג'ל ACSF ספוג מראש כדי לעצור אותו. אז אנחנו שומרים על העצם כדי להגביל את הדלקת, אבל לחץ או חימום מוגזמים במהלך הליך הדילול יכולים גם לגרום לדלקת. השתמש בלהב מיקרו-כירורגי חד פעמי כדי להמשיך בדילול הגולגולת כדי לגרום לאזור סופי בקוטר של כ-0.5 מילימטר בעובי של 20 עד 35 מיקרומטר, תוך הקפדה לא להפעיל לחץ מוגזם.

עקב צמיחה מחודשת של העצם והצטלקות, יש צורך לדלל עוד יותר את החלון בכל מפגש הדמיה. בשלב זה, העבירו את העכבר עם שלב הרכבה של הראש מתחת למיקרוסקופ הלייזר הדו-פוטוני. באמצעות יעד טבילה במים פי 20 עם צמצם מספרי של 1.0, אתר את חלון הגולגולת הדק במרכז השדה האופטי באמצעות המנורה האפיפלואורסצנטית.

ודא שהמטרה תמיד שקועה ב-ACSF. לאחר מכן, התחל סריקת לייזר עם לייזר דופק נעול מצב. הגדר את אורך גל העירור ל-750 ננומטר כדי לזהות את הקרינה הנפלטת של מתוקסי-X04 בערוץ הכחול ו-FITC-דקסטרן בערוץ הירוק.

רכוש ערימת הגדלה נמוכה בזום מספרי של 0.7X על מנת ליצור מפה תלת מימדית ללוקליזציה מדויקת של החזר ההשקעה בנקודות זמן מאוחרות יותר. לאחר מכן רכוש פסיפס של ארבע תמונות בהגדלה דיגיטלית גבוהה עם זום מספרי של שני X. באמצעות תוכנת ההדמיה, הזז את החלון בצעדים של 200 מיקרומטר כדי ללכוד את כל האזורים.

עומק הערימות הוא בדרך כלל 250 מיקרומטר החל ממשטח הפיאל בכל תמונה של הפסיפס. לפני הוצאת העכבר מהמיקרוסקופ, צלם תמונה או צור מפה דו-ממדית מצוירת ביד של כלי הדם הפיאליים ללוקליזציה עתידית של שדה ההדמיה. מוצגת כאן השוואה של שתי תמונות משוחזרות של המיקרו-כלי דם ותצהירי העמילואיד על עכבר FAD 5X בגיל ארבעה וחמישה חודשים.

פלאק עמילואיד מסומן בכוכביות לבנות, ופלאקים חדשים המופיעים בגיל חמישה חודשים מסומנים בכוכביות צהובות. מקרה נדיר של הפחתת פלאק מסומן בכוכבית כתומה. כלי מיקרו חדשים שנוצרו מסומנים בחצים צהובים, ואילו חסימת כלי דם מסומנת בחץ אדום.

איור זה מראה כי כלי הדם העמילואידים משקעים על כלי דם בקליבר גדול. במקביל, ניתן להבחין בפלאק עמילואיד גם על כלי שיט בקליבר קטן. חיצים אדומים מצביעים על כלים חסומים, ואילו כוכביות לבנות מצביעות על גידול פלאק עמילואיד.

אז לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה וחצי, כולל שלבי הניתוח וההדמיה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לתכנן את מספר מפגשי ההדמיה על מנת להגביל דילול יתר בפגישה הראשונה. בסך הכל, הליכים אלה מאפשרים מעקב אחר שינויים בכלי הדם במוח במהלך התקדמות המחלה.