Name: אֹרכִּי In vivo הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: למדו מעקב אחר שינויים בכלי הדם במוח בעכברים במהלך מחלות ניווניות באמצעות מיקרוסקופיית שני-פוטון לאורך זמן. שיטה זו מאפשרת הדמיה פחות פולשנית של מערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות הקומדי Ligue contre l&#39;épilepsie (כדי MA-L), Institut National de la Santé et de la משוכלל ונדיר Medicale גרנט Avenir R12087FS (כדי FJ), להעניק מהאוניברסיטה של ​​מונפלייה (כדי FJ) ומענק מהפדרציה לשפוך Cerveau le sur la משוכלל ונדיר (כדי NM). אנו מכירים את העזרה הטכנית של Chrystel Lafont בבית IPAM במתקן פלטפורמת הליבה הדמיה vivo של מונפלייה. אנו מודים גם מרי Vernov (Weill Cornell Medical College) להגהה את כתב היד.

עכברים מותר גישה כרצונך למזון, מים, ומתוחזק על מחזור אור כהה 12-hr. כל הנהלים הקשורים בחיות מעבדה תאמו לאומי וחוקים אירופיים אושרו על ידי משרד צרפתית לחינוך ולמחקר מדעי (CEEA-LR-00,651-01). בסך הכל מהונדס 6 5xFAD ו wildtype להמלטה 4 (WT) עכברים שליטים שמש לצורך הליך זה. 1. הכנה טרום ניתוחית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Intraperitoneally (IP) להזריק methoxy-X04 (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) 48 שעות לפני הניתוח לתייג פיקדונות Aβ 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מלאכותי הנוזל השדרתי סטרילי (aCSF) (120 mM NaCl, 26.2 מ&quot;מ 3 NaHCO, 2.5 KCl מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ לאא 2 4 PO, 1.3 מ&quot;מ MgCl 2, 10 גלוקוז מ&quot;מ; בועה עם 95% O 2/5% CO 2 לפני הוספת 2.5 מ&quot;מ CaCl 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר כלים כירורגיים (מספריים, מלקחיים, סכין גילוח מקדח), באמצעות חיטוי או מעקר חרוז חם לפני ספטיתכִּירוּרגִיָה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את צלחת ספסל מיקרוסקופ כירורגי עם 70% אתנול ו מכסה במגבת סופגת נקיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק קטמין / xylazine (75 מ&quot;ג / ק&quot;ג ו -10 מ&quot;ג / ק&quot;ג, בהתאמה) ואת ketoprofen כאבים IP (2.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הרמה המתאימה של הרדמה בצביטות כפה או זנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחת עיניים סטריליות לעיניים לגלח את הפרווה (אף לאוזניים) תוך הימנעות השפם. קרם מקריח יכול לשמש עוד הוא ואחריו שטיפה בזהירות במים על מנת למנוע גירוי בעור. לגלח את הפרווה הנותרים עם סכין גילוח. לעקר את העור עם פתרון חיטוי-יוד povidone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר תחת מיקרוסקופ המשקפת ולעשות חתך בעור מהאוזניים אל האף. משוך את העור לצדדים לחשוף את הגולגולת. לחתוך את periosteum שוב ושוב לשטוף את הגולגולת עם aCSF סטרילי לעצור דימום אפשרי. </li></ol> 2. תיוג כלי הדם ואת דליל גולגולתהכנת חלונות (40 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את משחת עיניים עם קצה כותנה. החל ירידה של הרדמת עיניים אקטואלית (tetracaine 1%) בעדינות ללחוץ על העור סביב ארובת העין כדי להשיג בליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק isothiocyanate והעמסת (FITC) מצומדות עם Dextran (70 KDA) (100 מ&quot;ג / ק&quot;ג או 50 μl של פתרון 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל; מחט אינסולין תת עורי) בסינוס רטרו מסלולית הנוהל המתואר על ידי ירדני ועמיתיו 12. החל משחת עיניים סטריליות לעיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי העור הוא חזר בו הגולגולת היא נקיה ויבשה מסביב לאזור ההדמיה שנבחר. למרוח כמות קטנה של דבק cyanoacrylic סביב החלון של ראש מכשיר הר (מורכב להבים כתער מוערם, ראה איור 1), ודבק סביב אזור היעד הפעלה לחץ עדין במשך כמה שניות 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את הקצוות של העור אל קצה החלון של ראש מכשיר הר, מוודא את האזוריָבֵשׁ. אבטח את העור ואת קצה החלון עם כמות קטנה של דבק cyanoacrylic כיתת וטרינרים ולחכות עד יבש (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure חיה בשלב השימוש בהתקן ראש ההר. לשטוף עם aCSF סטרילי ולהבטיח כי גם בין העור לבין התקן ראש ההר אטום לחלוטין. עוטף את העכבר בשמיכת הישרדות לשמור טמפרטורה נורמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע דליל של הגולגולת בתמיסת aCSF כפי שתוארו לעיל 10. ראוי לציין, כי הקרקפת לא הוסרה לחלוטין. באופן קבוע לשנות את aCSF כדי לנקות פסולת עצם כדי למנוע התחממות יתר של רקמות. כל פסולת עצם נותרת ניתן להסיר עם פחזניות אוויר קצרות. פתרון aCSF גם פוחת ויברציות שנוצרו על ידי קידוח. הערה: עכבר גולגולת העובי משתנה בין 80 ל 150 מיקרומטר בהתאם לגיל של החיה ואת האזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מקדח שיניים (במהירות בינונית וכן בר 0.7 מ&quot;מ) להתחיל לדלל את פני הגולגולת באזור 1.0 מ&quot;מ קוטר באמצעות במקביל תנועה אנכי קבוע לגולגולת ולהסיר את רוב העצם הספוגי (ראשון 40 - 70 מיקרומטר). לזכור להחליף aCSF כל 20-30 שניות ולהגביל קידוח רצוף 3-4 שניות. שימו לב תפרי העצם קרוב vascularized מאוד. החל aCSF presoaked gelfoam לעצור דימום הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין microsurgical עיני הפנויה חד להמשיך עם הדילול של הגולגולת, נזהר שלא להפעיל לחץ מוגזם. האזור האחרון הוא של כ -0.5 מ&quot;מ בקוטר בעובי של 20 - 35 מיקרומטר. הערה: בשל עצם לצמיחה מחודש וצלקות, יש צורך עוד דקת החלון בכל פגישת הדמיה. </li></ol> שני פוטונים 3. מיקרוסקופי (45 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, להזריק עם קטמין 19 מ&quot;ג / ק&quot;ג לשמור הרדמה נאותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העכבר (מקובע בשלב headmount) תחת מיקרוסקופ לייזר שני פוטונים. באמצעות obj טבילה במים 20Xective עם צמצם מספרי של 1.0, לאתר את חלון גולגולתי הדליל במרכז השדה האופטי באמצעות מנורת EPI-ניאון. ודא כי המטרה היא שקועה תמיד aCSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל סריקת לייזר עם לייזר פעמו נעול במצב (680-1040nm Ti-ספיר). גדר גל עירור ב 750 ננומטר לזהות את הקרינה הנפלטת של methoxy-XO4 ו FITC-dextran באפיקים הכחולים וירוקים בהתאמה. הערה: יש המיקרוסקופ שני מפצלי קרן ב 506 ננומטר ו 555 ננומטר. אור כחול הוא נתפס על ידי גלאי NDD המצוידת במסנן ננומטר 470 ± 12. אור ירוק הוא נתפס על ידי גלאי Gaasp רגישות גבוהה המצוידת במסנן ננומטר 525 ± 25. כוח הליזר המקסימאלי נפלט המטרה לא יעלה על 10 mW כדי למנוע ניזק לרקמות נגרם ליזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש ערימה בהגדלה נמוכה (500 מיקרומטר x 500 מיקרומטר, 512 x 512 פיקסלים; 2 מיקרומטר צעד) בשעת זום מספרי 0.7x ליצור מפת 3D עבור relocalization המדויק של ROIב מאוחר יותר נקודות זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש פסיפס של 4 תמונות בהגדלה גבוהות דיגיטליות עם זום מספרי 2X (200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר, 512 x 512 פיקסלים; 1 מיקרומטר צעד). השימוש בתוכנת ההדמיה להזיז את החלון 200 מיקרומטר צעדים כדי ללכוד כל האזורים. עומק הערימות הוא בדרך כלל 250 מיקרומטר, החל משטח pial בכל תמונה של הפסיפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הסרת העכבר המיקרוסקופ, לצלם תמונה או לעשות מפה 2D מצוירת ביד של כלי הדם pial עבור relocalization העתיד של בתחום ההדמיה. </li></ol> שחזור 4. מחדש הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ההתקן הר הראש ידי החלת גרירה תוך כדי לחיצה על הגולגולת מתחת. אם כל דבק נשאר מחובר הגולגולת או העור, לגרד אותו בזהירות עם מלקחיים בסדר. לתפור את הקרקפת ומניח את העכבר בכלוב מחומם לפקח התאוששות מן ההרדמה לפני החזרתו לכלוב בבית. החל משחה אנטיביוטית אקטואלי תפר ולהזריק ketoprofen (2.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) אניP הבאה 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.1 כדי 2.5 עבור הפעלות הדמיה חוזרות ונשנות. במידת הצורך, לגלח את העצם עם להב microsurgical על מנת להבטיח איכות אופטימלית של התמונה. הערה: דילול נוסף עם מקדח השיניים עשויה להיות נחוצה כאשר המרווח בין פגישות הדמיה הוא יותר מחודש אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכבר מתחת למיקרוסקופ באמצעות אור epifluorescent לפי מפת 2D של כלי הדם pial שנלקחו במפגש הקודם (שלב 3.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל סריקת ליזר שני פוטונים ולהתאים במת מיקרוסקופ כדי להשיג יישור בקנה המידה מיקרומטר באמצעות מפת 3D שהושגה בשלב 3.4. המשך הדמיה מפורטת כמתואר בשלב 3.5. </li></ol> 5. לאחר רכישת ניתוח לשיקום תמונה תלת ממדי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג שחזורים תלת ממדי של כלי הדם ואת תצהירים עמילואיד באמצעות תוכנת ניתוח תמונת 3D כגון Imaris (גרסה בשימוש 8.0 ו 7.7.2). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תוסף Layer לנרמל בתפריט עיבוד תמונת משנה שינוי בניגוד להשיג ניגודיות אידיאלי של שני הערוצים בעומק כולו ערימת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות מאותו האזור בכל נקודות הזמן בו זמנית תמיד לעבד אותם במקביל על מנת להשוות את בנקודות הזמן השונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי מעקב באמצעות מודול נותב נימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על סמל הנימה ליצור נימה חדשה, לדלג על נותב האוטומטי לבחור את השיטה האוטומטית הנתיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד הערוץ הנבחר תואם את תמונת כלי דם באמצעות הפונקציה הנבחרת של המצביע, לחץ על הסתעפות כלי שיט נשמרת ברחבי הפעלות ההדמיה תוך כדי הלחיצה על מקשי shift + בקרה כדי לקבוע נקודת התחלה. השתמש בפונקציה הנבחרת של המצביע ולחץ תוך החזקת מקש Shift כדי לבחור את נקודות הקצה של החוטים. הערה: השוואת obtaiשלדים נדים יציגו שינויים מבניים של כלי הדם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מטוס על ידי ניתוח מטוס כדי לעקוב אחר לוחות חדשים. החל מודול משטח לערוץ הכחול למעקב אחר את היווצרות הפלאק Aβ. הקש על סמל השטח כדי ליצור משטח חדש להמשיך ביצירת המשטח האוטומטית. השתמש בשיטת thresholding להגדיר ולחסר את אות הרקע. בתפריט הנתונים הסטטיסטיים מספק ביחס נתונים על פני השטח של פיקדונות עמילואיד הפרט. </li></ol>

<ol><li>Harb, R., Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+cerebral+microvascular+plasticity+from+birth+to+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of cerebral microvascular plasticity from birth to death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (1), 146-156 (2013).</li>
<li>Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbed+neural+activity+disrupts+cerebral+angiogenesis+during+a+postnatal+critical+period%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perturbed neural activity disrupts cerebral angiogenesis during a postnatal critical period.</a> Nature. 505 (7483), 407-411 (2014).</li>
<li>Masamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+sprouting%2C+extension%2C+and+creation+of+new+capillary+connections+with+adaptation+of+the+neighboring+astrocytes+in+adult+mouse+cortex+under+chronic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Microvascular sprouting, extension, and creation of new capillary connections with adaptation of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under chronic hypoxia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 325-331 (2014).</li>
<li>Marchi, N., Lerner-Natoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+remodeling+and+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular remodeling and epilepsy.</a> Neuroscientist. 19 (3), 304-312 (2013).</li>
<li>Giannoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+pathology+during+the+progression+of+experimental+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular pathology during the progression of experimental Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 88, 107-117 (2016).</li>
<li>Kimbrough, I. F., Robel, S., Roberson, E. D., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+amyloidosis+impairs+the+gliovascular+unit+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Vascular amyloidosis impairs the gliovascular unit in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 138 (Pt 12), 3716-3733 (2015).</li>
<li>Herzig, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+is+targeted+to+the+vasculature+in+a+mouse+model+of+hereditary+cerebral+hemorrhage+with+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis.</a> Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).</li>
<li>Oakley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraneuronal+beta-amyloid+aggregates%2C+neurodegeneration%2C+and+neuron+loss+in+transgenic+mice+with+five+familial+Alzheimer%27s+disease+mutations%3A+potential+factors+in+amyloid+plaque+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation.</a> J Neurosci. 26 (40), 10129-10140 (2006).</li>
<li>Liston, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+glucocorticoid+oscillations+promote+learning-dependent+synapse+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian glucocorticoid oscillations promote learning-dependent synapse formation and maintenance.</a> Nat Neurosci. 16 (6), 698-705 (2013).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Klunk, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Abeta+plaques+in+living+transgenic+mice+with+multiphoton+microscopy+and+methoxy-X04%2C+a+systemically+administered+Congo+red+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Cao, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+experience-dependent+molecular+changes+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons.</a> J Vis Exp. (71), (2013).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+attack%3A+the+role+of+inflammation+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Joseph-Mathurin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+immunization+worsens+iron+deposits+in+the+choroid+plexus+and+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta immunization worsens iron deposits in the choroid plexus and cerebral microbleeds.</a> Neurobiol Aging. 34 (11), 2613-2622 (2013).</li>
<li>Sadowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+prion+amyloid+deposits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting prion amyloid deposits in vivo.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).</li>
</ol>

אין מחברים אינטרסים כלכליים מתחרים.

הטכניקה פתוחה הגולגולת עבור in vivo שני פוטונים במיקרוסקופ מציעה את היתרון של הפעלות הדמיה בלתי מוגבלות של שדות הדמיה גדולים 13,14. עם זאת, הטכניקה הזו גם מייצרת דלקת באזור של עניין 14, לעתים קרובות לא תואם או להשפיע נוירו-וסקולרית לקריאה פסקי 15. תהפוך הוא, טכניקת transcranial הגולגולת הדלילה לא לגרום לדלקת נוירו, המאפשרת הדמיה אמינה של מבני כלי הדם במוח ורובד הצטברות 10,14. יתרון שני שהציג שיטה זו הוא כי שיעור הצלחת חלון דליל-...

בכלי הדם במוח הוא מבנה רב תאי, אשר מבחינה אנטומית והן מבחינה תפקודית מצמיד את הנוירונים. שיפוץ דינמי של כלי מתרחש לאורך התפתחות המוח במהלך ההתקדמות של פתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) 1,2. מקובל כי נזק מוחי הוא סימן ההיכר של כמה מחלות של מערכת העצבים המרכזית, כולל אפילפסיה, מחלת אלצהיימר (AD), פגיעה מוחית טראומטית דלקת המוח 3,4. לכן, מעקב אחר שינויי דם במוח in vivo הופך משמעותי כאשר דוגמנות מחלות מערכת עצבים מרכזיות, מהופעה ולתוך שלבים כרוניים. כמו שינויים דם במוח לעיתים קרובות להתקיים בו זמנית עם נזק עצבי או פלסטיות, הדמיה של כלי הדם-נוירו מייצג נקודת כניסה המפתח לפענח פתופיזיולוגיה מחלה של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר הליך שני פוטונים אורכי מבוסס לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במודל של עכברים שללספירה, פתולוגיה מתקדמת בסימן פגמים כלי דם במוח על כלי קליבר גדולים וקטנים בשל בתצהיר פלאק amyloidogenic 5-7. הליך זה מאפשר הדמיה של פיקדונות עמילואיד ומעקב על המצב וצמיחה שלהם ביחס שיפוץ העצבים וכלי הדם לאורך מהלך המחלה. צבעי ניאון ויטל מוזרקים לפני כל פגישה הדמיה הדמיה של הפלאק cerebrovasculature ו עמילואיד בעכברים לספירה מהונדס 8. פגישות הדמיה חוזרות של ROI דרך חלון transcranial הגולגולת דליל אינן פולשני ואת שיטת הבחירה להעריך שיפוץ עצבים וכלי דם במוח עכבר חיים 2,5,9,10. ההליך שלהלן מתאר את הפרוטוקול כירורגית, רכישת תמונה ועיבוד. ההתקדמות מוקדם של angiopathy עמילואיד מוחות (CAA) בעיקר leptomeningeal הגדול arterioles חודר מאופיינת.

<table><tbody><tr><td>methoxy-X04</td><td>tocris</td><td>4920</td><td>השתמש ב-10 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>FITC-Dextran 70 Kda</td><td>sigma</td><td>46945</td><td>השתמש ב-100 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>ג'לקצף/Bloxang</td><td>Bausch and Lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>להב מיקרוכירורגי</td><td>surgistar</td><td>6900</td><td>חייב להיות חד ולא שקע</td></tr><tr><td>povidone-iodine</td><td>betadine</td><td></td><td>תמיסה אנטי-סקפטית</td></tr><tr><td>משקפת סטריאומיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SX10</td><td>ניגודיות תמונה אופטימלית היא חיונית להליך זה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ 2 פוטונים</td><td>zeiss</td><td></td><td>Zeiss LSM 710mp</td></tr><tr><td>מספריים עדינים - toughcut</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14058-09</td><td>מספריים אלה מותאמים לחיתוך עור ורקמות רכות</td></tr></tbody></table>

אֹרכִּי<em&gt; in vivo</em&gt; הדמיה של cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

שיפוץ של כלי הדם במוח הוא תכונה נפוצה של פתולוגיות במוח. בשנת vivo טכניקות הדמיה הן יסוד לזהות פלסטיות כלי דם במוח או קר ניזק שעות נוספות ביחס פעילות עצבית או זרימת דם. במיקרוסקופיה שני הפוטונים vivo מאפשר לימוד של פלסטיות מבנית ותפקודית של יחידות סלולר גדולה המוח החי. בפרט, הכנת חלון הגולגולת הדלילה מאפשרת ההדמיה של אזורים בקליפת המוח של עניין (ROI) ללא גרימת דלקת מוח משמעותית. פגישות הדמיה חוזרות ונשנות של ROI קליפת המוח הן ריאליות, מתן האפיון של סימני היכר מחלה לאורך הזמן במהלך ההתקדמות של מחלות מערכת עצבים מרכזיות רבות. טכניקה זו גישת מבני pial בתוך 250 מיקרומטר של המוח מסתמכת על זיהוי של בדיקות ניאון המקודדים על ידי סמנים תאיים גנטיים ו / או צבעים חיוניים. האחרון (למשל, dextrans הניאון) משמש כדי למפות את לומיןתא אל מבני כלי דם במוח. רלוונטי הפרוטוקול המתואר במסמך זה שימוש סמן in vivo של פיקדונות עמילואיד, methoxy-O4, להעריך מחלת אלצהיימר התקדמות (AD). כמו כן, אנו מתארים את עיבוד תמונה שלאחר הרכישה להשתמש כדי לעקוב אחר שינויים בכלי דם תצהירים עמילואיד. תוך התמקדות כיום על מודל של מחלת אלצהיימר, פרוטוקול המתואר רלוונטי הפרעות CNS אחרים בהם שינויים מוחי פתולוגי להתרחש.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לדמיין את השעות הנוספות cerebrovasculature ופיקדונות עמילואיד. צבעי ניאון הוזרקו לתייג תצהירים עמילואיד (methoxy-XO4) 11 וכדי למלא את לומן כלי דם במוח (FITC-dextran) 1. מודולי תוכנה לניתוח תמונת 3D שמש כדי ליצור תמונות 3D של שדה קבוע מבט שנתפס נקודות רצופות זמן. נציג תמונות שהושגו הקליפה החושית של 5XFAD עכברים 5 (מודל הגנטי של מחלת אלצהיימר) מראה כי פיקדונות Aβ ביותר מופיעים בין 3 ל -4 חודשים ש...

כתב יד זה מתאר הליך לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במהלך הצטברות פלאק עמילואיד in vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ אורך. הכנה הגולגולת דליל מאפשר הדמיה של צבעי ניאון כדי להעריך את התקדמות הנזק כלי דם במוח במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר.

אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לעקוב אחר עיצוב מחדש (remodeling) של כלי הדם במוח העכבר במהלך התקדמות של מחלה כרונית לאורך פרקי זמן ממושכים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון תפקידו של עיצוב מחדש של כלי הדם המוחיים במחלות של מערכת העצבים המרכזית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא פולשנית באופן מינימלי וללא דלקת עצבית, מה שהופך אותה לאידיאלית למחקר של פתולוגיות שבהן דלקת היא למעשה חלק מהתהליך.טכניקה זו מאפשרת הדמיה של כלי דם פיאליים (pial) וכלי דם קורטיקליים חודרים, ובכך היא משלימה טכניקות היסטולוגיות המיועדות להדמיות של מיקרו-קפילרות בתוך פהמרנכימה של מחסום הדם-מוח. את הפרוצדורה תדגים מרגריטה ארנגו-ליבנו, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי.כדי להתחיל בהליך זה, נקו את שולחן הניתוח ואת משטח המיקרוסקופ באמצעות 70% ethanol וכסו אותם בבד סופג ונקי. לאחר מכן, בדקו אם רמת ההרדמה מתאימה באמצעות צביטה של כף הרגל או הזנב. לאחר מכן, מרחו פומדה עינית סטרילית על העיניים וגלחו את הפרווה מאזור האף ועד האוזניים באמצעות להב תער.לאחר מכן, חטאו את העור באמצעות תמיסת פובידון יוד אנטיספטית. הניחו את העכבר תחת מיקרוסקופ בינוקולרי ובצעו חתך בעור מהאוזניים לכיוון האף. משכו את העור לצדדים כדי לחשוף את הגולגולת.לאחר מכן קרעו את הפריוסטום (periosteum) ושטפו שוב ושוב את הגולגולת ב-ACSF סטרילי כדי להפסיק דימומים אפשריים. בהליך זה, הסירו את משחת העין בעזרת מקלון. לאחר מכן, טפטפו טיפה אחת של חומר אלחוש עיני מקומי.לחץ בעדינות על העור סביב מחלול העין כדי להשיג בליטה. לאחר מכן, מזריק FITC המשורשר לדקסטראן לתוך הסינוס הרטרו-אורביטלי. לאחר מכן, מרח משחה עינית סטרילית על העיניים.ודאו כי העור מודחה וכי הגולגולת נקייה ויבשה מסביב לאזור ההדמיה הנבחר. לאחר מכן, מרחו כמות קטנה של דבק ציאנואקרילית מסביב לחלון של מכשיר קיבוע הראש והדביקו את מכשיר קיבוע הראש מסביב לאזור המטרה. לאחר מכן, הפילו לחץ עדין על מכשיר קיבוע הראש למשך מספר שניות.משכו את קצות העור אל קצה החלון של מכשיר קיבוע הראש, וודאו שהאזור יבש. קבעו את העור ואת קצה החלון בעזרת כמות קטנה של דבק ציאנואקרילית והמתינו לייבוש. לאחר מכן, קבעו את החיה על הבמה באמצעות מכשיר קיבוע הראש.שטפו את העצם באזור היעד עם ACSF סטרילי וודאו שהחריץ שבין העור למכשיר קיבוע הראש אטום לחלוטין. לאחר מכן, עטפו את העכבר בשמיכת הישרדות כדי לשמור על נורמותרמיה (טמפרטורת גוף תקינה). כעת בצעו דילול של הגולגולת בתמיסת ACSF כדי להפחית רעידות הנובעות מהקידוח.זכרו להחליף את ה-ACSF באופן קבוע כדי לנקות את שאריות העצם ולמנוע התחממות יתר של הרקמה. בעזרת מקדח שיניים, התחילו לד化 את פני השגול באזור בקוטר של מילימטר אחד, תוך שימוש בתנועה אנכית קבועה במקביל לגולגולת, והסִירו את רוב העצם הספוגית. שימו לב כי העצם הסמוכה לתפרים (sutures) היא בעלת כלי דם רבים.אם terjadi דימום, יש להנח ספוג ג'ל ספוג מראש ב-ACSF כדי לעצור אותו. אנו משאירים את העצם כדי להגביל את הדלקת, אך לחץ מוגבר או חימום במהלך הליך הדילול עלולים גם הם לגרום לדלקת. השתמשו בלהב מיקרו-כירורגי פתואלמי חד וחד-פעמי כדי להמשיך בדילול הגולגולת, עד לקבלת אזור סופי בקוטר של כ-0.5 מילימטרים ובעובי של 20 עד 35 micrometers, תוך הקפדה שלא להפעיל לחץ מוגבר.בשל צמיחה מחדש של עצם והיווצרות צלקות, יש צורך לדלל את החלון עוד יותר בכל מפגש דימות. בשלב זה, העבירו את העכבר עם במה למחזיק הראש תחת מיקרוסקופ הלייזר דו-פוטוני. באמצעות עדשת טבילה במים 20X בעלת מפתח מספרי של 1.0, אתרו את החלון הגולגולתי הדק במרכז השדה האופטי בעזרת נורת פלואורסצנציה (epifluorescent lamp).ודאו שהעדשה תמיד טבולה ב-ACSF. לאחר מכן, התחילו בסריקת לייזר באמצעות לייזר פולסי עם מצב נעילה (mode-locked pulse laser). הגדירו את אורך גל העירור ל-750 ננומטר כדי לזהות את הפלואורסצנציה הנפלטת של ה-methoxy-X04 בערוץ הכחול ושל FITC-dextran בערוץ הירוק.רכשו סדרת תמונות (stack) בהגדלה נמוכה בזום נומרי של 0.7X כדי ליצור מפה תלת-ממדית לצורך מיקום מחדש מדויק של ה-ROI בנקודות זמן מאוחרות יותר. לאחר מכן, רכשו פסיפס (mosaic) של ארבע תמונות בהגדלה דיגיטלית גבוהה עם זום נומרי של 2X. בעזרת תוכנת ההדמיה, העבירו את החלון במדרגות של 200-micrometer כדי ללכוד את כל האזורים.עומק הערימות הוא בדרך כלל 250 micrometers החל מהפני השטח של הפיאל (pial surface) בכל תמונה של הפסיפס. לפני הוצאת העכבר מהמיקרוסקופ, צלמו תמונה או הכינו מפה דו-ממדית מצוירת ידנית של כלי הדם בפיאל לצורך מיקום מחדש של שדה הדמיה בעתיד. מוצגת כאן השוואה בין שתי תמונות משוחזרות של המיקרווסקולטורה והשקעות עמילואיד בעכבר five X FAD בגיל ארבעה וחמישה חודשים.פלאקים עמילואידיים מסומנים בכוכביות לבנות, ופלאקים חדשים המופיעים בחודש החמישי מסומנים בכוכביות צהובות. מקרה נדיר של הפחתה בפלאקים מסומן בכוכבית כתומה. מיקרו-כלי דם שנוצרו לאחרונה מסומנים בחצים צהובים, בעוד שחסימה וסקולרית מסומנת בחץ אדום.איור זה מראה כי משקעי עמילואיד מצטברים על כלי דם בעלי קליבר גדול. בו-בזמן, ניתן להבחין בלוחיות עמילואיד גם על כלי דם בעלי קליבר קטן. חצים אדומים מצביעים על כלי דם חסומים, בעוד שכוכביות לבנות מצביעות על לוחיות עמילואיד גדלות.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך 1 1/2 שעות, כולל שלבי הניתוח והדימות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לתכנן את מספר מפגשי הדימות על מנת להגביל כדיקה מוגברת במפגש הראשון. באופן כללי, פרוצדורות אלו מאפשרות מעקב אחר שינויים בכלי הדם המוחים במהלך התקדמות המחלה.

longitudinal-vivo-imaging-cerebrovasculature-relevance-to-cns

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מקור: Arango-Lievano, M. et. al., הדמיה אורכית in vivo של כלי הדם במוח: רלוונטיות למחלות מערכת העצבים המרכזית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הדמיה דו-פוטונית in vivo כדי להמחיש פלאק עמילואיד וכלי דם מוחיים עם תווית פלואורסצנטית. פלואורסצנציה כחולה מסמנת פלאק, בעוד פלואורסצנציה ירוקה מדגישה את כלי הדם במוח. מפה תלת מימדית של אזור העניין והדמיית פסיפס ברזולוציה גבוהה חושפות אינטראקציות מפורטות של פלאק עמילואיד עם כלי מוח.

הדמיה in vivo של כלי מוח ופלאק עמילואיד במודל עכבר של מחלת אלצהיימר

מאמר זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניתן לכמת את ארכיטקטורת כלי הדם במוח באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני in vivo ו-ex vivo.

כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה HIV

פרוטוקול זה מתאר את היישום של ניאון בשילוב האינפרה-אדום הקרוב (NIRF) הדמיה וטומוגרפיה-מחושב מיקרו (microCT) המאפשר הדמיה thromboemboli מוחין. טכניקה זו מאפשרת כימות של נטל פקיק ואבולוציה. טכניקת דימות NIRF מדמיינת שכותרתו fluorescently פקיק במוח הניכר, ואילו טכניקת microCT מדמיינת פקיק בתוך חיות בעלות באמצעות-חלקיקי זהב.

משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli

אנו מתארים מודל עכבר של מלריה מוחית ניסיונית ומראים כיצד ניתן לעקוב אחר פתולוגיה דלקתית ומיקרו-וסקולרית in vivo באמצעות הדמיית תהודה מגנטית.

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

ההערכה סימולטני של ההמודינמיקה מוחות תכונות פיזור האור של רקמת מוח in vivo עכברוש מודגמת באמצעות מערכת הדמית החזרת multispectral דיפוזי קונבנציונלית.

הערכה סימולטנית של המודינמיקה מוחית ופיזור תכונות אור של<em&gt; In vivo</em&gt; מוח עכברוש באמצעות הדמית החזרה המפוזרת Multispectral

בעוד שדימות מולטיפוטונים יעיל רק בעומקים מוגבלים מפני השטח של הרקמה, ניתן להשיג הדמיה ברזולוציה של 3 מיקרומטר בכל עומק באמצעות pCLE. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הדמיית pCLE למדידת דינמיקה מיקרו-וסקולרית בהיפוקמפוס של עכברי איקטל ועכברי בר.

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-Scanning Endomicroscopy (pCLE) של נימי היפוקמפוס בעכברים ערים

Transcranial הדמיה אופטית מאפשרת הדמיה בשדה רחב של הובלה נוזל מוחי שדרתי בקליפת עכברים חיים דרך הגולגולת שלם.

ב Vivo הדמיה של התחבורה נוזל שדרתי דרך הגולגולת העכבר ללא שינוי באמצעות זריחה מאקרוסקופיה

פרוטוקול זה מתאר טכניקת השרשה כרונית חלון הגולגולת שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה האורך של מבנים נוירווליו-כלי דם, אינטראקציות, ותפקוד בתנאים בריאים ונגועים. היא משמשת כחלופה משלימה לגישת הדימות הtranscranial, שבזמן הרצוי לעתים קרובות, יש כמה מגבלות קריטיות.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

פרוטוקול זה מציג צעדים לרכישה וניתוח של תמונות סידן פלואורסצנטיות מפריקיטים משחישת מוח ונתוני זרימת דם מכלי דם סמוכים בעכברים מרדים. טכניקות אלה שימושיות למחקרים של פיזיולוגיה של תאי קיר וניתן להתאים אותן לחקור סידן ארעי בכל סוג תא.

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של ביומולקולות המבוססות על הרטט הפנימי שלהם של קשרים כימיים ספציפיים. בפרוטוקול זה, ההתקנה האינסטרומנטלית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של SRS ושני פוטונים מתוארת כדי לדמיין מבנים תאיים בחוט השדרה של עכברים חיים.

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

כדי לחקור את ויסות זרימת הדם במוח in vivo, שיטות פרמקולוגיות מסורתיות הן פולשניות, ולעתים קרובות פוגעות בגולגולת, בדורה ובלפטומנינג. בעבודה זו, פיתחנו טכניקה זעיר פולשנית המשלבת הזרקת מגנה תוך-ציסטרנלית מונחית ננו-מזרק (ICM) עם הדמיית ניגודיות כתמי לייזר, תוך שמירה על שלמות הגולגולת והלפטומנינגים.

בדיקת ננו-הזרקת Cisterna Magna מזווגת ובדיקת הדמיית ניגודיות כתמי לייזר לחקר ויסות זרימת הדם במוח in vivo

למדו מעקב אחר שינויים בכלי הדם במוח בעכברים במהלך מחלות ניווניות באמצעות מיקרוסקופיית שני-פוטון לאורך זמן. שיטה זו מאפשרת הדמיה פחות פולשנית של מערכת העצבים המרכזית.

אֹרכִּי

גלה סרטונים נוספים