שיטה לחילוץ פיגמנטים מן קלמארי Doryteuthis pealeii

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר כיצד לחלץ פיגמנטים הממוקמים בתוך הגרגירים הננו-מובנים של דיונון טרי שנותח, Doryteuthis pealeii chromatophores. צפלופודים הם בעלי חיים ימיים מורכבים העוברים שינויים מהירים ואדפטיביים בצבע העור שלהם. ושינויים אדפטיביים בצבע העור שלהם.

עם זאת, יש עדיין הרבה מה שלא ידוע על אופן פעולת המערכות הללו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מכוונת באופן ספציפי לגרגירים הננו-מובנים באיבר הכרומטופור. זה יאפשר לחוקרים להבהיר את המנגנון לשינוי צבע שמקורו בקנה מידה ננומטרי.

בנוסף לתובנה על הביולוגיה של צפלופודים, הוא יכול ליידע תכנון של מערכות סינתטיות שנבנו כדי לחקות את הטווח הדינמי של צבע אדפטיבי המוצג בצפלופודים באמצעות ננו-חלקיקים פיגמנטיים ארוזים מראש. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו נאבקים מכיוון שאיסוף רקמת כרומטופור טהורה קשה בשל קרבתה לרקמה הסובבת. השיטה שלנו מותאמת להפחתת מזהמים אלה.

כדי להתחיל בדיסקציה, שפכו תחילה כ-250 מיליליטר מי ים מסוננים לתבנית חיתוך. מניחים דגימה בתבנית ובעזרת מספריים דקים ישרים מנירוסטה, חתוכים מבסיס מעטפת הגחון לאורך הצד האחורי של החיה, ומסתיימים באזור הסנפיר. הסר את כל האיברים הפנימיים על ידי הרמתם בעדינות בעזרת מלקחיים מנותחים וניתוק רקמת החיבור באמצעות המספריים.

השליכו את האיברים בשקית דגימה. בעזרת חיתוך סיכות T, הצמד את צד סנפיר המעטפת כלפי מעלה לתוך כרית החיתוך. בעזרת מלקחיים, הסר בזהירות את שכבת העור האפידרמיס האטומה, תוך שמירה על שכבת העור המכילה כרומטופור שלמה.

השליכו את שכבת האפידרמיס בשקית דגימה. לאחר מכן, הסר את שכבת הכרומטופור. חותכים את רקמת הכרומטופור לקטעים קטנים של סנטימטר על סנטימטר אחד.

הנח את החלקים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, ומלא כל צינור באמצע הדרך ברקמה מנותחת. לבסוף, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מי ים מסוננים לצינורות. כדי לבודד את גרגירי הפיגמנט, צנטריפוגה תחילה את חלקי רקמת הכרומטופור למשך חמש דקות בטמפרטורה של 14,000 x גרם.

השליכו את השכבה העליונה של מי הים. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת קולגנאז פפאין לדגימות ומערבולת למשך דקה עד שתיים בהגדרה הגבוהה ביותר. לאחר מכן, סוניקציה של הדגימות למשך חמש דקות ב-40 קילו-הרץ כדי לנתק תאים מהרקמה שמסביב.

צנטריפוגה למשך חמש דקות נוספות בטמפרטורה של 14,000 x גרם ואז השליכו את הסופרנטנט. חזור על הצנטריפוגה פעמיים נוספות, והשליך את הסופרנטנט בכל פעם. לאחר מכן, הוסף את ההשעיה מחדש בקולגנאז.

השתמש במלקחיים כדי להסיר ידנית את כל חלקי הרקמה הגדולים שנותרו שלא התעכלו לפני שתמשיך. טוהר תמיסת הגרגירים ההתחלתית משפיע על מיצוי הפיגמנט. לכן חשוב לוודא שחומרי הכרומטופור ההתחלתיים מתעכלים במלואם.

אנו מוצאים כי קטעי רקמה סביב סנטימטר אחד הם אופטימליים לאיסוף אוכלוסיית הגרגירים הטהורה ביותר. הכן את מאגר ההומוגניזציה על ידי נטילת צינור מכסה בורג של 150 מיליליטר והוספת הכמות המתאימה של HEPES, מגנזיום כלוריד, אשלגן אספרטט ודיתיותרייטול. הוסף מיני טבליה מסחרית אחת של מעכב פרוטאז.

בעזרת גליל מדורג מודדים 100 מ"ל מים נטולי יונים ומוסיפים אותם לצינור המכיל את מלחי ההומוגניזציה. מערבל את הצינור כדי לערבב עד שהתמיסה תתבהר. צנטריפוגה את דגימות הרקמה ואז השליכו את הסופרנטנט.

הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה לכל צינור ומערבולת ל-2 דקות לערבוב יסודי. סוניקציה של הדגימות למשך 30 דקות ב-40kHz. ואז צנטריפוגה אותם שוב.

לאחר השלכת הסופרנטנט, חזור על תוספת ההומוגניזציה, הסוניקציה והצנטריפוגה פעמיים-שלוש כדי להבטיח עיכול מלא של הרקמה החוץ-תאית. לבסוף, הצינור צריך להכיל סופרנטנט צהוב בהיר וכדור בצבע אדום המורכב מגרגירי הפיגמנט המבודדים. השליכו את הסופרנטנט.

ראשית, הכינו מתנול חומצי למיצוי בדגימת זכוכית עם מכסה בורג על ידי הוספת 5 מ"ל מתנול ו-25 מק"ל של חומצה הידרוכלורית מרוכזת. מערבבים את התמיסה בעדינות כדי לערבב. הניחו בצד צינור דגימה אחד, זה יהיה הטיפול בגרגירים המגיבים הסופיים.

הסר את מאגר ההומוגניזציה מצינור שני המכיל גרגירים. הוסף 500 מק"ל מתמיסת המתנול החומצית לצינורות הנותרים ומערבולת למשך שלוש עד ארבע דקות. סוניקציה של הדגימות למשך 10 דקות ב-40kHz ולאחר מכן צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-14000 x g.

בעזרת מיקרופיפטה, אספו את הסופרנטנט בבקבוקון זכוכית מוברג של דראם אחד. זהו הפיגמנט, והוא אמור להופיע בצבע אדום כהה. חזור על שלבי תוספת המתנול החומציים, הסוניקציה והצנטריפוגה ארבע עד חמש פעמים ואסף את הסופרנטנט עד שלא מופק צבע נוסף.

הגלולה חסרת הצבע שנותרה היא גרגירי הפיגמנט המופקים. כדי להכין דגימות גרגירים להדמיה, צנטריפוגה ראשונה הן את הגרגירים הלא מגיבים והן את הגרגירים המופקים מהפיגמנט למשך חמש דקות ב-14000 x g השליכו את הסופרנטנט, ולאחר מכן השעו מחדש כל כדור ב-1 מ"ל של 95% אתנול. בעזרת פיפטת העברה, הניחו 2-3 טיפות מכל מתלה גרגירים על בדל SEM נפרד מאלומיניום.

מניחים את הדגימות בחומר ייבוש לייבוש למשך הלילה בוואקום. מקרטע מצפים את הבדלים בציפוי פלטינה זהב למשך 3 דקות להשגת ציפוי של 15 ננומטר. דמיין את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

לאחר מכן, השתמש בספקטרופוטומטר כדי לאסוף את פרופילי הספיגה של הגרגירים שלא הגיבו, הגרגירים שחולצו והפיגמנט שחולץ. בצע מדידה ריקה עבור דגימות הגרגירים על ידי הוספת 1 מ"ל מים נטולי יונים לקובטה נקייה. השליכו את הריק למיכל פסולת.

לאחר מכן, הוסף לקובט את התרחיף המכיל את גרגירי הפיגמנט שלא הגיבו. אסוף את ספקטרום ספיגת ה-UV עבור דגימת הגרגיר. קח מדידה ריקה שנייה עבור הפיגמנט המופק באמצעות 1 מ"ל של מתנול חומצי וקובטה נקייה.

לבסוף, קח את ספקטרום ה-UV vis סופג עבור הפיגמנט ולאחר מכן קבע את אורך הגל המרבי של כל דגימה. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק גילה שתהליך מיצוי הפיגמנט מקטין את הקוטר הממוצע של הגרגירים. לפני המיצוי, לגרגירים יש קוטר ממוצע של 527.3 ננומטר.

לאחר הליך המתנול החומצי, גודל זה יורד משמעותית לסביבות 202.6 ננומטר. הפחתה שנחשבת עקב מיצוי הפיגמנט. עם הוספת המתנול החומצי, הצבע הקשור לגרגירים הלא מגיבים פוחת גם הוא באופן ניכר.

אישור להשערה זו הושג באמצעות ספקטרופוטומטריה. גרף זה מציג פרופיל ספיגה רחב עבור הגרגירים שחולצו מראש ופרופיל רחב דומה אך בעוצמה נמוכה יותר עבור הגרגירים שלאחר החילוץ. לעומת זאת, הפיגמנט המופק המסיס מציג למבדה מקסימום בסביבות 500 ננומטר וכתף מובחנת בסביבות 380 ננומטר.

באופן קולקטיבי, נתונים אלה מצביעים על מיצוי מוצלח של צבע גלוי מהגרגירים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כארבע שעות מתחילתה ועד סופה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להסיר לחלוטין את הרקמה המכילה טסיות חלבון רפלקטיביות שעלולות להפריע למיצוי ולניתוח.

רקמת האפידרמיס עלולה גם להפריע לשלבי ההומוגניזציה ולמיצוי הפיגמנט. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו כרומטוגרפיה של שכבה דקה וספקטרומטריית מסה כדי לטהר עוד יותר את הפיגמנטים ולאפיין את הרכבם. שלבים אלה יכולים לעזור להבהיר את התרומות המולקולריות לצבע בצפלופודים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח עבור ביולוגים ימיים, כימאים ומהנדסים כולל: מהו הרכב הפיגמנטים המשמשים במהלך שינוי צבע? וכיצד הם תורמים לתפקוד ולמבנה של גרגירי הננו המובנים בתוך איברי הכרומטופור העוריים? לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ פיגמנט מדיונון טרי שנותח, doryteuthis pealeii chromatophores.