Name: שיטה לחילוץ פיגמנטים מן קלמארי Doryteuthis pealeii (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: למד שיטה לחילוץ פיגמנטים מגרגירי כרומטופורים ננו-מובנים בקלמארי Doryteuthis pealeii. הטכניקה מאפשרת חקירת מנגנוני שינוי הצבע המהירים בראשוניים ותרומה להבנת הסתגלות צבעונית ימית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים בהכרת תודה על השימוש במתקנים באוניברסיטת ניו המפשייר, כולל מרכז המכשור האוניברסיטאי. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת ניו המפשייר, המחלקה לכימיה.

מחקרים בבעלי חיים חסרי חוליות שנערכו במסמך זה אינם מוסדרים בארצות הברית; ולכן ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש אין סמכות לבדיקה של פרוטוקולים כאלה. במקום אלה לא נופלים תחת תחום השיפוט של רגולציה בארצות הברית, בזאת המחברים קובעים כי המחקרים הללו נערכו עם מאמץ כנה כלפי השימוש האתי, טיפול, וטיפול של בעלי חיים אלה, את מספר האנשים היה ממוזער ומאמצים אלה עולה בקנה אחד עם הנחיות אתיקת הכרזת המועצה הבינלאומית באזל למדע בעלי חי מעבדה (ICLAS). 1. pealeii Doryteuthis (ד pealeii) Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיונון הרכישה הערוף ד pealeii ממח&#39; המשאבים הימיים במעבדה לביולוגיה הימית בוודס הול, MA או מכל שוק דגים טריים. אין להשתמש דגימות כי כבר שפרוסות או שינה קודמים כדי שתוכל להחיל הליך זה. באופן ספציפי, chromaשכבת tophore עדיין חייבת להיות ללא שינוי על הדגימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בעלי החיים אינם משמשים מיד, לאחסן אותם ב -20 ° C עד השימוש. כדי להפשיר את דגימות, למקם אותם במים בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 לפני לנתיחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה קנס נקודות ישר נירוסטה, לחתוך לאורך הצד האחורי של החיה. בגין בבסיס מעטפת הגחון, ולסיים ב באזור הסנפיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל האיברים הפנימיים (בטן, זימים, בלוטת דיו, אברי רבייה, לב מערכתי, ולב זרוע) על ידי הרמה אותם עם לנתח מלקחי ניתוק רקמת החיבור שלהם באמצעות מספריים לנתיחה. בטל איברים בתוך שקית דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לנתח T-סיכות להצמיד המעטפת (צד סנפיר למעלה) בתוך 2 תקן 11-1 / &quot;x 7-1 / 2&quot; x 1-1 / 2 &quot;פאן לנתיחה אלומיניום המכיל כרית לנתיחה גמישה. להטביע את הרקמה 250 מיליליטר של מי ים כי סונן דרך מערכת סינון ואקום קלקר חד פעמיהמכיל גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את שכבת העור אפידרמיס (צבע אטום) עם מלקחיים לנתח, משאיר את שכבת העור המכיל כרומטופור ללא פגע. לאחר שכבת אפידרמיס מוסר, וזורק אותו בשקית דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח קטן (1 ס&quot;מ x 1 ס&quot;מ) סעיפים של השכבה כרומטופור עם מלקחיים ומספריים דיסקציה. לאסוף דגימות ב 1.5 מ&quot;ל צינורות מיקרו צנטריפוגות (למלא מחצית צינור אחד ריק עם הרקמה גזור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של מי ים מסונן אל הרקמה המכילה צינורות. הדגימות ניתן לאחסן לילה בשעה 4 ° C.. </li></ol> 2. בידוד כרומטופור גרגרי פיגמנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Papain / collagenase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקול 30 מ&quot;ג של collagenase ו -5 מ&quot;ג פפאין באמצעות חנקן 4 &quot;x 4&quot; נמוך לשקול נייר. העבר אלה לתוך צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ&quot;ל עם ראש מתברג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 10 מ&quot;ל של deionizמי ed בעזרת פיפטה בוגרת. להוסיף ישירות בקבוקון המכיל פפאין / collagenase. וורטקס על ההגדרה הגבוהה ביותר עד הפתרון הוא ברור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת רקמות תאיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה רקמת כרומטופור שנאספו צעד 1.7 במשך 5 דקות ב 14,000 x ז. מחק את השכבה העליונה של מי ים לתוך דלי פסולת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של פתרון פפאין / collagenase אל הרקמה באמצעות micropipette ערוץ יחיד משתנה נפח P1000. וורטקס כל מדגם למשך 1-2 דקות על ההגדרה הגבוהה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate את הדגימות למשך 5 דקות בתדירות של 40 kHz לנתק תאים מן הרקמה הסובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 14,000 x. בטל supernatant לתוך דלי פסולת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה רקמת כרומטופור שנאספו במשך 5 דקות ב 14,000 x ז. מחק את השכבה העליונה של מי ים לתוך דלי פסולת פלסטיק. חזור שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה ידנית כל שניות רקמה גדולות הנותרותמשא שלא לעכל בתהליך זה עם מלקחיים לפני שתמשיך לשלב הבא. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד גרגרי פיגמנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר המגון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 2.38 גר &#39;(4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic) (HEPES, 100 מ&quot;מ), 0.095 גרם של מגנזיום כלוריד (10 מ&quot;מ), 0.856 גרם של-אספרטט אשלגן (50 מ&quot;מ), ו 0.015 גרם של dithiothreitol (1 מ&quot;מ). העבר לתוך מיכל קלקר 150 מ&quot;ל עם ראש מתברג. להוסיף אחד מעכב פרוטאז Tablet מיני מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 100 מ&quot;ל מים ללא יונים באמצעות גליל סיים. להוסיף ישירות מיכל המכיל מלחי המגון. וורטקס עד הפתרון הוא ברור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המגון של גרגרי פיגמנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם משלב 2.1 ב 14,000 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant לתוך דלי פסולת פלסטיק. מדגם זה אמור להיות ריק רקמת תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 &amp;# 181; l של חיץ homogenization כדי צינור כל מערבולת במשך 1-2 דקות כל אחד לערבב את הדגימות ביסודיות. Sonicate את הדגימות למשך 30 דקות (~ 40 kHz) ופעל עם 5 דקות של צנטריפוגה ב 14,000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant לתוך דלי פסולת פלסטיק, חזור על השלב הקודם 2-3 פעמים כדי להבטיח את העיכול המלא של רצועות sacculus וחלבון כרומטופור. הפתרון הנותר צריך להכיל supernatant אור צהובה גלולה אדומה בצבע המכיל את גרגרי פיגמנט מבודדים. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. הפקת פיגמנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מתנול חומציים (HCl-MeOH) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 25 μl של מרוכז (36.5-38% (w / w)) חומצה הידרוכלורית (HCl) עד 5 מ&quot;ל של מתנול (MeOH). אחסן את הפתרון HCl-MeOH בבקבוקון מדגם זכוכית מתברג. מערבולת בעדינות לתערובת הפתרון באופן אחיד. הערה: ככל חומצי הפתרון, הפיגמנט יותר יחולצו במהלך fiחילוץ ראשון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת פיגמנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה גרגר פיגמנט (מ 2.2.2) במשך 5 דקות ב 14,000 XG וזורקים supernatant לדלי פסולת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של פתרון HCl-MeOH מערבולת מדגם עבור ~ 3-4 דקות. Sonicate את הדגימות למשך 10 דקות (~ 40 kHz), ואז צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 14,000 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה העברה, לאסוף את supernatant בבקבוקון זכוכית 1 DRAM הברגה. את supernatant צריך להיות אדום כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 3.2.2 מיצוי שלב עד אין צבע נוסף מופק (~ 4-5 שוטף). הערה: כל חילוץ יניב ~ 1.5 מיליליטר של פיגמנט. הגלולה חסרת הצבע שנותרת היא גרגרי חילוץ פיגמנט. הערה: שני גרגרי צבע ופיגמנטים שחולצו ניתן לאחסן מים ב 4 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol></li></ol> 4. אפיון לאורך תהליך החילוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> El סריקהמיקרוסקופי ectron <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרגרי לתמונה (unreacted משלב 2.2.1 ו-חילוץ פיגמנט משלב 3.2.3) באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לאמת את הטוהר של תהליך החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין דוגמאות גרגיר הדמיה, צנטריפוגה הראשונה הוא גרגרי unreacted וגרגרי חילוץ פיגמנט במשך 5 דקות ב 14,000 XG, וזורקי supernatant לדלי פסולת פלסטיק. Re- להשעות אלה ב 1 מ&quot;ל של אתנול, והפקדת 2-3 טיפות של השעיה גרגיר על הספחים SEM אלומיניום בעזרת פיפטה ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש דגימות לילה, גמגום מעיל עם ציפוי זהב-פלטינה במשך 3 דקות כדי להשיג ציפוי 15 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה באמצעות SEM עם פולט שוטקי וגלאי אלקטרונים משניים. השתמש מתח קורה 5-7 ק ו ו מרחק עבודה בין 8 ו -9 מ&quot;מ לתמונת חומרים אלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultraviolet-גלוי (UV-VIS) מדידות spectrophotometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על פרו ספיגתקבצים עבור כל 3 התנאים (גרגיר unreacted מן 2.2.2, פיגמנט מופק 3.2.3, וגרגרי חילוץ פיגמנט מ 3.2.4) באמצעות ספקטרופוטומטר קרן כפול מ 200-800 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף מדידה ריק באמצעות מים ללא יונים ב קובט 1 מ&quot;ל עבור גרגרי unreacted ואת גרגרי חילוץ פיגמנט. אסוף ספקטרום ספיגת UV-Vis הן דוגמאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף מדידה ריק באמצעות פתרון מתנול חומצי קובט 1 מ&quot;ל עבור הפיגמנט חילוץ. אסוף ספקטרום ספיגת UV-Vis למדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע אורך גל מרבי של כל דגימה על ידי זיהוי את אורך הגל שבו השיא הספיג מגיע לגובה ביחס המקסימלית שלה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bell, G. R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+radial+muscle+fibers+anchor+in+flexible+squid+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin.</a> Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).</li>
<li>Crookes, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflectins%3A+The+unusual+proteins+of+squid+reflective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues.</a> Science. 303 (5655), 235-238 (2004).</li>
<li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-function+relationships+of+a+natural+nanoscale+photonic+device+in+cuttlefish+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).</li>
<li>Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+behavioural+functions+of+structural+coloration+in+cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods.</a> J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+basis+for+camouflaged+polarized+light+communication+in+squid%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid.</a> Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malleable+skin+coloration+in+cephalopods%3A+selective+reflectance%2C+transmission+and+absorbance+of+light+by+chromatophores+and+iridophores%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores.</a> Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).</li>
<li>Cloney, R. A., Brocco, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+Organs%2C+Reflector+Cells%2C+Iridocytes+and+Leucophores+in+Cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods.</a> Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).</li>
<li>Hanlon, R. T., Messenger, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+coloration+in+young+cutttlefish+%28Sepia+officinalis+L%29-+The+morphology+and+development+of+body+patterns+and+their+relation+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).</li>
<li>Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cephalopod+coloration+model.+II.+Multiple+layer+skin+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects.</a> J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).</li>
<li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+function+of+cephalopod+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores.</a> Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).</li>
<li>Florey, E., Kriebel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+mechanical+responses+of+chromatophore+muscle+fibers+of+squid%2C+Loligo+opalescens%2C+to+nerve+stimulation+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Vergl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs.</a> Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).</li>
<li>Williams, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Phenoxazone-Based+Pigments+to+the+Structure+and+Function+of+Nanostructured+Granules+in+Squid+Chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores.</a> Langmuir. , (2016).</li>
<li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ommochrome+pigmentation+of+the+linea+and+rosa+seasonal+forms+of+Precis+coenia+%28Lepidoptera%3A+Nymphalidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae).</a> Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).</li>
<li>Van Den Branden, C., Decleir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+Chromatophore+Pigments+in+the+Skin+of+the+Cephalopod+Sepia+Officinalis%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Biol.+Jb.+Dodonaea%22%5BJournal%5D)">A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis.</a> L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).</li>
<li>Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Jumbo+Squid+Skin+Pigment+Extract+and+its+Antioxidant+Potential+ina+Marine+Oil+System%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).</li>
</ol>

אין לנו מה לחשוף.

אנחנו הוכחנו שיטה לחלץ פיגמנטים מתוך גרגרי כרומטופור דיונון. על ידי מיקוד הגרגרים במיוחד, המטרה שלנו היא לקבוע את תפקידם לתווך צבע אדפטיבית. שיטה זו בשונה מדוחות קודמים נועד לאפיין פיגמנטים סילוניות באמצעות דגימות רקמה בתפזורת 14 או מיובש בהקפאה העור 15. בעוד פרוטוקול זה הוא יעיל לחילוץ פיגמנטים כרומטופור, היא מוגבלת קשקשי תגובה קטנים. ביתור אחד תשואות דיונון ~ 11 מ&quot;ג של גרגרי מטוהרים. ...

<html> דיונונים כגון דיונון, דיונון, תמנון יש את היכולת לשנות את המראה שלהם באופן דינמי עבור הסוואה ואיתות. 1-6 יכולת זו נתמכת בחלקה על ידי ההרחבה האזורית סלקטיבית של איברים פיגמנט המכונים כרומטופור. 4,7-9 כרומטופור הוא ומפעילים רכים המכילים רשת של גרגרי פיגמנט nanostructured הכלוא בתוך sacculus cytoelastic מעוגנים רדיאלית ידי סיבי שריר. 1,3 כפי שהם מופעלים, כרומטופור להרחיב ב -500% ב שטח פנים הציג הפצת גרגרי ברחבי האיברים. 3,7 , 10,11 כאשר פעולה זו מתואמת על פני מספר כרומטופור, הצבעוניות הכללית של החיה משתנית. אמנם ידוע כי גרגרי פיגמנט לתרום לשינוי הצבע הזה, הרכבן נותר עלום. אנו מתארים הליך לבודד ולטהר פיגמנטים כרומטופור אשר עשוי להיות מותאם ללימודי הלחנה בעתיד. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; הבידוד של גרגרי פיגמנט כרוך מיצוי רב שלבים, המגון, הליך טיהור. 3,12 רקמה המכילה כרומטופור נאספה באמצעות כריתה זהירה מן סילוניות. תהליך העיכול ויצירת הומוגניות מכן נעשה שימוש כדי לנתק את הרקמה שמסביב ולהפריד התאים כרומטופור. גרגרי nanostructured אז הם מבודדים מטוהרים מן כרומטופור הנותר באמצעות sonication חוזרת צנטריפוגה. לאחר טיהור, פיגמנטים המחולצים הגרגירים תהליך מותאמת החילוץ של צבע גלוי כנפי הפרפר באמצעות פתרונות מתנול חומצי. 13 במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ו spectrophotometry משמשים כדי לאשר את הפיגמנטים כרומטופור המחולצים בהצלחה באמצעות תהליך זה. שיטה זו מתארת ​​את הבידוד של גרגרי כרומטופור המשמש לחקור את התרומות המולקולריות גoloration ב דיונונים. 12 עקירות מולקולה קטנה מחיות כולו לעתים קרובות יכול להיות תהליך ארוך ומייגע. המטרה כאן היא ליידע חוקרים עתידיים של פרוטוקול יעיל קליל לרכישת פיגמנטים מן הגרגרים nanostructured ב דיונונים.

<table><tbody><tr><td>קולגנאז</td><td>אלפא Aesar</td><td>9001-12-1</td><td>ללא סכנה</td></tr><tr><td>דיתיותרייטול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>3482-12-3</td> מגרה <td>ורעילות חריפה</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>מגרה קל חומצה הידרוכלורית</td><td>EMD כימיקלים</td><td>7647-01-0</td><td>קורוזיבי</td></tr><tr><td>k-אספרטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1115-63-5</td><td>מגיב באלימות עם מחמצנים</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7786-30-3</td> מגרה <td>עיניים קל</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>67-56-1</td> מיני טבליות <td>דליקות במיוחד</td></tr><tr><td>מעכב פרטואז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>469315-90-01</td><td>קורוזיבי למתכת ולעור</td></tr><tr><td>פפאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>9001-73-4</td><td>חומר מגרה &nbsp;</td></tr></tbody></table>

שיטה לחילוץ פיגמנטים מן קלמארי<em&gt; doryteuthis pealeii</em

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

צפלופודים יכולים לעבור שינויים מהירים ואדפטיביים בצבע העור למטרות חישה, תקשורת, הגנה ורבייה. יכולות אלה נתמכות בחלקן על ידי התרחבות ונסיגה של איברים פיגמנטיים הידועים בשם כרומטופורים. בעוד שידוע שהכרומטופורים מכילים רשת קשורה של גרגירים פיגמנטיים, תכונות המבנה-תפקוד שלהם לא פורטו במלואן. אנו מתארים שיטה לבידוד הגרגירים הננו-מובנים בכרומטופורים של דיונון Doryteuthis pealeii ומדגימים כיצד ניתן לחלץ את הפיגמנטים הקשורים אליהם בממיסים חומציים. כדי להשיג זאת, שכבת העור המכילה כרומטופור מבודדת תחילה באופן ידני באמצעות דיסקציה שטחית, וגרגירי הפיגמנט מוסרים באמצעות מחזורי סוניקציה, צנטריפוגה ושטיפה. פיגמנטים הכלואים בתוך הגרגירים המטוהרים מופקים לאחר מכן באמצעות תמיסות מתנול חומציות, ומשאירים ננו-מבנים בקטרים קטנים יותר נטולי צבע גלוי. הליך מיצוי זה מייצר תפוקה של 58% של פיגמנטים מסיסים המבודדים מגרגירים. באמצעות שיטה זו, ניתן לקבוע את הרכב פיגמנטי הכרומטופור ולהשתמש בו כדי לספק תובנה לגבי מנגנון הצביעה האדפטיבית בצפלופודים.

כרומטופור הוא גזור מן ד המעטפת הגבי pealeii (איור 1A, 1B). ברגע שהם מוסרים, כרומטופור הם lysed ו מטוהרים באמצעות מחזורים צנטריפוגה ושטיפת לבודד את גרגרי פיגמנט (איורים 2A, 2B). פתרונות מתנול חומציים (HCl-MeOH) משמשים כדי לחלץ את הפיגמנט מן הגרגירים (איור 2 ג), מניב תמצית פיגמנט מסיס גרגירי חילוץ פיגמנט מסיסים, חסרי צבע. <p class="jove_content"...

פרוטוקול להפקת פיגמנטים מן גרגרי nanostructured ב כרומטופור דיונון Doryteuthis pealeii מוצג.

שיטה לחילוץ פיגמנטים מן קלמארי<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לתאר כיצד להפיק פיגמנטים השוכנים בתוך הגרנולות בעלות המבנה הננוי של כרומטופורים מתוך דיוואטן שחולצו לאחרונה, *Doryteuthis pealeii*. צפירים הם בעלי חיים ימיים מורכבים העוברים שינויים מהירים ואדפטיביים בצבע העור שלהם.עם זאת, עדיין נותר רב שאינו ידוע על אופן פעולתם של מערכות אלו. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא פונה באופן ספציפי לגרנולות בעלות המבנה הננו-מבני באיבר הכרומטופורי. הדבר יאפשר לחוקרים להסביר את המנגנון לשינוי הצבע שראשיתו בקנה מידה ננומטרי.בנוסף לתובנות על ביולוגיה של רכילי-ראש (cephalopods), הדבר עשוי להנחות את התכנון של מערכות סינתטיות שנבנו כדי לחקות את הטווח הדינמי של צבע אדפטיבי המוצג ברכילי-ראש באמצעות ננו-חלקיקים פיגמנטיים מוכנים מראש. בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו מתקשים מכיוון שאיסוף רקמת כרומטופור טהורה הוא מאתגר בשל קרבתה לרקמה הסובבת. השיטה שלנו עברה אופטימיזציה כדי להפחית זיהומים אלו.כדי להתחיל בנתיחה, שפכו תחילה כ-250 milliliters של מי ים מסוננים לתוך תבנית נתיחה. הניחו דגימה בתבנית, ובעזרת מספריים דקים בעלי קצה חד מנירוסטה, גזרו מבסיס הגלימה הבטנית (ventral mantle) לאורך הצד האחורי של בעל החיים, עד לאזור הסנפיר. הוציאו את כל האיברים הפנימיים על ידי הרמה עדינה שלהם בעזרת פינצטה לנתיחה וניתוק הרקמה המחברת באמצעות המספריים.השליכו את האיברים לשקית דגימות. באמצעות סיכות T לדיסקציה, סבכו את המעטפת (mantle) כאשר צד הסנפיר פונה כלפי מעלה אל תוך פד הדיסקציה. בעזרת פינצטה, הסירו בזהירות את שכבת העור האפידרמלית העמומה, תוך שמירה על שלמות שכבת העור המכילה כרומטופורים.השליכו את השכבה האפידרמלית לשק דגימות. לאחר מכן, הסירו את שכבת הכרומטופורים. חתכו את רקמת הכרומטופורים למקטעים קטנים של 1 cm על 1 cm.העבירו את החתכים למבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, כאשר כל מבחנה מלאה עד מחציתה ברקמה שהודחפה. לבסוף, הוסיפו למבחנות 500 מיקרוליטר של מי ים מסוננים. כדי לבודד את גרגירי הפיגמנט, צנטריפוגו תחילה את חתכי רקמת הכרומטופור למשך חמש דקות ב-14,000 x g.שפכו את השכבה העליונה של מי הים. הוסיפו 500 microliters של תמיסת papain collagenase לדגימות וערבבו במכשיר vortex למשך דקה אחת עד שתיים בהגדרה הגבוהה ביותר. לאחר מכן, בצעו סוניקציה לדגימות למשך חמש דקות ב-40 kHz כדי להפריד את התאים מהרקמה שסביבם.סבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות נוספות ב-14, 000 x g ולאחר מכן השליכו את הנוזל העליון. חזרו על הצנטריפוגה פעמיים נוספות, והשליכו את הנוזל העליון בכל פעם. לאחר מכן, הוסיפו את תמיסת השסעון ב-collagenase.השתמשו בפינצטה כדי להסיר ידנית שאריות של חתיכות רקמה גדולות שלא התעכלו לפני ההמשך. טוהר תמיסת הגרנול ההתחלתית משפיע על מיצוי הפיגמנט, ולכן חשוב לוודא שחומרי הכרומטופור ההתחלתיים התעכלו לחלוטין.מצאנו שחתכי רקמה בגודל של כסנטימטר אחד הם האופטימליים לאיסוף של האוכלוסייה הטהורה ביותר של גרנולות. הכינו את בופר ההומוגניזציה על ידי לקיחת מבחנה עם מכסה הברגה בנפח 150 milliliter והוספה של הכמות המתאימה של HEPES, מגנזיום כלוריד, פוטסיום אספרטט ודיתיותרייטול. הוסיפו טבליות מיני מסחרית אחת של מעכב פרוטאוזים.באמצעות משורן, מדוד 100ml של מים דאיוניים והוסף אותם למבחנה המכילה את מלחים להומוגניזציה. ערבב את המבחנה באמצעות וורטקס עד שהתמיסה תהפוך לצלולה. סבב במצנטריפוגה את דגימות הרקמה ולאחר מכן השלך את הנוזל העליון (supernatant).הוסיפו 500 microliters של בופר הומוגניזציה לכל מבחנה וערבבו באמצעות vortex למשך 2 דקות לעירבוב יסודי. בצעו סוניקציה לדגימות למשך 30 דקות ב-40kHz. לאחר מכן, סבבו אותן שוב בצנטריפוגה.לאחר השלכת הנוזל העליון, חזור על הוספת תמיסת ההומוגניזציה, הסוניקציה והצנטריפוגה פעמיים עד שלוש פעמים, כדי להבטיח עיכול מלא של הרקמה החוץ-תאית. לבסוף, השפופרת צריכה להכיל נוזל עליון בצבע צהוב בהיר ומשקע בצבע אדום המורכב מג्रेनולות הפיגמנט המבודדות. השלך את הנוזל העליון.ראשית, הכינו מתנול חומצי למיצוי בתוך מבחנה זכוכית עם פקק הברגה על ידי הוספה של 5ml מתנול ו-25mcL של חומצה כלורית רכזית. סובבו את התמיסה בעדינות כדי לערבב. הניחו בצד מבחנה אחת, זו תהיה טיפול הגרגירים בסוף התגובה.הסיר את תמיסת ההומוגניזציה מבשפור שני המכיל גרנולות. הוסף 500mcL של תמיסת המתנול החומצית לשאר השפורים וערבב במכשיר וורטקס במשך שלוש עד ארבע דקות. בצע סוניקציה לדגימות למשך 10 דקות ב-40kHz ולאחר מכן סבב במערך צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-14000 x g.בעזרת מיקרופיפטה, אספו את העליון (supernatant) לבקבוק זכוכית עם פקק הברגה בנפח של one-dram. זהו הפיגמנט, וצבעו צריך להיות אדום כהה. חזרו על שלבי הוספת המתנול החומצי, הסוניקציה והצנטריפוגציה ארבעה עד חמישה פעמים, תוך איסוף העליון, עד שלא ייחלץ צבע נוסף.המשקע חסר הצבע שנותר הוא הגרנולות שמהן הופק הפיגמנט. כדי להכין דגימות גרנולות להדמיה, ראשית סובבו בצנטריפוגה הן את המנה של הגרנולות שלא הגיבו והן את הגרנולות שמהן הופק הפיגמנט למשך חמש דקות ב-14000 x g, השליכו את הנוזל העליון, ולאחר מכן השעיקו מחדש כל משקע ב-1ml של 95%ethanol. בעזרת פיפט העברה, הניחו 2-3 טיפות מכל תרחיף גרנולות על תושבת אלומיניום נפרדת ל-SEM.הניחו את הדגימות במחליט (desiccator) לייבוש למשך לילה תחת ואקום. בצעו ציפוי בגיש (sputter coating) של התושבות בציפוי זהב-פלטינה למשך 3 דקות כדי להגיע לעובי ציפוי של 15 nanometer. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.בשלב הבא, השתמש בספקטרופוטומטר כדי לאסוף את פרופילי הבליעה של הגרנולות שלא הגיבו, הגרנולות שהוצאו והפיגמנט שהוצא. בצע מדידת Blank עבור דגימות הגרנולות על ידי הוספת 1ml של מים דה-יוניים לקובט נקייה. השלך את ה-Blank למכל פסולת.לאחר מכן, הוסיפו לקובטה את הסספנסיה המכילה את גרגירי הפיגמנט שלא הגיבו. רשמו את ספקטרומי בליעת ה-UV-vis עבור דגימת הגרגירים. בצעו מדידת רקע (blank) שנייה עבור הפיגמנט המופק באמצעות 1mL של מתנול חומצי וקובטה נקייה.לבסוף, ביצעו מדידת ספקטרום בליעה ב-UV vis עבור הפיגמנט ולאחר מכן קבעו את אורך הגל המקסימלי של כל דגימה. מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM) גילתה כי תהליך מיצוי הפיגמנט מפחית את הקוטר הממוצע של הגרגירים. לפני המיצוי, הגרגירים היו בעלי קוטר ממוצע של 527.3nm.לאחר פרוצדורת המטנול החומצי, גודל זה פוחת באופן משמעותי לכ-202.6nm. הפחתה זו נחשבת כתוצאה מחילוץ הפיגמנט. עם הוספת המטנול החומצי, גם הצבע הקשור לגרנואלים שאינם מגיבים פוחת באופן נראה לעין.אישור להשערה זו התקבל באמצעות ספקטרופוטומטריה. גרף זה מראה פרופיל בליעה רחב עבור הגרנולות לפני החילוץ, ופרופיל רחב באופן דומה אך בעוצמה נמוכה יותר עבור הגרנולות לאחר החילוץ. לעומת זאת, הפיגמנט המומס שחולץ מציג lambda max בסביבות 500nm וכתף מובחנת בסביבות 380nm.בסך הכל, נתונים אלו מצביעים על הפקה מוצלחת של צבע נראה מהגרנולות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך כארבע שעות מההתחלה ועד הסוף. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להסיר לחלוטין את הרקמה המכילה פלטלטית חלבוניות מחזירות אור, העלולות להפריע להפקה ולניתוח.רקמה אפידרמלית עשויה להפריע גם לשלבי ההומוגניזציה ולחילוץ הפיגמנטים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון כרומטוגרפיה בשכבה דקה ומספקטרומטריית מסות, כדי לטהר את הפיגמנטים באופן נוסף ולאפיין את הרכבם. שלבים אלו יכולים לסייע בהבהרה של התרומות המולקולריות לצבעוניות בצפודים.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח עבור ביולוגים ימיים, כימיקאים ומהנדסים, כולל: מהו הרכב הפיגמנטים המשמשים במהלך שינוי הצבע? וכיצד הם תורמים לתפקוד ולמבנה של הגרנולות בעלות המבנה הננומטרי בתוך איברי הכרומטופורים בעור? לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן מיצוי הפיגמנט מכרומטופורים של דיווני *Doryteuthis pealeii* שנושלו זה עתה.

a-method-for-extracting-pigments-from-squid-doryteuthis-pealeii

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה יהיה להדגים כיצד להשיג hemocytes (כדוריות דם) של הוואי bobtail...

קבלת Hemocytes מן הוואי Bobtail קלמארי Euprymna scolopes והתבוננות דבקותם חיידקים סימביוטיים שאינן הסימביוטי

פרוטוקול זה מפרט את הבנייה מחדש של קומפלקסים לקצירת אור במבחנה. חלבוני הממברנה האינטגרליים הללו מתאמים כלורופיל וקרוטנואידים ואחראים לקצירת אור בצמחים גבוהים יותר ובאצות ירוקות.

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לטיהור שברי המקטע החיצוני של קולטני האור (POS) באמצעות אולטרה-צנטריפוגה מרשתית חזיר/בקר באמצעות הומוגניזציה וצנטריפוגה של שיפוע סוכרוז. פרוטוקול זה מאפשר הכנת מלאי גדול של ציטוטי קופה, מסומנים או לא מסומנים, שניתן לאחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

טיהור בקנה מידה גדולה של מגזרי בשר חזירים או שור קולטי אור חיצוני למבחני phagocytosis על תאי הרשתית פיגמנט אפיתל

המבדק זה מעסיק דגים טורפים מודל כדי להעריך את הנוכחות של מטבוליטים האכלה-הרתעה מתמציות אורגניות של הרקמות של יצורים ימיים בריכוזים טבעיים באמצעות מטריצת מזון דומה מבחינה תזונתית.

מעבדה מבדק-האכלת דגים לבחינת פעילות Antipredatory של משני מטבוליטים מהרקמות של אורגניזמים ימיים

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה תפוקה גבוהה להרכבת חלבונים מסיסים במים עם פיגמנטים הידרופובי אשר מבוססים על אמולסיות מים-in-שמן. אנו מדגימים את היעילות של השיטה באסיפה של כלורופיל ילידים עם ארבע וריאציות של מסיס-מים כלורופיל רקומביננטי מחייבים חלבונים (WSCPs) של צמחי Brassica לידי ביטוי E. coli.

המים אמולסיות שמן: מערכת חדשה להרכבת חלבונים מסיסים במים כלורופיל מחייב עם פיגמנטים הידרופובי

עבודה זו מציגה שיטה במהירות ובמדויק לכמת את הפיגמנטציה הבטן של תסיסנית melanogaster באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלית. שיטה זו מייעלת את ההליכים בין רכישת פנוטיפ וניתוח נתונים וכולל הדגימה הרכבה, רכישת תמונה, מיצוי ערך פיקסל, ומדידה תכונה.

כימות פיגמנטציה בטן ב<em&gt; תסיסנית מלנוגאסטר</em

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד fucoxanthin כלורופיל a/c מחייב חלבונים (FCP) מ- diatoms ועד לשלב אותם בתוך ליפוזומים עם יצירות השומנים טבעית ללמוד עירור העברת אנרגיה על שינויים בהרכב יון.

בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות Cyclotella Meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד

Doliolids, כולל את המינים דולילטה gegenbauri, הם קטנים זואופלנקטון הג ימית של משמעות אקולוגית המצויים על מערכות משנה יצרנית המדף ברחבי העולם. הקושי של התקשות האורגניזמים העדינים האלה מגביל את החקירה שלהם. במחקר זה אנו מתארים גישות טיפוח לאיסוף, גידול ושמירה על הdoliolid דולילטה gegenbauri.

הטיפוח-תרגול של החיל הימי ( uljanin 1884) למחקרים ניסיוניים

רגולטורים של פונקציות מלנוציטים שולטים בהבדלים גלויים בתוצאות הפיגמנטציה. פענוח הפונקציה המולקולרית של גן הפיגמנטציה המועמד מציב אתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש במערכת מודל דגי זברה כדי לזהות מועמדים ולסווג אותם לווסתים של תכולת המלנין ומספר המלנוציטים.

גישה גנטית הפוכה לזיהוי מווסתי פיגמנטציה באמצעות דגי זברה

אנו מציגים פרוטוקול לאפיון אלקטרופיזיולוגי של פוטופיגמנטים דו-יציבים: (1) ניצול תזוזות המטען בתוך מולקולות הפוטוגמנט בעקבות בליעת הפוטונים וכמותם העצומה בפוטורצפטורים, ו-(2) ניצול הבדלי הספיגה-ספקטרום של מצבי הפוטוגמנט של רודופסין ומטרהודופסין. פרוטוקולים אלה שימושיים לסינון מוטציות המשפיעות על מערכות פוטופיגמנט דו-יציבותיות.

שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בדרוזופילה פוטורצפטורים

במאמר זה אנו מתארים מספר פרוטוקולים המכוונים להערכה משולבת של Gracilaria gracilis: קציר מיני בר, גידול פנימי ומיצוי של מרכיבים ביו-אקטיביים. ההשפעות נוגדות החמצון, האנטי-מיקרוביאליות והציטוטוקסיות של התמציות נבדקות, יחד עם הערכה תזונתית ויציבותית של מזון מועשר בביומסה ופיגמנטים של אצות שלמות.

הערכה של אצה אדומה Gracilaria gracilis באמצעות גישה של זיקוק ביולוגי

למד שיטה לחילוץ פיגמנטים מגרגירי כרומטופורים ננו-מובנים בקלמארי Doryteuthis pealeii. הטכניקה מאפשרת חקירת מנגנוני שינוי הצבע המהירים בראשוניים ותרומה להבנת הסתגלות צבעונית ימית.

שיטה לחילוץ פיגמנטים מן קלמארי

גלה סרטונים נוספים