טכניקה אינפוזיה Microsurgery עכבר למשלוח ואלכוהול ממוקד לתוך מערכת העצבים המרכזית דרך עורק התרדמה הפנימי
31 בינואר 2017
הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת עירוי מיקרו-כירורגית של עכבר, המעבירה ביעילות חומרים ישירות למוח דרך עורק הצוואר הפנימי.
המטרה הכוללת של טכניקה כירורגית זו היא להעביר חומרים אקסוגניים למוח העכבר מבלי לחדור לגולגולת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח בנוגע לפעולה של תרופות, פתוגנים ואקסוזומים במוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא גורמת לטראומה מינימלית לבעל החיים, שומרת על שלמות הרשת העצבית ומשיגה ריכוזים גבוהים של החומר במוח.
התחל במתן איזופלורן מעורבב עם חמצן כדי להרדים את העכבר בתא אינדוקציה. לאחר השראת הרדמה, העבירו את החיה למשטח הניתוח תחת מיקרוסקופ סטריאו, והניחו את חרוט האף כדי לשמור על מישור הרדמה כירורגי. ודא שקצב הנשימה הוא סביב נשימה אחת עד שתיים בשנייה מבלי להתנשף.
בנוסף, ודא שהחיה אינה מגיבה לגירוי שפם או צביטה בבוהן. השתמש במקלון סטרילי כדי למרוח טיפה של חומר סיכה עיניים על כל עין כדי למנוע יובש. לאחר גילוח אתר הניתוח עם סכין גילוח, הכינו את האזור עם 70% אתנול וכלורהקסידין.
תוך כדי הסתכלות דרך מיקרוסקופ הסטריאו, השתמש במספריים ובמלקחיים כירורגיים כדי ליצור חתך בקו האמצע בצוואר מעל עצם החזה ועד מתחת ללסת. השתמש במלקחיים כדי להפריד בזהירות רקמת שומן ורקמת חיבור כדי לחשוף את קנה הנשימה. לאחר מכן הניחו חפץ רך ועגול בקוטר של כחמישה סנטימטרים מתחת לחלק האחורי של הצוואר כדי להאריך את הצוואר ולחשוף עוד יותר את האזור.
לאחר מכן, הפרד את הרקמה סביב קנה הנשימה באמצעות ווים או מפסק רקמות. בצד שמאל של קנה הנשימה, יש להפריד בזהירות את רקמת החיבור כדי לחשוף את עורק הצוואר המשותף השמאלי, או CCA. בעזרת מלקחיים, הסר בזהירות את כל רקמת החיבור כדי לחשוף את התפצלות ה-CCA בתחילת עורקי הצוואר החיצוניים והפנימיים כאחד.
לאחר חשיפת ה-ECA וה-ICA, השתמש במלקחיים כדי להניח קטע של תפר ניילון בגודל סנטימטר אחד מתחת לעורק הצוואר החיצוני. לאחר מכן הניחו קטע שני של סנטימטר אחד. לאחר מכן קשרו קשר קבוע בנקודה הגבוהה ביותר האפשרית של ה-ECA.
בנקודה הנמוכה ביותר האפשרית של ה-ECA, מיד מעל התפצלות ה-CCA, קשרו קשר רופף יותר ונשלף. לאחר מכן השתמש בקליפסים של כלי כדי לסגור את ה-CCA בנקודה הנמוכה ביותר האפשרית, ולסגור את ה-ICA. סגירה נכונה של עורק הצוואר הפנימי לפני ביצוע חתך קטן בעורק הצוואר החיצוני תמנע דימום.
כעת, בעזרת מספריים קפיציים של מיקרו-דיסקציה, בצע חתך של שני מילימטר ב- ECA בין שני הקשרים. חשוב לשמור על חתכים קטנים, שכן חתך גדול יגרום להחדרת החומר. הרכיבו את מערכת העירוי על ידי הצמדת שישה סנטימטרים של צינורות נימיים למזרק טוברקולין המכיל 250 מיקרוליטר של החומר שיש להחדיר.
לאחר מכן הכנס בעדינות את קצה הצינור הנימי לתוך החתך ב-ECA. המשך לקדם את הקצה עד שהוא מגיע לאמצע הדרך בין ההסתעפות לקליפס ב-CCA. קשרו את קשר ה-ECA התחתון.
ודא שהקשר רופף מספיק כדי לאפשר נזילות נימית, והדוק מספיק כדי למנוע דליפה. לאחר מכן, הסר את הקליפ מה-ICA. הפעל בעדינות לחץ על בוכנת המזרק, ואפשר עירוי חומר במהירות של כ-10 מיקרוליטר לשנייה.
לאחר עירוי חומר הבדיקה, הנח את הקליפ בחזרה על ה-ICA. הסר בעדינות את הצינור הנימים. לאחר מכן, קשרו את קשר ה-ECA התחתון לחלוטין.
הסר את המהדק מה-ICA ומה-CCA. לאחר מכן הסר את המחזיר או ווי הרקמה והכרית. נקה את האזור המיועד לתפירה במי מלח סטריליים, ולאחר מכן סגור את החתך באמצעות תפרי ניילון.
לאחר מתן חומר אנטי דלקתי ומשכך כאבים מאושר כדי להקל על אי הנוחות לאחר הניתוח, הניחו את בעל החיים בכלוב על כרית חימום למשך שעה לפחות, ועקבו אחר ההתאוששות. היסטוגרמה זו מדגימה זיהוי HIV על ידי PCR בזמן אמת שבעה ימים לאחר עירוי הנגיף דרך עורק הצוואר הפנימי השמאלי. כצפוי, רמות הנגיף גבוהות יותר בהמיספרה השמאלית.
תמונה אימונופלואורסצנטית זו מציגה קטע מוח של עכבר המתאר תג GFP CD63, סמן אקסוזום, לאחר עירוי שלפוחית חוץ-תאית דרך עורק הצוואר הפנימי. ה-CD63 המבטא שלפוחיות חוץ-תאיות, המוצגות בירוק, קשורות למיקרו-כלי הדם במוח העכבר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 20 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחלות הנוירודגנרטיביות לחקור אינטראקציות בין תרופות, פתוגנים ואקסוזומים בעכברים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר טכניקת עירוי במיקרו-כירורגיה בעכברים המאפשרת הזרקה של חומרים ישירות אל המוח באמצעות העורק הקרוטידי הפנימי. טכניקה זו ממזערת את הטראומה ושומרת על שלמות הנוירונים, תוך השגת ריכוזי חומרים גבוהים במוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מיקרוכירורגיה
- החדרת חומרים
רקע
- הבנת פעולת תרופות במוח.
- חקירת ההשפעות של פתוגנים ואקסוזומים.
- מזעור טראומות לבעלי חיים במהלך ניסויים.
- שמירה על שלמות הרשת הנוירונלית.
מטרת המחקר
- להחדרת חומרים אקסוגניים ללא חדירה לגולגולת.
- לסיוע במחקרים בתחום מדעי המוח.
- להשגת ריכוזים גבוהים של חומרים במוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מתן איסופלורן מעורבב עם חמצן לצורך הרדמה.
- העברת העכבר למשטח ניתוח תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- הנחת קונו לאף לשמירה על ההרדמה.
- ניטור קצב הנשימה במהלך הפרוצדורה.
תוצאות עיקריות
- החדרה מוצלחת של חומרים לתוך מוח העכבר.
- טראומה מינימלית לבעל החיים.
- שימור של שלמות הרשת הנוירונלית.
- השגת ריכוזים גבוהים של חומרים במוח.
מסקנות
- טכניקה זו יעילה לחקר תפקודי המוח.
- היא מציעה חלופה פחות פולשנית לשיטות המסורתיות.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול בדיקות תרופות ומודלים של מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
הגעה ממוקדת למערכת העצבים המרכזית (CNS) נותרת אתגר קריטי בגילוי טיפולים נוירו-תרפויטיים, וזאת בשל מחסום הדם-מוח וחשיפה סיסטמית שאינה ממוקדת. טכניקה זו להזרקה מיקרו-כירורגית מאפשרת הובלה מדויקת בריכוז גבוה של חומרי בדיקה ישירות למוח העכבר, ובכך היא תומכת בהורדת סיכונים מכניסטיים ובדיוק של מודלים תרגומיים. הפולשניות המינימלית שלה והשימור של השלמות הנוירונלית הופכים אותה לרלוונטית ביותר לתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ולמחקר פרה-קליני של מערכת העצבים המרכזית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטי
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי עקיפת מחסומים סיסטמיים.
- תומך במחקרים מכניסטיים של פעולת תרופות, פתוגנים או אקסוזומים ברקמת המוח.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות תוך מזעור טראומה מבלבלת.
- משפר את הביטחון החזוי עבור פורטפולים המכוונים למערכת העצבים המרכזית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מודלים מאושרים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) in vivo עבור בדיקות פרמקודינמיות או בדיקות סמנים ביולוגים בהמשך.
- מבטיח הובלה מקומית הניתנת לשחזור למדידה כמותית של התוצאות.
- מפחית שונות בהשוואה לנתיבי הזרקה סיסטמיים.
- מאפשר הערכה אמינה של חדירת התרכובת למח וחשיפת השפעתה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הרלוונטיים למחלה עבור מחקרי ביומרקרים תרגומיים.
- שומר על רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות שימור רשתות נוירונליות.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של מועמדים המכוונים למערכת העצבים המרכזית.
- מספק פלטפורמה לחקר מנגנונים של מחלות זיהומיות וניו روندגנרטיביות של מערכת העצבים המרכזית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
טכניקת עירוי זו מתאימה לממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני של מערכת העצבים המרכזית (CNS), ומאפשרת הזרקה ישירה של חומרים לצורך מחקרי מנגנונים ותיקוף מטרות לפני אופטימיזציה של תרופות מובילות (lead optimization).
- ביולוגיה גילויית: תומך בבדיקת השערות לגבי פעולת תרופות במערכת העצבים המרכזית (CNS) ומעורבות של מסלולים ביולוגיים.
- סינון (Screening): מספק חשיפה כמותית וניתנת לשחזור של ה-CNS לצורך פיתוח בדיקות (assays).
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של התפלגות ספציפית למוח והשפעות מולקולריות.
- מחקר טרנסלציונלי: מסייע בהתאמה למודלים של CNS וסממנים ביולוגיים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מספק פלטפורמה סטנדרטית למסירת חומרים למערכת העצבים המרכזית עם מינימום טראומה עבור תוכניות מו"פ מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי CNS.
- ערך תפעולי: מסנכרן את ההגשה ל-CNS עם הדירות גבוהה וטראומה מינימלית לבעלי החיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקה (go/no-go) של נכסים המכוונים ל-CNS ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תוכניות CNS מותאם סיכון, המבוסס על נתוני in vivo חסונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות והכשרה במיקרו-כירורגיה לצורך ביצוע עקבי.
- דורש גישה לסטריאומיקרוסקופיה ולמכשור עירוי מדויק.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין הצוותים לצורך הדירות (reproducibility).
- עשוי לדרוש התאמה למודלים שונים של בעלי חיים או לאזורים שונים ב-CNS.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות את עקומת הלמידה הטכנית ואת משך הפרוצדורה.
