תצפית כימות התנהגות החיזור של נמטודות פיינווד, Bursaphelenchus xylophilus

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן בהתנהגות ההזדווגות של נמטודת עץ האורן, Bursaphelenchus xylophilus. שיטה זו יכולה לסייע בקידום מחקרים פסיכולוגיים של הנמטודה. הוא עוסק באופן ספציפי בשמירה על התנהגות ההזדווגות של נמטודת עץ האורן.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג בוגרים בתולים, מה שמקל בהרבה על התבוננות בהתנהגות הזדווגות של מבוגרים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות אך ורק לכיוון המחקר הרחב יותר של נמטודות, מכיוון שיש להן התנהגויות מחזורי חיים דומות. שכן הדגמת שיטה זו היא קריטית, מכיוון שרכישת נמטודות בוגרות בתוליות היא קשה מכיוון שמגבלות של נמטודות התפתחותיות דורשות תרגול ולא קל להבחין במדויק בין זכרים לנקבות בשלב מוקדם של צעירים.

כדי לגדל נמטודות מעץ אורן, הכינו תחילה צלחות אגר דקסטרוז תפוחי אדמה. כדי לחסן צלחת, אגרוף חתיכת מחצלת פטרייתית בקוטר 10 מילימטרים ממחצלת betritus senaria, והניח אותה באמצע צלחת PDA חדשה. תרבית את מחצלת הפטרייה במשך חמישה ימים בחום של 25 מעלות צלזיוס בחושך.

לאחר חמישה ימים, הוסיפו את נמטודות עץ האורן לצלחת הפטרי המוכנה ותרבו אותן במשך שלושה ימים בחום של 25 מעלות צלזיוס בחושך. כדי לבודד את הנמטודות מהפטרייה, הכינו תחילה כלי איסוף. הנח צינור גומי מהודק מתחת למשפך, והחזק את המשפך המוכן במתלה כדי להרכיב את מנגנון משפך ברמן.

לאחר מכן, הניחו שתי שכבות של נייר פילטר במקום גזה בפתח המשפך. כעת, העבירו את תרביות הפטרייה למערך המשפך והוסיפו מים עד שמחצלת הפטרייה טובלת. לאחר שעתיים, הנמטודות ייצאו מתרבית הפטרייה, יחצו את נייר הסינון ויתמקמו בחלק התחתון של משפך ברמן.

אוספים את הנמטודות על ידי הנחת צינור של 15 מיליליטר מתחת למשפך, ואז משחררים לאט את המהדק כדי לאסוף כמה טיפות מים, שיכילו את הנמטודות. צנטריפוגה אוספי הנמטודות ב -3, 000 גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש להוציא את מפלס המים העליון, ולהשעות מחדש את התולעים במיליליטר אחד של מים.

העבירו את המתלים של הנמטודות לצלחת זכוכית של שישה סנטימטרים, והוסיפו שלושה מיליליטר מים כדי לסייע לנמטודות לשחות בחופשיות. כעת, אספו ביצים כדי להכין צירים בתוליים. מעבירים את המנה לחממה כהה, ונותנים לנקבות ההרות להטיל ביצים למשך 10 דקות.

בגלל משטח הגליקופרוטאין שלהן, הביצים יידבקו לכוס. לאחר מכן, הסר את המים עם התולעים בזהירות כדי למנוע הפרעה לביצים שנדבקו למנה. לאחר מכן, הוסיפו במהירות 3 מיליליטר מים לתבשיל כדי למנוע מהביצים להתייבש.

חזור על תהליך זה של ניקוי ביצים לפחות שלוש פעמים, כדי להסיר את כל הזחלים והבוגרים ולקבל את הביצים הטהורות. לאוסף הביצים הטהורות השטופות, הוסיפו חמישה מיליליטר מים, והמשיכו בפיתוח הביצים בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. 24 שעות לאחר תחילת תרבית הביצים, אספו את זחלי J2 שבקעו.

העבירו בזהירות את זחלי J2 לצינור של 15 מיליליטר. ואז צנטריפוגה את האוסף ב -3, 000 גרם למשך שתי דקות. יש להוציא את שכבת המים העליונה ולהוסיף בחזרה 200 מיקרוליטר מים.

לאחר מכן, תרבית את זחלי J2 על צלחת PDA שהוכנה עם מחצלת פטריות. לאחר 52 שעות, רוב זחלי J2 יתפתחו לזחלי J4 בשלב מוקדם. הרכיבו משפך ברמן, וחלצו את הנמטודות מתרביות הפטרייה למשך שעתיים, כפי שתואר קודם לכן.

בזמן ההמתנה, הכינו מחט כדי לקטוף את התולעים. צייר קצה מנימי זכוכית המחוממים מעל מבער אלכוהול. הקצה צריך להיות בקוטר של כ-50 מיקרון, בערך רוחב הגוף של נמטודה בוגרת.

לאחר שעתיים, העבירו את זחלי J4 לצלחת פטרי נקייה כפי שתואר קודם לכן. עכשיו, סקסו את הנמטודות תחת מיקרוסקופ סטריאו. כשני שלישים מהזחלים הם בדרך כלל נקבות.

הפות של הנקבה שונה כמובן מהאנטומיה של הזכר, אך מכיוון שהתולעים פעילות מאוד, המין ידרוש תרגול. הצעד הקריטי ביותר לפרוטוקול זה, הוא להבחין ולהפריד במדויק בין זכרים לנקבות בשלב הראשון המוקדם. אחרת, יהיו מעורבים ורעים, ברגע שהם יהפכו למבוגרים.

וזה מקשה על התבוננות בהזדווגות. בהדרגה, קוטפים ומעבירים את התולעים לטיפת מים על מגלשה לזכרים או לנקבות. כדי להבטיח הצלחה, שני אנשים שונים צריכים לבדוק שוב את הקצאת המין.

כעת, העבירו את טיפת המים המכילה את התולעים המיניות לצלחת תרבית פטרייתית מתאימה. לאחר מכן, תרבו את הבתולות במשך 24 שעות נוספות לפני שתלמדו את התנהגות ההזדווגות שלהן. כדי לצפות בהתנהגות הזדווגות של נמטודות עץ אורן, הכינו תחילה מספר מגלשות קעורות על ידי הוספת 200 מיקרוליטר מים לכל אחת מהבארות שלהם.

לאחר מכן, בחר בוגר בתול מוכן יחיד והעביר אותו לשקופית מוכנה. שמור את הבוגרים הבתולים בתוך הבאר למשך שעה כדי לאפשר להם להסתגל לסביבה המימית החדשה. לאחר שעה מוסיפים לבאר מבוגר בתול יחיד מהמין השני, בעזרת פיפטה.

לאחר מכן, התבונן בהתנהגות ההזדווגות תחת מיקרוסקופ סטריאו, וצלם את ההתנהגות לניתוח כמותי. כל תהליך ההזדווגות מסתיים בדרך כלל תוך שעתיים. כל 30 דקות מוסיפים 50 מיקרוליטר מים כדי לפצות על האידוי.

כדי לחקור את בחירת ההזדווגות והתחרות הבין-מינית, קבצו והתבוננו בנמטודות בתוליות משני שילובים שונים. שיעור הצלחת ההזדווגות של בוגרים בתולים היה כ-87%, שהיה גבוה בהרבה מזה של הבוגרים שנבחרו באופן אקראי. לזוגות לקח בממוצע 83 דקות להשלים את כל תהליך ההזדווגות, המכיל ארבעה שלבים שונים.

חיפוש, יצירת קשר, הזדווגות והשתהות. בתוך שלבים אלה ניתן להבחין בדפוסי התנהגות ספציפיים רבים. כאשר נקבה אחת פגשה כמה זכרים, הייתה בחירה ברורה להזדווגות.

הנקבה בדרך כלל משתמשת בראשה כדי ליצור קשר עם זכר אחד, בדרך כלל בראש, בגוף, בזנב ובאזור איברי המין. לאחר מכן הנקבה הזדווגה עם הזכר, או עזבה אותו במהירות, ושחתה לזכר אחר. שיעורי הצלחת ההזדווגות נמדדו לאחר המגע הראשון עבור שילובי הנמטודות השונים.

התרחשה גם תחרות בין-מינית. כאשר נקבה בתולה אחת התערבבה עם שלושה זכרים בתולים, הזכרים ניסו להתקרב וליצור קשר עם הנקבה ככל האפשר, כדי לקבל את הסיכוי להזדווג איתה. כאשר הפות היה תפוס, הזכרים האחרים ניסו להפריע לתהליך ההזדווגות באמצעות נדנודי גוף אלימים, או גרירה כדי להפריד ביניהם.

תחרות בין-מינית נשית נראתה פחות או יותר דומה לתחרות בין-מינית גברית. בגלל התחרות הבין-מינית, תדירות ההזדווגות עם השילובים השונים הייתה שונה באופן משמעותי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחקר האקולוגיה ההתנהגותית בנמטודות.

לאחר השליטה, ניתן להשלים הליך זה תוך 12 יום, אם הוא מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להפריד במדויק בין זכרים לנקבות, הצעירים בשלבים המוקדמים כדי להשיג בוגרים בתולים.