תצפית כימות התנהגות החיזור של נמטודות פיינווד, Bursaphelenchus xylophilus
25 בדצמבר 2016
מוצג פרוטוקול לחקירת התנהגות ההזדווגות של נמטודת עץ האורן, Bursaphelenchus xylophilus. מאפיינים התנהגותיים של B. xylophilus מתוארים בתהליך ההזדווגות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן בהתנהגות ההזדווגות של נמטודת עץ האורן, Bursaphelenchus xylophilus. שיטה זו יכולה לסייע בקידום מחקרים פסיכולוגיים של הנמטודה. הוא עוסק באופן ספציפי בשמירה על התנהגות ההזדווגות של נמטודת עץ האורן.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג בוגרים בתולים, מה שמקל בהרבה על התבוננות בהתנהגות הזדווגות של מבוגרים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות אך ורק לכיוון המחקר הרחב יותר של נמטודות, מכיוון שיש להן התנהגויות מחזורי חיים דומות. שכן הדגמת שיטה זו היא קריטית, מכיוון שרכישת נמטודות בוגרות בתוליות היא קשה מכיוון שמגבלות של נמטודות התפתחותיות דורשות תרגול ולא קל להבחין במדויק בין זכרים לנקבות בשלב מוקדם של צעירים.
כדי לגדל נמטודות מעץ אורן, הכינו תחילה צלחות אגר דקסטרוז תפוחי אדמה. כדי לחסן צלחת, אגרוף חתיכת מחצלת פטרייתית בקוטר 10 מילימטרים ממחצלת betritus senaria, והניח אותה באמצע צלחת PDA חדשה. תרבית את מחצלת הפטרייה במשך חמישה ימים בחום של 25 מעלות צלזיוס בחושך.
לאחר חמישה ימים, הוסיפו את נמטודות עץ האורן לצלחת הפטרי המוכנה ותרבו אותן במשך שלושה ימים בחום של 25 מעלות צלזיוס בחושך. כדי לבודד את הנמטודות מהפטרייה, הכינו תחילה כלי איסוף. הנח צינור גומי מהודק מתחת למשפך, והחזק את המשפך המוכן במתלה כדי להרכיב את מנגנון משפך ברמן.
לאחר מכן, הניחו שתי שכבות של נייר פילטר במקום גזה בפתח המשפך. כעת, העבירו את תרביות הפטרייה למערך המשפך והוסיפו מים עד שמחצלת הפטרייה טובלת. לאחר שעתיים, הנמטודות ייצאו מתרבית הפטרייה, יחצו את נייר הסינון ויתמקמו בחלק התחתון של משפך ברמן.
אוספים את הנמטודות על ידי הנחת צינור של 15 מיליליטר מתחת למשפך, ואז משחררים לאט את המהדק כדי לאסוף כמה טיפות מים, שיכילו את הנמטודות. צנטריפוגה אוספי הנמטודות ב -3, 000 גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש להוציא את מפלס המים העליון, ולהשעות מחדש את התולעים במיליליטר אחד של מים.
העבירו את המתלים של הנמטודות לצלחת זכוכית של שישה סנטימטרים, והוסיפו שלושה מיליליטר מים כדי לסייע לנמטודות לשחות בחופשיות. כעת, אספו ביצים כדי להכין צירים בתוליים. מעבירים את המנה לחממה כהה, ונותנים לנקבות ההרות להטיל ביצים למשך 10 דקות.
בגלל משטח הגליקופרוטאין שלהן, הביצים יידבקו לכוס. לאחר מכן, הסר את המים עם התולעים בזהירות כדי למנוע הפרעה לביצים שנדבקו למנה. לאחר מכן, הוסיפו במהירות 3 מיליליטר מים לתבשיל כדי למנוע מהביצים להתייבש.
חזור על תהליך זה של ניקוי ביצים לפחות שלוש פעמים, כדי להסיר את כל הזחלים והבוגרים ולקבל את הביצים הטהורות. לאוסף הביצים הטהורות השטופות, הוסיפו חמישה מיליליטר מים, והמשיכו בפיתוח הביצים בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. 24 שעות לאחר תחילת תרבית הביצים, אספו את זחלי J2 שבקעו.
העבירו בזהירות את זחלי J2 לצינור של 15 מיליליטר. ואז צנטריפוגה את האוסף ב -3, 000 גרם למשך שתי דקות. יש להוציא את שכבת המים העליונה ולהוסיף בחזרה 200 מיקרוליטר מים.
לאחר מכן, תרבית את זחלי J2 על צלחת PDA שהוכנה עם מחצלת פטריות. לאחר 52 שעות, רוב זחלי J2 יתפתחו לזחלי J4 בשלב מוקדם. הרכיבו משפך ברמן, וחלצו את הנמטודות מתרביות הפטרייה למשך שעתיים, כפי שתואר קודם לכן.
בזמן ההמתנה, הכינו מחט כדי לקטוף את התולעים. צייר קצה מנימי זכוכית המחוממים מעל מבער אלכוהול. הקצה צריך להיות בקוטר של כ-50 מיקרון, בערך רוחב הגוף של נמטודה בוגרת.
לאחר שעתיים, העבירו את זחלי J4 לצלחת פטרי נקייה כפי שתואר קודם לכן. עכשיו, סקסו את הנמטודות תחת מיקרוסקופ סטריאו. כשני שלישים מהזחלים הם בדרך כלל נקבות.
הפות של הנקבה שונה כמובן מהאנטומיה של הזכר, אך מכיוון שהתולעים פעילות מאוד, המין ידרוש תרגול. הצעד הקריטי ביותר לפרוטוקול זה, הוא להבחין ולהפריד במדויק בין זכרים לנקבות בשלב הראשון המוקדם. אחרת, יהיו מעורבים ורעים, ברגע שהם יהפכו למבוגרים.
וזה מקשה על התבוננות בהזדווגות. בהדרגה, קוטפים ומעבירים את התולעים לטיפת מים על מגלשה לזכרים או לנקבות. כדי להבטיח הצלחה, שני אנשים שונים צריכים לבדוק שוב את הקצאת המין.
כעת, העבירו את טיפת המים המכילה את התולעים המיניות לצלחת תרבית פטרייתית מתאימה. לאחר מכן, תרבו את הבתולות במשך 24 שעות נוספות לפני שתלמדו את התנהגות ההזדווגות שלהן. כדי לצפות בהתנהגות הזדווגות של נמטודות עץ אורן, הכינו תחילה מספר מגלשות קעורות על ידי הוספת 200 מיקרוליטר מים לכל אחת מהבארות שלהם.
לאחר מכן, בחר בוגר בתול מוכן יחיד והעביר אותו לשקופית מוכנה. שמור את הבוגרים הבתולים בתוך הבאר למשך שעה כדי לאפשר להם להסתגל לסביבה המימית החדשה. לאחר שעה מוסיפים לבאר מבוגר בתול יחיד מהמין השני, בעזרת פיפטה.
לאחר מכן, התבונן בהתנהגות ההזדווגות תחת מיקרוסקופ סטריאו, וצלם את ההתנהגות לניתוח כמותי. כל תהליך ההזדווגות מסתיים בדרך כלל תוך שעתיים. כל 30 דקות מוסיפים 50 מיקרוליטר מים כדי לפצות על האידוי.
כדי לחקור את בחירת ההזדווגות והתחרות הבין-מינית, קבצו והתבוננו בנמטודות בתוליות משני שילובים שונים. שיעור הצלחת ההזדווגות של בוגרים בתולים היה כ-87%, שהיה גבוה בהרבה מזה של הבוגרים שנבחרו באופן אקראי. לזוגות לקח בממוצע 83 דקות להשלים את כל תהליך ההזדווגות, המכיל ארבעה שלבים שונים.
חיפוש, יצירת קשר, הזדווגות והשתהות. בתוך שלבים אלה ניתן להבחין בדפוסי התנהגות ספציפיים רבים. כאשר נקבה אחת פגשה כמה זכרים, הייתה בחירה ברורה להזדווגות.
הנקבה בדרך כלל משתמשת בראשה כדי ליצור קשר עם זכר אחד, בדרך כלל בראש, בגוף, בזנב ובאזור איברי המין. לאחר מכן הנקבה הזדווגה עם הזכר, או עזבה אותו במהירות, ושחתה לזכר אחר. שיעורי הצלחת ההזדווגות נמדדו לאחר המגע הראשון עבור שילובי הנמטודות השונים.
התרחשה גם תחרות בין-מינית. כאשר נקבה בתולה אחת התערבבה עם שלושה זכרים בתולים, הזכרים ניסו להתקרב וליצור קשר עם הנקבה ככל האפשר, כדי לקבל את הסיכוי להזדווג איתה. כאשר הפות היה תפוס, הזכרים האחרים ניסו להפריע לתהליך ההזדווגות באמצעות נדנודי גוף אלימים, או גרירה כדי להפריד ביניהם.
תחרות בין-מינית נשית נראתה פחות או יותר דומה לתחרות בין-מינית גברית. בגלל התחרות הבין-מינית, תדירות ההזדווגות עם השילובים השונים הייתה שונה באופן משמעותי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחקר האקולוגיה ההתנהגותית בנמטודות.
לאחר השליטה, ניתן להשלים הליך זה תוך 12 יום, אם הוא מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להפריד במדויק בין זכרים לנקבות, הצעירים בשלבים המוקדמים כדי להשיג בוגרים בתולים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לצפייה בהתנהגות ההזדווגות של הנמטודה של עץ האורן, Bursaphelenchus xylophilus. השיטה מתמקדת ברכישת בוגרים בתולים כדי להקל על המחקר של התנהגויות ההזדווגות.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- ביולוגיה התנהגותית
- נמטולוגיה
רקע
- Bursaphelenchus xylophilus הוא מין נמטודה משמעותי.
- הבנת התנהגות ההזדווגות שלו יכולה לספק תובנות לגבי מחזורי החיים של הנמטודות.
- רכישת בוגרים בתולים חיונית לצפייה מדויקת.
- ההבחנה בין נמטודות זכר ונקבה יכולה להיות מאתגרת.
מטרת המחקר
- לצפות בהתנהגות ההזדווגות של Bursaphelenchus xylophilus.
- לקדם מחקרים פסיכולוגיים הקשורים לנמטודות.
- לפתח טכניקות לצפייה קלה יותר בהתנהגויות ההזדווגות.
שיטות ששימשו
- פרוטוקול לקבלת נמטודות בוגרות בתולות.
- צפייה בהתנהגויות ההזדווגות בתנאים מבוקרים.
- זיהוי נמטודות זכר ונקבה.
- תיעוד מאפייני התנהגות במהלך ההזדווגות.
תוצאות עיקריות
- רכישה מוצלחת של בוגרים בתולים לצפייה.
- תיאורים מפורטים של התנהגויות ההזדווגות שנרשמו.
- תובנות לגבי האתגרים בזיהוי מיני הנמטודות.
- השלכות למחקרים רחבים יותר על התנהגות הנמטודות.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את ההבנה של התנהגות ההזדווגות של הנמטודות.
- הוא מספק בסיס למחקר עתידי בנמטולוגיה.
- האתגרים ברכישה וזיהוי הנמטודות מטופלים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative observation of mating behavior in Bursaphelenchus xylophilus enables precise behavioral phenotyping critical for early discovery and target validation in nematode research. Standardized acquisition of virgin adults and reproducible behavioral metrics support mechanistic de-risking and comparative studies across nematode species. This protocol strengthens predictive confidence for translational research and portfolio triage in parasitology and ethology-driven pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous behavioral hypothesis testing through controlled observation of mating phases and sub-behaviors.
- Supports functional target validation by isolating virgin adults and quantifying mating success rates.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing intra- and intersexual competition dynamics.
- Provides reproducible behavioral endpoints for comparative nematode studies.
Screening & Assay Development
- Establishes validated behavioral assays using synchronized and sexed nematode populations.
- Delivers quantitative outputs such as phase durations and mating frequencies for assay standardization.
- Enables reproducibility and scalability in behavioral screening platforms.
- Prepares robust systems for downstream compound or genetic intervention studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral phenotyping with translational biomarker development in nematode models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-species behavioral comparisons.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative behavioral data.
- Provides mechanistic insights relevant to disease-relevant nematode systems.
Pipeline & Workflow Integration
This behavioral quantification protocol integrates into the early discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing, assay development, and translational research in nematode biology.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing and pathway clarification via controlled behavioral observation.
- Screening: Delivers standardized, reproducible behavioral assays with quantitative outputs for screening readiness.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as phase durations and mating success rates for statistical comparison.
- Translational Research: Enables alignment of behavioral phenotypes with preclinical and disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to other nematode species and ethological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in behavioral studies.
- Operational Value: Standardizes behavioral assays for reproducibility and scalability across research teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust behavioral endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of nematode research programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nematode culturing, sexing, and behavioral observation under stereomicroscopy.
- Needs access to synchronized culturing systems, video recording, and quantitative analysis tools.
- Demands rigorous cross-team standardization for sex allocation and behavioral scoring.
- Adaptable to other nematode species with similar life cycles and behavioral traits.
- Precision in sexing and handling is critical to avoid mixed populations and ensure valid outputs.
