Name: כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של דה נובו גרורות סרטן החלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: למד את פרוטוקול הכריתה הכירורגית של גידולי שד ראשוניים בעכברי MMTV-PyMT ליצירת מודל מטסטטי דה נובו. שיטה זו מאפשרת חקר התקדמות גרורות ויעילות טיפולים אדג'ובנטיים לאחר ניתוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לג&#39;ו היל על סיוע בהיסטופתולוגיה, ד&quot;ר ג&#39;ון גלייסטין על הוראה בשיטות כירורגיות, טסה דייבל לסיוע בווידאו, כל חברי המעבדות של וונג וקוזנס על תובנות ודיונים ביקורתיים, ועל מכון OHSU Knight Cancer לתמיכה כספית. המחברים מאשרים תמיכה של T32GM071388-10 ו- T32CA106195-11 ל- CEG, NCI / NIH, המחלקה לחקר סרטן השד תוכנית המחקר, קרן סוזן ג &#39;קומן, הקרן לחקר סרטן השד וקרן לוסטיגרטן סרטן הלבלב התכנסות חלום צוות מענק מחקר תרגום (SU2C-AACR-DT14-14) ל LMC, מענק בריאות האישה של הענקת קרן MHW, ואת מרכז Brenden-Colson לבריאות הלבלב MHW ו LMC.

בעלי חיים המשמשים בפרוטוקול הבא מכוסים על ידי אורגון הבריאות והמדע של אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC), אשר נועד להיות תואם את תקנות רווחת בעלי חיים מדיניות בריאות הציבור (PHS) מדיניות. תחזוקה של תנאים סטריליים: מכשירים מעוקרים יש להשתמש בין העכברים, יש לנגב נקי עם גזה סטרילית, שטופים PBS ואחריו עיקור עם אתנול 70% מחטא במשך 15 דקות לפחות. כובע כירורגי, מסכת פנים, חלוק, כפפות צריך להיות משוחק עבור ניתוחים הישרדות. הכנה טרום אופרטיבית של החיה עבור ניתוחים הישרדות כלול בפרוטוקול הבא. עיין בטבלה 1 עבור רשימה של ריאגנטים וציוד. 1. בידוד והכנת תרחישי תא בודד מגידולי החלב הראשוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים נקבה התורם 100 יום מהונדס MMTV-PyMT (FVB / N) עכברים ולשמור תחת cעל ידי מתן 2% isoflurane באמצעות מסכה הרדמה. ודא כי העכבר הוא הרדים כראוי עם רפלקס הרגל לקוי הרגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה סטרילית, לגזור את גידולי החלב העיקרי של 100 יום מהונדס נקבה נקבה MMTV-PyMT (FVB / N) עכברים על ידי הפרדת הגידול החלב מן העור מעל הרקמות השומן שמסביב ו / או בלוטות לימפה באמצעות מספריים סטריליים. להרדים את העכברים הרדים על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במספריים סטריליים או באזמל מנתחים גידולים ראשוניים באופן ידני לחתיכות קטנות (~ 1.0 מ&quot;מ 3 ). מקום חתיכות הגידול ב 3.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase A ו 4.0 U / מ&quot;ל ​​DNase אני מומס DMEM. השתמש ~ 10 מ&quot;ל של המדיום העיכול לעיל לכל 1.0 ס&quot;מ קוטר הגידול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע עיכול בקבוק סטרילי 25 מ&quot;ל עם סט מערבל סטרילי בסל&quot;ד 125 ~ ו 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את העיכול על ידי הוספת בסרום עוברי בסרום (FBS) לדילול הסופי של 10% ומניחים את התערובת כולה על wוקרח שבו הוא מתוחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן את ההשעיה הגידול מתעכל באמצעות מסננת ניילון 0.7 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל וזורקים כל גידול שנותר מסננת. צנטריפוגה supernatant ב XG 300 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 10 מ&quot;ל DMEM לכל 1.0 ס&quot;מ הגידול מחדש לסנן באמצעות מסננת ניילון 0.7 מיקרומטר. ספירת הריכוז התא, ואז צנטריפוגה ב XG 300 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 10% דימתיל sulfoxide עם 90% FBS בריכוז של 2 x 10 7 תאים חיים / מ&quot;ל. חנות השעיות תא בודד של הגידול הראשוני כולו ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. הזרקת אורתופטית של גידול החלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקית להפשיר קפוא המתלים הגידול הראשוני ב 37 ° C עד גלולה קפואה ניתן לשחרר מן הצינור cryogenic לתוך DMM 20 מ&quot;ל לספור את התאים. צנטריפוגה ב XG 300 ב 4 מעלות צלזיוס תאים resuspend ב 1: 1 DMEM: גורם הצמיחה מופחת solobilized המרתף הממברנה הכנהXtracted מ Engelbreth-Holm- נחיל (EHS) סרקומה העכבר בריכוז של 1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל ​​(ראה טבלה של חומרים ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרדיד הנמען הנשי סיניגני העכבר בצד הגחון מעלה ולשמור תחת הרגעה רציפה על ידי מתן 2% isoflurane באמצעות מסכה הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הזכות הזרקה 4 בלוטת חלב באתר באמצעות אתנול 70% Aerosolized וליישם פולי (vinylpyrrolidone) - יוד עם ספוגית כותנה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 100 μL (1 x 10 6 תאים חיים מן המתלים הקפואים הגידול הראשוני) שפוע בצד כלפי מעלה לתוך בלוטת החלב ימין לא ברור של 6 עד 10 בשבוע FVB / N העכבר בשבוע באמצעות מזרק 29 G 0.3 מ&quot;ל אינסולין. </li></ol> 3. כריתה כירורגית של גידול חזה אורתופטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 38-60 ימים לאחר הזרקת תאים סרטניים, עכברים מורדמים לא מציגים כרכים גידול אורטוטופיים הנעים בין 172 ל 450 מ&quot;מ 3 בנפח [אורך x (רוחב 2 </Sup&gt;) / 2] (כ 75% של עכברים מוזרק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עכברים מורדמים הצגת גודל הגידול הנכון הגחון בצד תחת הרדמה מתמשכת על ידי מתן 2% isoflurane באמצעות מסכה הרדמה לאשר את העכבר הוא הרדים כראוי עם רפלקס הרגל לקוי הרגל. החל משחה וטרינר לעיניים למניעת יובש בזמן תחת סדיישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס אתנול 70% לעקר את האזור כירורגית סביב הגידול הראשוני, ולאחר מכן להחיל פולי (vinylpyrrolidone) - יוד עם צמר גפן סטרילי. הערה: הסרת שיער באתר הניתוח גרמה לעורקים ו / או לזיהומים בעכברים של 5%, ולכן לא נכללה בשלב זה (נתונים לא מוצגים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שמוצג בתרשים 1C , לעשות חתך ראשוני העור באמצעות מספריים קהה המדיאלי הזנב לגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לעשות כריתה מעולה של העור ( איור 1C ) המדיאלי לגידול. שים לב לצורך לצרוב כל כלי הדםהעורכים את הגידול הממוקם על העור לפני הארכת החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חתך העור לרוחב (האחורי לגידול), ולאחר מכן לבצע חתך העור מעולה (לרוחב הגידול), כריתה המדיאלי (עדיף על הגידול) ( איור 1 ג ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העור כבר נכרת סביב סביב הגידול ( איור 1 ג ), להרים את העור המחובר לגידול באמצעות מלקחיים בעוד בוטה לנתח את הגידול הרחק את שרירי דופן דופן הבטן ולשמור על בלוטות החלב ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה (על ידי דיסקציה קהה) ולליבון כלי גדול פועל באמצעות בלוטות החלב 4 וה 5 th. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והבלו כמחצית בלוטות החלב 4 וה 5 th באתר צריבה לשחרר את הגידול, בעור שמעל, ומגזרי של בלוטות החלב (איור 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של דימום, לזהות דימום פעילכלי ומיד לצרוב אותם. אם יותר מ 250 μL של דם הוא איבד, להוציא את העכבר מן המחקר להרדים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור אתרי כריתה עם קליפים הפצע באמצעות applier קליפ הפצע ( איור 1C ). הערה: הסר את קליפי הפצע 10 ימים לאחר הניתוח עם מסיר קליפ הפצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניהול מלוחים סטרילי חם תת עורית (4% ממשקל הגוף של החיה) ולשמור על החיה חם עם מנורת חום. בדוק את החיות כל 5-10 דקות במהלך ההתאוששות מן ההרדמה. הערה: מינון של bupivacaine או לידוקאין העלה תמותה לאחר הניתוח (נתונים לא מוצגים). עכברים אשר הראו סימנים של כאב (בטן, לא מוכן לזוז, כישלון החתן) 1 שעות לאחר הניתוח היו מורדמים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר יש התאושש לחלוטין, להחזיר אותו לחברה של עכברים אחרים. </li></ol></li></ol> 4. בידוד ועיבוד של דם וריאות עבור זרימת cytometry ו היסטולוגיה &lt;Ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב endpoints המחקר, להכין עכברים להערכות שונות histopathologic אם תרצה. 90 דקות לפני המתת חסד, לתת לכל עכבר הזרקה intraperitoneal של bromodeoxyuridine (BrdU, 50 מיקרוגרם / גרם משקל העכבר) בריכוז של 6.25 מיקרוגרם / μL ב 1x PBS. הערה: מלאי קפוא של bromodeoxyuridine מומס משמשים בתוך חודש לאחר ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 דקות לפני המתת חסד, עם העכבר הרדים, לאסוף דם retroorbital (&gt; 500 μL) באמצעות צינורות נימי heparinized, ולאחר מכן להעביר צינורות מצופים dipotassium EDTA שנערך על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר ריאות ורקמות חלב נותרות, לעשות חתך קו אמצע עם מספריים מן הבטן התחתונה אל הפה כדי לחשוף את החזה ואת החללים הצפק (איור 2 א), וכן לקלף את העור רוחבי כדי גם לחשוף את 4 וה 5 הנותרים התקינים ה החלב בְּלוּטוֹת הַרוֹק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלו את רקמת הבלוטות החלב הנותרות ולבחון אלא לשלול לצמיחה מחודשת הגידול הראשוני על ידי הערכת סידורי מחולק פורמלין קבוע פרפין קבוע מוטבע (FFPE) רקמה על ידי hematoxylin ו eosin (H &amp; E) מכתים ( איור משלים 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הריאות, לפתוח את דופן הבטן כדי הסרעפת עם מספריים, ולאחר מכן להרדים את החיה על ידי חיתוך אבי העורקים הבטן לניקוז דם לפני זלוף של הריאות ( איור 2B -2C ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הסרעפת לאורך כלוב הצלעות מתוך גישה הבטן הקפד להימנע הריאה והלב. לאחר מכן, לחשוף את החזה על ידי חיתוך דרך הצדדים לרוחב של כלוב הצלעות ( איור 2 ד ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 23 מד על מזרק 20 מ&quot;ל, ריאות perfuse עם ~ 5.0 מ&quot;ל DPBS (~ 10 מ&quot;ל / דקה) דרך החדר הימני של הלב עד הריאות להפוך לגמרי לבן ( איור 2E -2F ). מיד לחתוך את הלב מן הספינה הראשיתכל כך דם לא חוזר אל הריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור רקמת הריאה להיות קבוע ומעובד עבור הערכות histopathologic, להזריק ~ 1.0 מ&quot;ל פורמלין 10% ב 4 מעלות צלזיוס בצד חשוף trachea חשוף כלפי מעלה כלפי הריאות באמצעות מחט 23 מד ( איור 2G - 2H ). להפסיק הזרקת הריאות פעם מורחבות לחלוטין ומלא מקבע ( איור 2I ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוטות ריאות בלו מ קנה הנשימה, ואת רקמת תיקון רקמת ריאות נייטרלי שנאגרו פורמלין עבור הטבעה פרפין הבאים או בינוני אוקטובר הקפאה, לכל הליכים היסטופתיות סטנדרטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן כמותי להעריך נטל גרתי הריאות על ידי חתך סדרתי של רקמת הריאות FFPE ולהעריך קטעים microtome (100 מיקרומטר, שלושה עשר סעיפים), על ידי H &amp; E מכתים ( איור 1 ב ). </li></ol>

<ol><li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Res. 8, 212(2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SEER+Cancer+Statistics+Review+1975-2008%22">SEER Cancer Statistics Review 1975-2008</a>. Howlader, N. N. A., Krapcho, M. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. based on November 2010 SEER data submission, posted to the SEER web site. 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/">http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/</a> (2011).</li>
<li>National Comprehensive Cancer Network. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Breast+Cancer+%28Version+3.2014%29%22">Breast Cancer (Version 3.2014)</a>. , Accessed November 25.
 <a target="_blank" href="http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf">http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf</a> (2016).</li>
<li>Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/annonc/article/23/suppl_7/vii11/144433/Locally-recurrent-or-metastatic-breast-cancer-ESMO">Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).</li>
<li>Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK13196/">Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine</a>. Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R., et al. , 6th, BC Decker. Hamilton (ON). (2003).</li>
<li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene%3A+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).</li>
<li>Kouros-Mehr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-3+links+tumor+differentiation+and+dissemination+in+a+luminal+breast+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model.</a> Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung.</a> Nature. 436, 518-524 (2005).</li>
<li>Qian, B. Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4548055/">FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis.</a> J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Verkooijen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients%27+refusal+of+surgery+strongly+impairs+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Patients' refusal of surgery strongly impairs cancer survival.</a> Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).</li>
<li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28303905">Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין כל גילוי על סתירה לנתונים המוצגים כאן.

שינויים ופתרון בעיות: כאשר בוטה לנתח את הגידול במרחק של דופן הבטן, הגידול עשוי להישאר דבקים בדופן הבטן. זה נצפתה &lt;5% של עכברים מוזרק גידול (נתונים לא מוצג). עבור עכברים עם גידולים הדבקים בקיר הבטן, העכבר צריך להיות מורדמים כמו כריתה קשה ללא בצמיחה מחודשת הגידול הראשוני. מגבלות המודל / הטכניקה: <p class="j...

לנשים בצפון אמריקה יש סיכון של 12% לכל החיים לפתח סרטן שד 2 ; רוב האנשים האלה יהיו גידולים ראשוניים הוסרו באמצעות ניתוח, ובהתאם לסוג הסרטן, לאחר מכן יקבלו טיפול ממוקד, אנדוקריני, כימותרפיה ו / או הקרנות בסביבה אדג&#39;ובנטית 3 . דוגמאות לכך כוללות נשים המאובחנות בסרטן חיובי של קולטן הורמון המקבל טיפולים נגד אסטרוגן ונשים עם גידולים חיוביים ל- HER2 המקבלים טיפולים המבוססים על HER2 עם הקרנות / כימותרפיה, בעוד שאף טיפולים ממוקדים אינם זמינים עדיין לגידולים שליליים שליליים 3 . למרות ההתקדמות בקרינה, כימותרפיה, טיפולים מותאמים אישית והורמונים המשלימים כריתה כירורגית, המחלה חוזרת ב -30% -70% מהנשים המאובחנות עם מחלת שלב II או III 4 , מכיוון שהטיפולים אינם יעילים במידה רבה במיגור מחלות גרורות באיברים מרוחקים, כולל ריאה, עצם, bגשם ו / או כבד 5 . זה משמעותי במיוחד בהתחשב בכך שכאשר מחלת גרורות מתרחשת בהעדר גידול מחודש של הגידול, משמעות הדבר היא שתאים ממאירים מופצים היו קיימים כבר באיברים משניים בזמן הניתוח הסופי. לכן טיפולים מסוגלים לחסל או להאט את הצמיחה של גידולים גרורתיים נדרשים בדחיפות. בעוד מודלים העכבר נובו של קרצינוגנזה החלב כבר אינפורמטיבי להפליא מנגנוני חשיפת ויסות התקדמות ניאופלסטית 1 , מודלים קיימים גם מספר מגבלות. אחד מהם הוא העובדה כי דה novo מודלים מהונדס בדרך כלל לפתח גידולים ראשוניים בבלוטות החלב מרובים, שבו הגידול הראשוני נטל מגבלות משך הלימודים. בעוד שתא הגידול העיקרי בתאי הזרע הגרורתי עשוי להתרחש מוקדם בהתקדמות ניאופלסטית במודלים אלו, התפתחות גלויה של גידולים גרמניים מתרחשת מאוחר,N את מודל העכבר ואת רקע זן, הוא לעתים קרובות חלקית החדירה 1 . זה עוד מגביל את התועלת של מודלים של נובו לגילוי של מולקולות המסדירות גרורות באיברים משניים, וכן להערכת יעילות פרה קלינית של טיפולים בסביבה adjuvant. כדי לעקוף את המגבלות הללו, פיתחנו מודל נוטו autochthonous של גרורות קרצינומה החלב לריאות. אמהות מהונדסות מהונדס ( כלומר , MMTV-PyMT על רקע FVB / n זן למחקרים המתוארים כאן) הנושא בשלב מאוחר של גידולי החלב novo הם בגילאי ~ 100 ימים 6 , ובנקודה שבה גידולים העיקריים שלהם הם resected כירורגי ו ניתק באופן אנזימטי לתוך תא יחיד השעיות. השעיות (1 x 10 6 תאים) הם בתורו autantotopically explanted לתוך 6-7 בן מקבלי נקבה עכברים syngeneic, שבו אחד גידולי החלב העיקרית לפתח על 38-60 יום תקופה ( 3 ), עכברים מקבלים מורדמים וגידולים ראשוניים הם resected כירורגי כך לצמיחה מחודשת של הגידול באתר כירורגית ממוזער, עולה בקנה אחד עם ניתוח בנשים ( איור משלים 1 ). על רקע FVB / n זן, עכברים לפתח foci גרורתי היסטולוגית הריאות עם החדירה 45% על ידי ~ 115 ימים לאחר הניתוח ( איור 1 ב ). עם זמן חביון ממושך זה של גידול גידולי גרורתי, המודל ממוקם באופן ייחודי עבור מתן טיפול אדג&#39;ובנטי, וכן להבהרה והערכת ביולוגיה בסיסית המשפיעים על התקדמות גרורת בעקבות הסרה כירורגית של גידולים ראשוניים.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N/A</td><td>הזמנת מרשם</td></tr><tr><td>קולגנאז A</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל בקבוק פיירקס</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS139525</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>אטלנטה ביו&nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0.7 ומיקרו; מסננת ניילון M&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 50 מ"ל&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>מטריגל מופחת גורם גדילה&nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td>תכשיר קרום בסיס מסיס מופחת גורם גדילה המופק מסרקומה של עכבר אנגלברת-הולם-נחיל (EHS)</td></tr><tr><td>פולי (וינילפירולידון)&ndash; קומפלקס יוד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>29 מד 0.3 מ"ל מזרק אינסולין</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צריבה לכלי קטן</td><td>FST</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>קליפים פצועים</td><td>טקסס סיינטיפיק</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip קליפ אפליקציה&nbsp;</td><td>BD</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>מסיר קליפ פצע AutoClip&nbsp;</td><td>BD</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine</td><td>Roche</td><td>10280879</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימים שעברו הפרין&nbsp;</td><td>פישר</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוטיינר עם דיפוטסיום EDTA&nbsp;</td>מזרק <td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 מ"ל&nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>תרמו-פישר</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הקפאה אוקטי&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608930</td><td></td></tr><tr><td>פורמלין, חוצץ, 10% (מאגר פוספט)</td><td>פישר</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>23 גרם מחט</td><td>פישר</td><td>14-826-6B</td><td></td></tr><tr><td>FVB/n עכבר</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>001800</td><td></td></tr></tbody></table>

כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל murlin פרה קלינית של דה נובו גרורות סרטן החלב

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

היבט מגביל קצב של מודלים של עכברים טרנסגניים של אדנוקרצינומה של החלב הוא שעומס הגידול הראשוני ברקמת החלב מגדיר בדרך כלל את נקודות הקצה של המחקר. לפיכך, מחקרים המתמקדים בהבהרת מנגנונים של גרורות דה נובו בשלב מאוחר נפגעים, כמו גם מחקרים הבוחנים את יעילותם של טיפולים אנטי-סרטניים המכוונים למתווכים של גרורות בסביבה האדג'ובנטית. מודלים רבים של סרטן שד בעכברים פותחו באמצעות ביטוי ממוקד של אונקופרוטאינים דומיננטיים לתאי אפיתל חלביים, והניבו מודלים המחקים באופן משתנה תת-סוגים של סרטן שד היסטופתולוגי וטרנסקריפטום הנפוצים בנשים 1. בעוד שהרבה נלמד לגבי הביולוגיה של סרטן החלב עם מודלים אלה, התועלת שלהם בזיהוי מולקולות המווסתות את הצמיחה של גרורות בשלב מאוחר נפגעת מכיוון שעכברים בדרך כלל מורדמים בנקודות זמן מוקדמות יותר עקב עומס גידול ראשוני משמעותי. יתרה מכך, מכיוון שאחוז ניכר מהנשים המאובחנות עם סרטן השד מקבלות טיפול משלים לאחר כריתה כירורגית של גידולים ראשוניים ולפני נוכחות מחלה גרורתית הניתנת לזיהוי, יש צורך דחוף במודלים פרה-קליניים של גרורות דה נובו כפלטפורמות להערכת טיפולים חדשים שמטרתם להתמקד במוקדים גרורתיים. כדי לטפל בחוסרים אלה, פיתחנו מודל עכברי של גרורות סרטן שד דה נובו, שבו גידולי שד ראשוניים נכרתים בניתוח, ומוקדים גרורתיים מתפתחים לאחר מכן במשך תקופה של 115 יום לאחר הניתוח. חביון ארוך זה מספק מודל ניתן למעקב לזיהוי מווסתים משמעותיים מבחינה תפקודית של התקדמות גרורתית בעכברים חסרי גידול ראשוני, כמו גם מודל להערכת יעילות טיפולית פרה-קלינית של חומרים שמטרתם לחסום מולקולות משמעותיות מבחינה תפקודית המסייעות להישרדות ולצמיחה של גידול גרורתי.

יותר מ 75% מהעכברים המקבלים שקיבלו 1 x 10 6 תאים מגידולי החלב העיקריים שנגזרו מעכברי MMTV-PyMT, פיתחו אדנוקרצינומות חד-פעמיות בגודל של 172 עד 450 מ"מ 3 בתוך 38-60 ימים (נתונים לא מוצגים). עכברים זכאים אקראיים נרשמות מכן לקבוצות מחקר לאחר כריתה כירורגית של גידולים ראשוניים כפי שמוצג ( איור 1 ג ). הגידול הראשוני הגידול זוהה פחות מ 2% של עכברים שעברו כריתה כירורגית של הגידול הראשוני ( <strong class="...

מודלים פרה-קליניים המעריכים טיפול אדג&#39;ובנטי למיקוד גרורות לסרטן השד נעדרים. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו מודל Murine של novo ריאתי אדמוקרצינומה החלב ריאתי, שבו טיפולים שניתנו הגדרה אדג&#39;ובנטית (כריתה כירורגית לאחר ניתוח) ניתן להעריך את היעילות להשפיע על גרורות בעבר ריאתי seeded.

כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של דה נובו גרורות סרטן החלב

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

פיתחנו מודל עכברי חדש של גרורות סרטן שד דה נובו המחקה מקרוב את מהלך סרטן השד האנושי, ומספק פלטפורמה פרה-קלינית להערכת הביולוגיה, התקדמות המחלה הגרורתית הבסיסית ויעילות הטיפולים הניתנים במסגרת האדג'ובנטית. נהלים הקשורים לנבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע. מודל העכברים שלנו נוצר על ידי קצירת גידולים ראשוניים מנותקים אנזימטית מנגיף גידול שד עכבר טרנסגני בן 100 יום, פוליומה, עכברי T בינוניים או MMTV-PyMT.פעם אחת 10 עד תאי הגידול השישי מוזרקים אורתוטופית לעכברים נקבות מושתלות סינגניים וגידולים ראשוניים מתפתחים במהלך תקופה של 38 עד 60 יום. עכברים הנושאים גידולים בגודל 170 עד 450 מילימטרים מעוקבים נרשמים לכריתה כירורגית של הגידול הראשוני. הניתוח לאחר 115 ימים לאחר הניתוח הביא לעכברים שיש להם מוקדים גרורתיים הניתנים לזיהוי היסטולוגי בריאות עם חדירה של 45%.סרטון זה מתאר כריתה כירורגית של גידול החלב הראשוני, מרכיב מכריע במודל העכברים הפרה-קליני. עכברים מקבלים 2% איזופלורן והניתוח יכול להתחיל ברגע שרפלקס צביטת כף הרגל נעדר. רססו את העור המכסה את הגידול הראשוני באתנול 70%.לאחר מכן מורחים בטדין על אזור הניתוח החל מהעור המכסה את הגידול ואחריו האזור המקיף את הגידול הראשוני באמצעות צמר גפן סטרילי. בעזרת מספריים קהים מבצעים חתך ראשוני בעור הזנב המדיאלי לגידול הראשוני. החתך מורחב בכיוון מדיאלי מעולה לגידול הראשוני.לזהות ולצרוב כלי דם פוטנציאליים המזינים את הגידול מהעור שמעליו. אם מתרחש דימום, יש לבצע צריבה נוספת. בעת ביצוע חתך עור לרוחב נחות מהגידול הראשוני, הקפד להימנע מחיתוך בלוטת החלב הבסיסית מכיוון שכלי דם עשויים להימצא.לאחר מכן חתך העור מורחב באופן היקפי סביב הגידול הראשוני. הידבקויות דקות בבלוטת החלב המדיאלית לגידול מנותחות בזהירות ומפרידות בין הגידול לדופן הבטן. כלי דם עשויים להיות נוכחים בתוך הידבקויות אלה.צרבו את כל הכלים שזוהו בתוך ההידבקויות לפני החיתוך. החצים מציינים את בלוטות החלב הימניות הרביעית והחמישית, המוצגות מעל ומתחת לגידול. לאחר מכן נצרבה ונכרתת בלוטת החלב החמישית מכיוון שהיא עשויה להכיל כלי דם קטנים שקשה לדמיין.לאחר הפרדת הגידול מדופן הבטן, ניתן לזהות כלי דם גדולים יותר. הכלי העובר דרך בלוטת החלב הרביעית מוצג על ידי החץ העליון. עורק הירך הבסיסי מוצג על ידי החץ האמצעי.וכלי הדם הגדול המזין את הגידול בין בלוטת החלב הרביעית לחמישית מסומן על ידי החץ התחתון. לאחר מכן מבוצעת צריבה לאורך כלי הדם הגדול העובר בין בלוטת החלב הרביעית לחמישית, תוך הקפדה על הימנעות מצריבה של עורק הירך הבסיסי ברגל. לאחר השלמת הצריבה של הכלי הגדול, חותכים את הכלי עד לבלוטת החלב הרביעית.אתר וצרוב את הכלי הגדול השני העובר דרך בלוטת החלב הרביעית. חותכים את הכלי מבלי לחתוך את כל בלוטת החלב כך שאם מתרחש דימום, ניתן לזהות את הכלי בקלות ולצרוב אותו עוד יותר. לאחר מכן נכרתת שארית בלוטת החלב הרביעית.לאחר מכן, העור שמעליו נסגר באמצעות קליפס פצע באמצעות קליפס פצע AutoClip. ודא שהעור שמעליו מופרד מספיק מדופן הבטן כדי למנוע קיצוץ של השריר הבסיסי. קרב את הקצוות הצדדיים והמדיאליים של הפצע, הרם את העור בכיוון הקדמי כדי למרוח את קליפ הפצע.הקפד להימנע מקיצוץ דרכי השתן או השריר הבסיסי של רגל ימין. ניוד רגל ימין על ידי הסרת סרט עשוי לאפשר יישום קל יותר של קליפסים לפצעים. יש להסיר את מהדקי הפצע 10 ימים לאחר הניתוח.הכריתה הכירורגית של הגידול הראשוני המוצג בסרטון זה מאפשרת לתאי סרטן מפוזרים להתפתח במוקדים הגרורתיים בריאה 115 ימים לאחר הניתוח, שם מוצג נציג של כל אחד מהם בתמונה של מוקד גרורתי. בהתחשב בכך שאחוז גדול מהנשים המאובחנות עם סרטן השד עוברות הסרה כירורגית של הגידול ועלולות להיכנע למחלה גרורתית לאחר הניתוח, הקמנו מודל עכברי פרה-קליני המחקה את מהלך המחלה והטיפול בחולה. על ידי רישום המתודולוגיה להסרה כירורגית של גידול החלב הראשוני, ניתן לשחזר בקלות מרכיב מרכזי זה במודל העכברי שלנו של גרורות סרטן השד דה נובו על מנת להעריך את הביולוגיה של המחלה הגרורתית לאחר כריתת הגידול ויעילות הטיפול המשלים.

surgical-procedures-methodology-for-preclinical-murine-model-de-novo

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

הדמית זמן לשגות משמשת כדי להעריך את ההתנהגות של תאים ראשוניים preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סיכון לסרטן שד על מנת לקבוע אם יש קשר בין פרמטרים התנהגותיים ספציפיים ונגעים גנטיים מובחנים.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

מודל שד סרטן מוח גרורות עכבר הוא הקים עם הזרקת intracardiac אולטרסאונד מונחה הדמיה של תאי MDA-MB231/Br-GFP. התפתחות של גרורות תוך גולגולתי multifocal כבר במעקב אורכים באמצעות רזולוציה גבוהה 9.4 T-MRI.

הזרקת intracardiac מונחה ההדמיה אולטראסאונד לפתח מודל עכבר של שד גרורות סרטן מוח ואחריו האורכי MRI

הפעלה של מוטציות סמויות עם adenovirus-Cre לתוצאות מערכת ductal החלב בסרטן שד גרורתי רלוונטי מבחינה קלינית. התאגדות של אמרגן YFP מאפשרת מעקב של תאים סרטניים גרורתי דיסטלי. מודל זה שימושי ללמוד גרורות סמויות, חסינות אנטי סרטניים, ולעיצוב immunotherapies החדשני לטיפול בסרטן השד.

חניכה של סרטן השד גרורתי על ידי מיקוד של האפיתל ductal עם Adenovirus-Cre: דגם רומן מהונדס עכבר של סרטן השד

מודל פרה קליני, עכברי של גרורות בכבד מבוצע באמצעות טכניקת הזרקת hemispleen.

דגם Murine פרה של גרורות כבדית

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור גידולי שד. בטכניקה זו מסירים גידולי שד של עכברים ומכינים תאים ראשוניים מגידולים. פרוטוקול מיצוי ריאות כלול לחקר גרורות ריאות. יתר על כן, כלול פרוטוקול נוסף לניתוח פיברובלסטים עובריים של עכברים מעובר העכבר.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

כדי להבהיר את תהליך רב שלבי של הפצת הצפק של קרצינומה השחלות, המחקר הנוכחי מציג מודל ניסיוני בעכברים של התפתחות גידולים המקורי וגרורות הצפק באמצעות חיסון orthotopic עם תאים סרטניים אלה.

Murine ניסיוני דגם של התפתחות גידולים מקורית גרור הצפק<em&gt; דרך</em&gt; Orthotopic הרכבה עם קרצינומה של תאי השחלות

אנחנו מציגים את orthotopic מאתר השד סרטן ומודל כריתה רדיקלית בטכנולוגיה ביולומינסנציה לכמת את נטל הגידול לחקות התקדמות סרטן השד אנושי.

יצירת מודל של סרטן שד גרורתי Orthotopic מאתר וביצוע מאתר כריתה רדיקלית

בפרוטוקול זה, אנו מתארים מודל העכבר של כריתת כירורגית לא הושלמה של סרקומה של רקמה רכה עבור בדיקות (ניאו) שדון טיפולים.

מודל עכבר של Insected רקמה רכה לחלוטין סרקומה עבור בדיקה (ניאו) שפיטה טיפולים

מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה ומודלים של עכברים מהונדסים גנטית הניתנים להשתלה מחדשים בנאמנות מחלות אנושיות והם מודלים מועדפים לחקר בסיסי ותרגום של סרטן השד. כאן, שיטה מתוארת להשתלה אורתוטופית שברי גידול השד לתוך כרית השומן הממארי כדי ללמוד ביולוגיה של הגידול ולהעריך את תגובת התרופה.

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

מידול גרורות מוח תוך גולגולתי מסובך על ידי חוסר יכולת לפקח על גודל הגידול ותגובה לטיפול בשיטות מדויקות ובזמן. המתודולוגיה שהוצגה זוגות הזרקת גידול תוך גולגולתי עם ניתוח הדמיית תהודה מגנטית, אשר בשילוב, מטפח זריקות מדויקות ועקביות, ניטור משופר של בעלי חיים, ומדידות מדויקות של נפח הגידול.

מידול גרורות מוח באמצעות הזרקה תוך גולגולתית והדמיית תהודה מגנטית

כתב היד מתאר מתודולוגיה להקמה וכן ניטור גדילה אורכי של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד בהזרקה אורתוטופית, הניתנת להתערבות בכל שלבי המפל הגרורתי.

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

למד את פרוטוקול הכריתה הכירורגית של גידולי שד ראשוניים בעכברי MMTV-PyMT ליצירת מודל מטסטטי דה נובו. שיטה זו מאפשרת חקר התקדמות גרורות ויעילות טיפולים אדג'ובנטיים לאחר ניתוח.

כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של דה נובו גרורות סרטן החלב

גלה סרטונים נוספים