3D כמוני סיליקו דוגמנות (q3DISM) של Phagocytosis עמילואיד-ביתא מוחין במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר
26 בדצמבר 2016
פיתחנו מתודולוגיה 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) של-β עמילואיד מוחין (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר. שיטה זו ניתן להכליל עבור quantitation של כמעט כל אירוע phagocytic in vivo.
המטרה הכוללת של תלת-ממד כמותי זה במודלים סיליקונים, או טכניקת q3DISM, היא לכמת את ספיגת העמילואיד-בטא על ידי פגוציטים חד-גרעיניים במוחם של מודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר. שיטה זו נותנת מענה לצורך דחוף בתחום חקר האלצהיימר לכימות הפינוי של עמילואיד-בטא המופקד במוחם של חולי אלצהיימר היוצרים פלאק סנילי. לראשונה, טכניקה זו מאפשרת שחזור תלת-ממדי אמיתי וכימות של עמילואיד-בטא על ידי מקרופאגים in vivo התחלנו להשתמש ב-3-Dism כדי לחקור שקיעת עמילואיד-בטא מכיוון שהיינו זקוקים לכלי חזק כדי להמחיש ולכמת פגוציטוזיס מיקרופאג'ים in vivo.
טכניקה זו עשויה להיות שימושית בבדיקת טיפולים ניסיוניים במחלת אלצהיימר כדי להעריך אילו תרופות מעוררות מקרופאגים לפינוי יעיל של עמילואיד-בטא. כאשר דגימות הרקמה מוכנות לצביעה חיסונית, מלאו את אזור הרקמה המוקף במחסום הידרופובי עם חיץ חוסם למשך שעה אחת של דגירה בטמפרטורת החדר בתא לח. בתום הדגירה, החלף את המאגר החוסם בנוגדנים הראשוניים המעניינים הראשון למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בתא הלח.
למחרת בבוקר, שטפו את הדגימות בשלוש אמבטיות PBS של חמש דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה קלה. לאחר הכביסה השלישית, דגרו את השקופיות עם הנוגדן המשני הפלואורסצנטי המתאים בטמפרטורת החדר המוגן מפני אור. לאחר שעה יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים נוספות ב- PBS מוגן מפני אור.
לאחר מכן תייגו את התאים עם הנוגדנים הראשוניים והמשניים האחרים המתאימים לרקמה המעניינים במהלך היומיים עד ארבעה הימים הבאים כפי שהודגם זה עתה. כדי לצבוע ביעילות תאים ועל-תאיים ומשקעי עמילואיד-בטא, חיוני לתייג רק עם נוגדן ראשוני אחד בכל פעם ואחריו הנוגדן המשני המתאים. תהליך גוזל זמן אך אופטימיזציה של התוצאות.
לאחר השטיפה האחרונה של צביעת הנוגדנים המשנית, הניחו לחלקים להתייבש לחלוטין למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, מכסים את הדגימות המיובשות בהחלקת כיסוי אטומה על ידי מדיום הרכבה פלואורסצנטי המכיל DAPI. כדי לצלם את הדגימות במיקרוסקופיה קונפוקלית, בחר את מטרת המיקרוסקופ פי 60 והוסף שמן טבילה לעדשה.
הנח את הדגימה על המיקרוסקופ tagמחזיק שקופיות והרם את המטרה עד שהשמן יוצר מגע עם השקופית. באמצעות תאורה אפיפלואורסצנטית, כוונן את מישור המוקד כדי לאתר את פלאק העמילואיד בהיפוקמפוס או בקליפת המוח. לאחר מכן, רכשו תמונות קונפוקליות של הפגוציטים החד-גרעיניים המופעלים המקיפים את מרבצי העמילואיד בהיפוקמפוס או בקליפת המוח.
עבור תלת מימד איכותי במידול סיליקו, נתח תחילה את מערכי הנתונים הקונפוקליים עם עיבוד תמונה תלת מימדי מדעי במודול קולוקליזציה של תוכנת ניתוח לקרבה מרחבית של צביעת סמן המקרופאגים המופעלים בכל מישורי Z בו זמנית. צור תעלות קולוקליזציה התואמות את צביעת הפגוליזוזום בתוך הפגוציטים החד-גרעיניים המופעלים. בחר TRITC עבור ערוץ A, ו- FITC עבור ערוץ B.In החלון בדיקת מצב, בחר סף.
לעוצמות הקולוקליזציה, בחר ערוצי מקור. לחץ על Edit כדי לבחור את צבע הקו-לוקליזציה. לאחר מכן התאם את הספים של כל ערוץ באופן עצמאי כדי לכלול את הצביעה הספציפית וכדי לא לכלול את הרקע והאותות הלא ספציפיים.
הווקסלים המשותפים יופיעו בצבע הקו-לוקליזציה שנבחר בכל ערימות ה-z בו-זמנית. לאחר מכן, לחץ על בנה ערוץ לוקליזציה. ערוץ ה-colocalizaton שנוצר יופיע בחלון התאמת תצוגה.
לחץ על ערוץ הלוקליזציה כדי לפתוח את סטטיסטיקת הערוץ. אחוז חומר הנפח A מעל הסף המשותף מייצג את נפח המונוציטים שתופסים הפגוליזוזומים. באמצעות מודול הקולוקליזציה, נתח את ערוץ הקולוקליזציה לקרבה מרחבית עם אותות העמילואיד-בטא כדי לכמת את העמילואיד-בטא העטוף בתוך הפגוליזוזומים.
בחר את מערך נתוני הקולוקליזציה של ערוץ A ו- Cy5 עבור ערוץ B ובנה ערוץ לוקליזציה כפי שהודגם זה עתה. לחץ על ערוץ הקולוקליזציה כדי לפתוח שוב את סטטיסטיקת הערוץ. אחוז חומר הנפח A מעל הסף הקולוקאלי מייצג את הנפח הפגוליזוזומי שתופס העמילואיד-בטא.
באמצעות מודול ה-Surpass, שחזר את ערימות התמונות הקונפוקליות וצור מודלים תלת מימדיים של העמילואיד-בטא המכוסה בתוך הפגוליזוזומים המונוציטים. בחלון התאמת תצוגה, בחר TRITC כדי להציג רק את כתמי המקרופאגים, ולחץ על הוסף משטח חדש"במאפייני הנפח. תחת הגדרות, בשלב הראשון מתוך חמש, אלגוריתם, בחר Surface.
בצבע, בחרו בסוג הצבע המעניין והתאימו את השקיפות בהתאם לצורך. לאחר מכן סמן את התיבה בחר אזור עניין ולחץ על הבא. בשלב השני מתוך חמש, אזור העניין, התאם את הקואורדינטות X, Y ו- Z כדי לצייר חלון סביב התא המעניין ולחץ על הבא.
בשלב השלישי מתוך חמישה, ערוץ המקור, בחר את ערוץ המקור TRITC וסמן את התיבה חלק. הגדר את רמת הפירוט של שטח הפנים ל-0.4 מיקרון ולחץ על הבא. בשלב הרביעי מתוך חמישה, סף, כוונן את הסף כך שהנפח שנוצר יחפוף בצורה מושלמת לאות ערוץ TRITC ולחץ על הבא.
לבסוף, בשלב החמישי מתוך חמישה, סיווג משטחים, במקטע סוגי מסננים, בחר את האובייקטים בהתאם לגודלם שייכללו או לא ייכללו באמצעי האחסון שייווצר. חזור על אותם שלבים כדי ליצור משטחים תלת-ממדיים עבור פגוליזוזומים עם ערוץ FITC ועמילואיד-בטא עם ערוץ Cy5. לאחר תלת מימד איכותי במודלים סיליקונים, כפי שהודגם זה עתה, ניתן לנתח את ספיגת העמילואיד-בטא לתוך הפגוליזוזומים המונוציטים במוחם של עכברים וחולדות טרנסגניים.
באופן מעניין, הנפח שתופסים פגוליזוזומים חיוביים CD68 גדל משמעותית בפגוציטים חד-גרעיניים חיוביים ל-Iba1, הקשורים לעכברים וחולדות, בהשוואה לפלאקים מרוחקים, מה שמדגים כי הפגוציטים החד-גרעיניים ליד הפלאק מוכנים לפגוציטוזה, בהשוואה לתאים הממוקמים הרחק מהפלאק. ראוי לציין גם כי פגוציטים חד-גרעיניים הקשורים לפלאק מציגים ספיגה מוגברת של עמילואיד-בטא בעכברים טרנסגניים בהשוואה לתאים המרוחקים מהפלאק, בעוד שבחולדות טרנסגניות נצפתה ספיגה צנועה מאוד של סיבי עמילואיד-בטא בסך הכל, ללא שינוי נראה לעין בפגוציטוזיס סיבי עמילואיד-בטא כפונקציה של המרחק מהפלאק. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שאיכות התמונות הקונפוקליות היא קריטית וכי יש להחיל ספים דומים עבור כל הערוצים במהלך ניתוח הקולוקליזציה.
מאז פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הדלקת העצבית לחקור אירועים פגוציטים במוחם של מודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לתייג חלקים במוח של מכרסמים עבור פגוציטים חד-גרעיניים, פגוליזוזום ועמילואיד-בטא. לכמת את הפגוציטוזה של עמילואיד-בטא מוחי בתלת מימד in vivo.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכניקה חדשנית למידול כמותי תלת-ממדי במחשב (q3DISM) לניתוח הפגוציטוזה של amyloid-beta על ידי פגוציטים חד-גרעיניים במודלים של מכרסמים למחלת אלצהיימר. שיטה זו מאפשרת כבישת כמותית של אירועי פגוציטוזה in vivo, ובכך נותנת מענה לצורך קריטי במחקר על מחלת אלצהיימר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- מחקר על מחלת האלצהיימר
- אימונולוגיה
רקע
- הצטברות של עמילואיד-בטא היא סימן היכר של מחלת אלצהיימר.
- פגוציטים חד-גרעיניים ממלאים תפקיד מכריע בפינוי עמילואיד-בטא.
- בשיטות הקיימות חסרה היכולת לכמת פגוציטוזה בשלושה ממדים.
- קיים צורך בכלים חסונים להדמיה וכמיון של פעילות פגוציטית in vivo.
מטרת המחקר
- פיתוח מתודולוגיה לכימות ספיגת amyloid-beta על ידי פגוציטים.
- מתן אפשרות לשחזור תלת-ממדי של אירועי פגוציטוזה במודלים של מכרסמים.
- סיוע בבדיקת תרופות פוטנציאליות למחלת האלצהיימר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח טכניקת ה-q3DISM למידול בתלת-ממד.
- צביעה אימונוהיסטוכימית של דגימות רקמה לצורך ויזואליזציה.
- ניתוח כמותי של פגוציטוזה של amyloid-beta.
- שימוש במודלים של מכרסמים לחקר התנהגות הפגוציטים in vivo.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של ספיגת amyloid-beta על ידי מקרופאגים.
- הדגמת יעילותה של טכניקת q3DISM בשחזור תלת-ממדי.
- זיהוי השפעות טיפוליות פוטנציאליות על פעילות המקרופאגים.
- הבנה משופרת של תהליכי פגוציטוזה בפתולוגיה של מחלת האלצהיימר.
מסקנות
- טכניקת q3DISM מספקת כלי בעל ערך למחקר על מחלת האלצהיימר.
- ניתן להחיל שיטה זו על אירועים פגוציטיים אחרים in vivo.
- מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בטכניקה זו כדי לבחון נתיבים טיפוליים חדשים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות פגוציטוזה של עמילואיד-בטא in vivo נותן מענה לפער קריטי בגילוי תרופות למחלת אלצהיימר, בכך שהוא מאפשר הערכה אובייקטיבית של מעורבות המטרה ומנגנון הפעולה של טיפולים אימונו-מודולטוריים. שיטת q3DISM מספקת נתונים הניתנים לשחזור עם רזולוציה מרחבית, התומכים בהחלטות go/no-go בשלבים הפרה-קליניים של הפיתוח, על ידי הפחתת סיכונים בהיפותזות הנוגעות לפינוי המתווך על ידי מיקרוגליה. יכולת זו מגבירה את הביטחון בניבוי בשלבי הגילוי המוקדמים, שבהם תיקוף פונקציונלי של מטרות נוירו-אימוניות נותר מאתגר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הנוגעות לתפקוד הפגוציטרי של מיקרוגליה בפתולוגיה של מחלת אלצהיימר.
- ערך תפעולי: מספק קריאות כמותיות ברזולוציית תלת-ממד להערכת מודולציה של המטרה על ידי תרכובות ניסיוניות.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי הבחנה בין תרכובות המגבירות באופן ממשי את ספיגת amyloid-beta לבין כאלו בעלות השפעות לא ספציפיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצרת פלטים כמותיים וסטנדרטיים המתאימים לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של חומרים מווסתים פגוציטוזה.
- שחזוריות: משתמשת בקו-לוקליזציה מבוססת סף ובשחזור תלת-ממדי כדי לצמצם הטיות של המשתמש ולהבטיח עקביות בין ניסויים שונים.
- מדרגיות: תואם לתהליכי הדמיה קונפוקלית וניתן להסבה לזרימות עבודה של ניתוח תמונות אוטומטי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה פעילות פגוציטית במוחות של מכרסמים המשחזרת מאפיינים מרכזיים של נוירו-דלקת במחלת אלצהיימר בבני אדם.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים במערכות in vitro לתיקוף in vivo על ידי כימות תכולת amyloid-beta בפגוליזוזומים בחתכי רקמה.
- הפחתת סיכונים: מפחיתה עמימות מנגיסטית במחקרי פרה-קליניים על ידי מדידה ישירה של מודולציה של נתיב המטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת ה-q3DISM משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות (lead optimization), ומספקת מדדים מכניסטיים המנחים החלטות לגבי קידומה של תרכובת.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של מנגנונים אימונו-מודולטוריים על ידי כימות שטף פגוציטוזי in situ.
- סריקה: מספקת מדדי קולוקליזציה כמותיים ומוכנים לבדיקה להערכת השפעת תרכובות על פגוציטוזה.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות מבוססות נפח ועוצמה המאפשרות השוואה סטטיסטית של קבוצות טיפול.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מעורבות של מטרות תאיות לבין פתולוגיה ברמת הרקמה באמצעות מיפוי מרחבי בתלת-ממד של ספיגת amyloid-beta.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת מסגרת הדימות והניתוח הניתנת לשימוש חוזר, הישימה למטרות פגוציטוזיות אחרות בדלקות נוירונליות ומעבר להן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי אספקת ראיות ישירות לוויסות של מנגנון הפגוציטוזה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הערכת הפגוציטוזה בין מעבדות באמצעות פרוטוקולים מוגדרים לצביעה, דימיון ואנליזה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת שיעורי הכישלון בשלבים מאוחרים יותר כתוצאה מהפחתת סיכונים מכניסטית לא מספקת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מבוסס נתונים של מועמדים לאימונו-מודולציה בהסתמך על תוצאות פונקציונליות של פגוציטוזה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית, צביעה אימונוהיסטוכימית ותוכנה לניתוח תמונות בתלת-ממד.
- תלוי בסימון פלואורסצנטי באיכות גבוהה ובשימור אופטימלי של הרקמה לצורך זיהוי מדויק של האות.
- מחייב הגדרת ספי רגישות (thresholding) ופרמטרים של קולוקליזציה (colocalization) סטנדרטיים כדי להבטיח השוואתיות בין ניסויים.
- התאמה למערכות מודלים שונות עשויה לדרוש תיקוף של סממני פגוציטים ואפיטופים של amyloid-beta.
- מגבלות מעשיות כוללות את נגישות הרקמה ואת הצורך במיומנויות ייעודיות לעיבוד תמונות.
