Name: מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: למדו שיטת קיפאון פלאנג לתאי תלייה במיקרוסקופ אלקטרונים חודר. שיטה זו שומרת היטב על מבנה תאים ומאפשרת מחקרים אולטרה-מבניים ואימונולוקליזציה ביעילות ובעלות נמוכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודתנו ל M. Bouchecareilh, E. Tétaud, ס Duvezin-Caubet, וא דווין לעזרה והערות שלהם על כתב היד. אנו מודים קוטב ההדמיה האלקטרוני של מרכז דימות בורדו איפה התמונות צולמו. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique.

<ol><li>Palade, G. E., Porter, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Its+identification+in+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ.</a> J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).</li>
<li>Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+and+morphological+changes+during+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Artefacts and morphological changes during chemical fixation.</a> J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).</li>
<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples%3A+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out+with+the+old+and+in+with+the+new%3A+rapid+specimen+preparation+procedures+for+electron+microscopy+of+sectioned+biological+material%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material.</a> Protoplasma. 251, 429-448 (2014).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).</li>
<li>Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+counterbalances+endoplasmic+reticulum+expansion+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response.</a> PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).</li>
<li>Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+non-selective+autophagic+degradation+of+mitochondria+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast.</a> Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).</li>
<li>Gilkey, J. C., Staehling, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jemt.1060030206/abstract">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).</li>
<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+A+Unique+Tool+for+the+Visualization+of+Macromolecular+Complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity.</a> Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li>
<li>Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).</li>
<li>Leunissen, J. L. M., Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-pressurized+rapid+freezing+%28SPRF%29%3A+a+novel+cryofixation+method+for+specimen+preparation+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy.</a> J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).</li>
<li>Lefebvre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LdFlabarin+a+new+BAR+domain+membrane+protein+of+Leishmania+flagellum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum.</a> PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).</li>
<li>Tetaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TbFlabarin%2C+a+flagellar+protein+of+Trypanosoma+brucei%2C+highlights+differences+between+Leishmania+and+Trypanosoma+flagellar-targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals.</a> Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).</li>
<li>Wasmer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+spectroscopy+reveals+that+E+coli+inclusion+bodies+of+HET-s%28218-289%29+are+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).</li>
<li>Lefebvre-Legendre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+assemble+the+alpha+3+beta+3+subcomplex+of+the+ATP+synthase+leads+to+accumulation+of+the+alpha+and+beta+subunits+within+inclusion+bodies+and+the+loss+of+mitochondrial+cristae+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).</li>
<li>Paumard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATP+synthase+is+involved+in+generating+mitochondrial+cristae+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology.</a> EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).</li>
<li>Gabriel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fox2-dependent+fatty+acid+%C3%9F-oxidation+pathway+coexists+both+in+peroxisomes+and+mitochondria+of+the+ascomycete+yeast+Candida+lusitaniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae.</a> PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).</li>
<li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+rapid+cooling+and+its+implications+for+cryoimmobilization+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells.</a> Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).</li>
<li>Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+living+cells%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of living cells: principles and practice.</a> Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).</li>
<li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).</li>
<li>Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+high-pressure+freezing+and+quick+freeze+substitution+of+plant+tissues+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51844(2014).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+autophagy+in+the+filamentous+fungus+Podospora+anserina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina.</a> Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).</li>
<li>Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+chemical+fixation+method+suitable+for+immunogold+localization+of+green+fluorescent+protein+in+the+Golgi+apparatus+of+tobacco+Bright+Yellow+%28BY-2%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells.</a> J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).</li>
<li>Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high+pressure+freezing+and+freeze+substitution+method+to+preserve+the+labile+vaccinia+virus+nucleocapsid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid.</a> J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.

TEM היא שיטה רבת עוצמה עבור תצפית ultrastructural של אברונים, תאים, רקמות. Cryofixation / הקפאה-החלפה היא כיום השיטה הטובה ביותר לשימור הוא antigenicity ultrastructure והחלבון. Fixatives הכימי לחדור ולפעול ובכך לאפשר שחלופים מבניים מאוד לאט לפני ההתייצבות המלאה של ultrastructure 2. לעומת זאת, cryofixation / הקפאה-החלפה מיידית מייצב מבנים הסלולר 4. עם זאת, cryofixation / טכניקות הקפאה-החלפה כוללות מספר האילוצים וקשיים ובכך מגבילים המג...

לדוגמא ההכנה היא קריטית להצלחה של כל מחקר במיקרוסקופ אלקטרונים. קיבוע קונבנציונלי EM היה השיטה העיקרית לתיקון רקמות או תאים במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) 1. ראשית, אלדהידים ו tetroxide אוסמיום משמשים כדי לתקן את חומר כימי בטמפרטורת החדר. ואז, החומר הוא מיובש עם ממיסים אורגניים, חדרו, ומוטבעים שרף אפוקסי. שיטה זו תלויה בשיעור החדירה של fixatives לתוך התא. כתוצאה מכך, הממצאים והפקת תכני הסלולר בדרך כלל הם נצפו 2. Cryofixation הוא בבירור אלטרנטיבה טובה יותר לשימור מבנים הסלולר 3, להשאיר אותן ללא פגע. האיכות הגבוהה ביותר של תמונות TEM 4 בסעיפי שרף דקים ניתן להשיג באמצעות שיטת החלפת cryofixation / ההקפאה. מטרת טכניקה זו היא להשיג דו מזוגגתדגימות ological ללא היווצרות גבישי קרח או גבישי קרח המכילים קטנים מספיק כדי לא לפגוע ultrastructure של התאים. בלחץ גבוה הקפאה (HPF) ו cryofixation אולטרה-מהירה, אשר נקרא גם לצלול מקפיא (PF), הן שתי שיטות cryofix דגימות. HPF שמגביל מולקולות בתא מיידי ונמנע את הנזק שנגרם על ידי קיבוע EM קונבנציונאלי. ישנם מספר סוגים של מכונות הקפאה והתקני החלפה אוטומטיות פותחו 5. מכונות ההקפאה ומתכלה (החנקן נוזלי, דגימת ספקים, וכו &#39;) הם יקרים, אבל הם מאפשרים הפקת micrographs אלקטרונים איכותי 6, 7. PF היא טכניקה ששימשה בשנת 1950 המוקדמות והוא מתואר בספרות פשוטה וזולה 8 .During ההליך PF, המדגם מוכן קפוא בקצב מהיר כדי להשיג גבישי קרח במידות פחות מ 3 עד 5 ננומטר. לשם כך, המדגם הואצלל לתוך קריוגן נוזלי, כגון אתאן, פרופאן, או תערובת אתנית- propane. מאז 1950, שיפורים של PF נעשו כדי להפוך את הטכניקה הזו זמינה למספר גדול יותר של משתמשים. הקפאה בלחץ גבוה היא כרגע הדרך קיימא רק להקפיא מגוון רחב של דגימות עבה יותר מ 50 מיקרומטר (עד עובי של 200 מיקרומטר עבור דגימות בצורת דיסק) 5 , ואילו PF נעשה שימוש נרחב על התמונה אובייקטים קטנים (&lt;100 ננומטר ), כגון קומפלקסים macromolecular מושעה בסרט דק של קרח אמורפי 9 . דגימות גדולות יותר, למשל תאים אוקריוטים, יכולים להיות cryofixed על ידי PF, אבל דורש מחזיקי הדגימה, כגון צינורות נחושת נימי או מערכות כריך 8 , 10 , 11 . הנה, מהיר לשימוש, קל לשימוש ו עלות נמוכה לצלול להקפיא / להקפיא, תחליף הטכנולוגיה שמיש עבור תרבויות תאים ההשעיה שונים מוצג.

<table><tbody><tr><td>רשתות</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>פרופאן N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חנקן</td><td></td><td></td><td></td>נוזלי</tr> מחט <tr><td>חיתוך קצה כפול</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>19130</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון זכוכית 8.5 מ"ל</td><td>מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים</td><td>64252</td><td></td></tr><tr><td>אורניל אצטט</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>48851</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>סיגמא</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 100%</td> <td>סיגמא</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td>VWR בינלאומי</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שרף אקרילי</td> מדעי <td>מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>שרף אפוקסי M</td><td>Sigma</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>שרף אפוקסי M מקשה</td><td>Sigma</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>דיבוטיל פטלאט&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>שרף אפוקסי M מאיץ</td><td>סיגמא</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>גבישי</td><td>פישר מדעי</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>נייר יוסף</td><td>VWR בינלאומי</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>כוסות</td><td></td><td></td> פליז <td>עשה זאת בעצמך חנות או מיוצר בעצמך</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shizosacharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leishmania amazonensis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קופסה אטומה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>7135-0001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מכונת הנשמה לטיהור אוויר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>3M 7502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מחסנית למכונת הנשמה</td><td>פישר מדעי</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>מסנן חלקיקים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>3M 5N11&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

הילוכי אלקטרונים מיקרוסקופים (TEM) הוא כלי יוצא דופן לחקר ultrastructure תא, כדי למקם חלבונים ולדמיין מתחמי macromolecular ברזולוציה גבוהה מאוד. עם זאת, כדי להתקרב ככל האפשר אל למצב הטבעי, שימור מדגם מושלם נדרש. קיבוע במיקרוסקופ אלקטרונים קונבנציונאלי (EM) עם אלדהידים, למשל, אינו מספק שימור ultrastructural טוב. החדירה האיטית של fixatives גורמת ארגון מחדש תאים ואובדן מרכיבי תא שונים. לכן, קיבוע EM קונבנציונאלי אינו מאפשר התייצבות מיידית ושימור מבנים antigenicity. הבחירה הטובה ביותר לבחינת אירועים תאיים היא להשתמש cryofixation ואחריו שיטת קיבוע הקפאה-ההחלפה שמחזיקה תאים במצב הטבעי שלהם. בלחץ גבוה הקפאה / להקפיא-החלפה, השומרת על שלמות ultrastructure הסלולר, היא השיטה הנפוצה ביותר, אך דורשת expensive ציוד. הנה, שיטת קיבוע הקפאה קלה לשימוש וזול ואחריו-החלפת הקפאה עבור תרביות תאי השעיה מוצגת.

במאמר זה, שיטת הקפאה קלה לשימוש וזול צעד עבור ultrastructural (איורים 1 ו איור 2) ו immunolabeling (איור 3) מחקרים מוצגת. אנו מראים כי אין זה הכרחי כדי לקבל ציוד מיוחד עבור הליך הקפאה-ההחלפה וכי הליך ההתחממות לוקח פחות מ 6 ח במקום 24 h באמצעות מערכת ייעודית. ש...

כתב יד זה מתאר שיטה קלה לשימוש בעלות הנמוכה cryofixation המאפשרת הדמית תאי השעיה ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים.

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

מטרת הניסויים הבאים היא להציע כלי למחקרי אולטרה-מבניים ואימונולוקליזציה של תאי תרחיף להדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. טכניקה זו קלה לשימוש, בעלות נמוכה ומעניקה שימור מצוין של המבנה התאי. זוהי תרבות של תאי השעיה.ראשית, התאים נקצרים על ידי צנטריפוגות שונות כדי להשיג גלולה בצינור מיקרו-צנטריפוגה. בשלב השני, הדגימה מוקפאת במהירות על ידי הקפאת צלילה המשתקת את התאים ומגבילה את היווצרות גבישי הקרח. לאחר מכן, החלפת הקפאה מתבצעת על מנת להחליף מים בממס המכיל אוסמיום טטרוקסיד כקיבוע לייצוב מבני התאים.התוצאות מראות כי הקפאת צלילה והחלפת הקפאה, משמרים בצורה מושלמת את תשתית התאים. קיבוע כימי היה שיטה עיקרית לקיבוע רקמות או תאים למיקרוסקופ אלקטרונים הולכה, אך בשיטה זו נצפים בדרך כלל חפצים ומיצוי תוכן תאי. אלטרנטיבה לקיבוע כימי היא קריופיקציה.שיטה זו מייצגת את הבחירה הטובה ביותר לייצור האיכות הגבוהה ביותר של מורפולוגיה בקטעי שרף דקים. הקפאת צלילה היא טכניקת הקפאה המשתקת מולקולות בתא באופן מיידי כדי למנוע נזק הנגרם על ידי קיבוע כימי קונבנציונלי. לפני הקפאת הדגימה, יש להכין רשת חתוכה בסרט Formvar שתשמש כתמיכה להקפאה.מגלשת זכוכית פולנית עם מטלית נטולת מוך עד שהיא מבריקה ומנגבת. טובלים את שקופית הזכוכית בתמיסה של Formvar 0.3% בכלורופורם מספר שניות ומניחים לייבוש זקוף בכוס. יש לממש מניפולציה מתחת למכסה אדים באמצעות ציוד מגן אישי עקב נוכחות כלורופורם.לאחר מילוי מגבש במים מזוקקים, העבירו מעל פני המים מוט זכוכית להסרת אבק. כאשר הסרט יבש, קלעו את הקצוות בעזרת סכין גילוח חד כדי שהסרט יוכל להתרומם. הקפיאו את המגלשה על ידי נשיפה כבדה על המגלשה כדי לקבל שכבה של אדי מים על הסרט.צף מיד את הסרט על פני המים על ידי נגיעה בתחתית המגלשה בזווית של כ-30 מעלות לפני המים. הורד לאט את השקופית לתוך האמבטיה, והקניט את הסרט לפי הצורך. סרט הפורמוואר מתיישב לאט על פני המים.חבר את הסרט בקצה המגבש בעזרת פינצטה. הניחו בעדינות את 400 רשתות הנחושת עם הפנים כלפי מטה על הסרט באזורים בעובי המתאים וללא קמטים. הסרט עם הרשתות נאסף על ידי כיסויים בנייר ג'וזף בזמן שהם צפים על פני המים.הרם את קצה נייר ג'וזף והסרט עם הרשתות אמור להגיע איתו. אל תתנו לאצבעותיכם לגעת במשטח המים או שאתם מסתכנים בהשארת סרט במים. הניחו לרשתות להתייבש מספר שעות לפני השימוש בהן.למחקרים אולטרה-מבניים, הכניסו אמפולה אוסמיום טטרוקסיד לבקבוק זכוכית. מנערים היטב את הבקבוק כדי לשבור את האמפולה. הוסף נפח מתאים של אצטון 100%כדי לקבל ריכוז סופי של 4%מערבבים את הבקבוק המכיל את מדיום החלפת ההקפאה, ומחלקים 1.5 מיליליטר aliquots לתוך קריוביאלים עם פיפט העברת פלסטיק.סוגרים את כל הכובעים ושומרים במקפיא במינוס 84 מעלות לפני השימוש. למחקרי תיוג חיסוני של חלבונים, הכינו 0.1% של אורניל אצטט באצטון. כאשר התמיסה מתבהרת, יש לסנן באמצעות מסנן של 0.2 מיקרומטר ולהוציא 1.5 מיליליטר לתוך קריוביאלים.שומרים במקפיא במינוס 84 מעלות לפני השימוש. כדי לוודא שיש את העקביות המתאימה של כדורים מסוגי תאים שונים, תאי שמרים גולמיים במינימום של מדיום נוזלי שלם כדי להשיג אחד 10 עד תשעת התאים. Escherichia coli במדיום DTY כדי להשיג חמישה תאי חיידקים 10 עד 10.Leishmania flagellum במדיום AM ו-Trypanosoma brucei במדיום SDM79 כדי להשיג חמישה 10 עד שמונה תאי טפיל. העבירו את מדיום התרבות המכיל תאי השעיה לצינור פרופילן של 50 מיליליטר וצנטריפוגה למשך שלוש דקות בחום של 1, 500 גרם. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים בהתאמה.צנטריפוגה בצינור מיקרו-צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-3, 900 גרם. הסר את הסופרנטנט לחלוטין. לשיטת הקפאת צלילה יש להשתמש בבקבוק פרופאן עם צינור המחובר לגליל הפרופאן.פרופאן הוא חומר נפץ פוטנציאלי, הבינו את הנזילות בחדר מאוורר היטב או במכסה אדים. אסור להדליק אש גלויה. יש ללבוש תמיד ציוד מגן אישי כולל כפפות קריוגלבה בעת שימוש בחנקן נוזלי.שים כמות קטנה של חנקן נוזלי במגש פוליסטירן. מניחים את הפליז בחנקן נוזלי. מופיעות בועות.המתן עד שהבועות ישככו. לאחר מכן מקפיאים את הפליז. הכנס את הצינור המחובר לגליל הפרופאן במגע עם דופן מכסה הפליז.פתח בעדינות את שסתום צילינדר הפרופאן. הרבה עשן נוצר מכיוון שפרופאן לא מתחיל להתנזל. כאשר הפרופאן מתחיל להתנזל, העשן נעלם.עצור את הנזילות על ידי סגירת שסתום צילינדר הפרופאן והסרה מהירה של הצינור המחובר לגליל הפרופאן. מלאו את מגש הפוליסטירן בחנקן נוזלי עד חמישה מילימטרים מהחלק העליון של הפליז. הקפיאו כוסות פליז קטנות בהן נחליף את הדגימה לאחר ההקפאה על ידי הכנסתן לחנקן נוזלי.שים אחת לדגימה אחת. היזהר לא לערבב דוגמאות. כדי להשיג את העקביות המתאימה של הגלולה, יש צורך לכבד את תנאי התרבות ופרמטרי הצנטריפוגה שצוינו קודם לכן.הקפיאו את הפינצטה לפני השימוש בהם. קח רשת מיקרוסקופיה נחושת של 400 רשת חתוכה עם Formvar. צלול מחט חיתוך כפולה בגלולה.הניחו, בעזרת הכלי, טיפת גלולה על הרשת. מהר מאוד צוללים את הרשת לפרופאן נוזלי ומערבבים מספר שניות. העבירו במהירות את הרשת הקפואה בכוס הפליז הקטנה.עבור כל דגימה, צור לפחות שלוש רשתות. אל תשכח להקפיא את הפינצטה לפני שאתה לוקח רשת. הקפיאו את הפינצטה לפני השימוש בהם.הסר במהירות את הכוס והעביר את הרשתות הקפואות לתוך הקריוביאל באמצעות הפינצטה. החזר את הכובע לקריוביאל. חזור על הפעולה עבור כל רשת של כל דגימה.סוגרים את האותיות ומערבבים את הקריוביאל כדי לוודא שהדגימות נמצאות במדיום החלפת הקפאה. הניחו לקריוביאל למשך שלושה ימים במקפיא מינוס 84 מעלות. נשא את הקריוביאלים במגש פוליסטירן כדי למנוע עלייה פתאומית בטמפרטורה למקפיא מינוס 30 מעלות.תנו לשעה אחת במינוס 30 מעלות. נשא את הקריוביאלים במינוס 15 מעלות למשך שעתיים, ואז שים את הדגימות על ארבע מעלות למשך שעתיים, ו-30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את אמצעי החלפת ההקפאה באמצעות פיפטות העברה מפלסטיק והכניס אותו לבקבוק פסולת מתאים שזוהה בבירור.שים כ -500 מיקרוליטר של 100% אצטון. פתח את בקבוקון הזכוכית וערבב את הקריוביאל והכניס במהירות את מדיום החלפת ההקפאה לבקבוקון זכוכית. יש לשטוף קריוביאל אחד עם 100% אצטון.שוטפים שלוש פעמים 10 דקות עם 100% אצטון. נשא את הקריוביאלים במגש פוליסטירן כדי למנוע עלייה פתאומית בטמפרטורה למקפיא מינוס 30 מעלות. תנו לשעתיים במינוס 30 מעלות.לאחר הכנסת דגימות לבקבוקון פוליפרופילן, החלף את מדיום החלפת ההקפאה במדיום החלפת הקפאה טרי ותן לשעתיים במינוס 30 מעלות. יש לשטוף שעה אחת עם 100% אצטון ושלוש פעמים שעה עם 100% אתנול. שיטת החלפת הקפאה/הקפאה של צלילה הביאה לשימור מצוין של המבנים התוך-תאיים של תאי ההשעיה.ב- Saccharomyces cerevisiae, המבנים אינם מכווצים והציטופלזמה נראית צפופה. יתר על כן, הממברנות חלקות, וזו הוכחה לשימור טוב. ניתן לזהות בצורה מושלמת את כל האברונים, כגון גרעין, מיטוכונדריה ווואקואולים.השתמרות מצוינת נצפתה גם ב-Leishmania flagellum, Trypanosoma brucei ו-Escherichia coli. בגרעין, קרום כפול היוצר מעטפת גרעינית, נקבוביות גרעיניות, גוף קוטב ציר וריבוזומים המחוברים על הממברנה החיצונית של המעטפת הגרעינית נראים בבירור. במיטוכונדריה, פלישות הממברנה הפנימית, הנקראות cristae, נראות בבירור.אברונים קריטיים הם הוואקואולים, מכיוון שגבישי קרח גדולים יכולים להתפתח בקלות. בתמונה, ואקואולים נשמרים בצורה מושלמת ללא נזק לגביש קרח. ניתן להשתמש בשיטת החלפת הקפאה/הקפאה בצלילה גם לביצוע אימונולוקליזציה של חלבונים.ההליך שומר בצורה מושלמת על אנטיגניות החלבון, וכאברונים מזוהים בבירור. נוגדנים שונים כבר נבדקו כדי להתמקד בחלבונים שונים בשמרים, כגון אנטי-ATP סינתאז ואנטי-פורין. ניסוי כזה אפשרי גם עבור מערכות ניסוי שונות, כמו בלישמניה, שם חלבון הפלברין היה מקומי.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דגימות בשיטת החלפת הקפאה/הקפאה של צלילה להדמיה שלהן במיקרוסקופ אלקטרונים שידור. טכניקה זו מהירה, קלה לשימוש, בעלות נמוכה ומעניקה שימור מצוין של תשתיות התאים. היזהר עם חנקן נוזלי, אך במיוחד עם אוסמיום טטרוקסיד ואורניל אצטט.יש לטפל בהם במכסה האדים תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, כולל מעיל מעבדה וכפפות.

plunge-freezing-tool-for-ultrastructural-immunolocalization-studies

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנחנו כאן להמחיש כיצד להשתמש אלקטרונים cryotomography (ECT) כדי ללמוד את ultrastructure של תאים חיידקיים של כמעט ילידי מדינות, כדי "macromolecular" (~ 4 ננומטר) החלטה.

אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים

כדי לשמר את התהליכים עצביים לניתוח ultrastructural, אנו מתארים פרוטוקול לציפוי של נוירונים העיקרי ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבזק הקפאה, מניב דגימות טהורים בשכבה של קרח זגוגי. ניתן לבחון דגימות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-לדמיין מבנים בקנה המידה ננומטרי.

הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

טכניקות וחידודים של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות וננו לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים בסיסיים מתוארות. טכניקה זו היא שיטה מועדפת לחשיפת תכונות והתמחויות של ממברנות ביולוגיות ultrastructural ולקבלת נתונים ממדיים ומרחבי רמת ultrastructural במדעי חומרים ומוצרי ננוטכנולוגיה.

טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים

השגת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באיכות גבוהה היא מאתגרת, במיוחד במקרה של תאי צמחים, שיש להם שפע של ואקואולים גדולים מלאים במים וחללים מאווררים. הקפאה בלחץ גבוה טנדם והחלפת הקפאה מהירה מפחיתים מאוד את זמן ההכנה של דגימות צמחים ל-TEM תוך הפקת דגימות עם שימור אולטרה-מבני מעולה.

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

פתחנו שיטה חדשנית במיקרוסקופ אלקטרונים, "פלאש-ו-הקפאה," המאפשרת ויזואליזציה של דינמיקה הממברנה עם רזולוצית ms זמנית. טכניקה זו משלבת את גירוי optogenetic של נוירונים עם מקפיא בלחץ גבוה. הנה, אנחנו מדגימים את הנהלים לתאר את הפרוטוקולים בפירוט.

פלאש-ו-Freeze: שיטה חדשנית לכידה Dynamics ממברנה עם מיקרוסקופית אלקטרונים

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור תרבות התא על ממברנות הסיליקון ניטריד ו-לקפוא לפני לפני הדמיה רנטגן קרני הקרינה עם סינכרוטרון nanoprobe רנטגן הקריוגני. כאשר רק טמפרטורת החדר בניתוח ננו מסופק, הדגימות הקפואות יכול להיות נוסף מיובש להקפיא. אלה הם צעדים קריטיים כדי לקבל מידע על הרכב היסודות תאיים.

תרבות התא על ממברנות הסיליקון נידהר וקריופיקציה עבור סינכרוטרון X-ray פלואורסצנטית ננו-ניתוח

כאן, מוצג פרוטוקול המתאר את שלבי הכנת הדגימה ואיסוף הנתונים הנדרשים בטומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של cryo (SXT) כדי לדמות את מבנה האולטרה-מבנה של תאים שלמים שהשתמרו בקריו ברזולוציה של 25 ננומטר חצי גובה.

תיאור קרטוגרפי תלת-ממדי של התא על ידי טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של Cryo

כאן אנו מראים כיצד להשתמש במכשיר הקפאת הכריך להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים בתרבית, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. אנו גם מראים כיצד להכין דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה.

הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים

כתב יד זה מתאר את שיטת הכתם וצלילה להקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד.

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

כאן, אנו מציגים צינור לכרסם קרן יונים ממוקדת מתאם תלת-ממדי על הנחיית הכנת דגימות תאיות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. המיקום התלת-ממדי של חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי נקבע תחילה על ידי מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, ולאחר מכן מיועד לכרסום. הפרוטוקול מתאים לתאי יונקים, שמרים וחיידקים.

הכנת הדגימה על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת תלת-ממדית לטומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה

פרוטוקול וידאו זה ממחיש כיצד לבצע טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור סריקה של דגימות וירולוגיה. לקבלת תוצאות מיטביות, הדגימות מוכנות על ידי הקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה לאחר מכן.

סריקת טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בווירולוגיה: הדמיה תלת מימדית של דגימות קפואות בלחץ גבוה, שהוחלפו בהקפאה

למדו שיטת קיפאון פלאנג לתאי תלייה במיקרוסקופ אלקטרונים חודר. שיטה זו שומרת היטב על מבנה תאים ומאפשרת מחקרים אולטרה-מבניים ואימונולוקליזציה ביעילות ובעלות נמוכה.

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

גלה סרטונים נוספים