מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

מטרת הניסויים הבאים היא להציע כלי למחקרי אולטרה-מבניים ואימונולוקליזציה של תאי תרחיף להדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. טכניקה זו קלה לשימוש, בעלות נמוכה ומעניקה שימור מצוין של המבנה התאי. זוהי תרבות של תאי השעיה.

ראשית, התאים נקצרים על ידי צנטריפוגות שונות כדי להשיג גלולה בצינור מיקרו-צנטריפוגה. בשלב השני, הדגימה מוקפאת במהירות על ידי הקפאת צלילה המשתקת את התאים ומגבילה את היווצרות גבישי הקרח. לאחר מכן, החלפת הקפאה מתבצעת על מנת להחליף מים בממס המכיל אוסמיום טטרוקסיד כקיבוע לייצוב מבני התאים.

התוצאות מראות כי הקפאת צלילה והחלפת הקפאה, משמרים בצורה מושלמת את תשתית התאים. קיבוע כימי היה שיטה עיקרית לקיבוע רקמות או תאים למיקרוסקופ אלקטרונים הולכה, אך בשיטה זו נצפים בדרך כלל חפצים ומיצוי תוכן תאי. אלטרנטיבה לקיבוע כימי היא קריופיקציה.

שיטה זו מייצגת את הבחירה הטובה ביותר לייצור האיכות הגבוהה ביותר של מורפולוגיה בקטעי שרף דקים. הקפאת צלילה היא טכניקת הקפאה המשתקת מולקולות בתא באופן מיידי כדי למנוע נזק הנגרם על ידי קיבוע כימי קונבנציונלי. לפני הקפאת הדגימה, יש להכין רשת חתוכה בסרט Formvar שתשמש כתמיכה להקפאה.

מגלשת זכוכית פולנית עם מטלית נטולת מוך עד שהיא מבריקה ומנגבת. טובלים את שקופית הזכוכית בתמיסה של Formvar 0.3% בכלורופורם מספר שניות ומניחים לייבוש זקוף בכוס. יש לממש מניפולציה מתחת למכסה אדים באמצעות ציוד מגן אישי עקב נוכחות כלורופורם.

לאחר מילוי מגבש במים מזוקקים, העבירו מעל פני המים מוט זכוכית להסרת אבק. כאשר הסרט יבש, קלעו את הקצוות בעזרת סכין גילוח חד כדי שהסרט יוכל להתרומם. הקפיאו את המגלשה על ידי נשיפה כבדה על המגלשה כדי לקבל שכבה של אדי מים על הסרט.

צף מיד את הסרט על פני המים על ידי נגיעה בתחתית המגלשה בזווית של כ-30 מעלות לפני המים. הורד לאט את השקופית לתוך האמבטיה, והקניט את הסרט לפי הצורך. סרט הפורמוואר מתיישב לאט על פני המים.

חבר את הסרט בקצה המגבש בעזרת פינצטה. הניחו בעדינות את 400 רשתות הנחושת עם הפנים כלפי מטה על הסרט באזורים בעובי המתאים וללא קמטים. הסרט עם הרשתות נאסף על ידי כיסויים בנייר ג'וזף בזמן שהם צפים על פני המים.

הרם את קצה נייר ג'וזף והסרט עם הרשתות אמור להגיע איתו. אל תתנו לאצבעותיכם לגעת במשטח המים או שאתם מסתכנים בהשארת סרט במים. הניחו לרשתות להתייבש מספר שעות לפני השימוש בהן.

למחקרים אולטרה-מבניים, הכניסו אמפולה אוסמיום טטרוקסיד לבקבוק זכוכית. מנערים היטב את הבקבוק כדי לשבור את האמפולה. הוסף נפח מתאים של אצטון 100%כדי לקבל ריכוז סופי של 4%מערבבים את הבקבוק המכיל את מדיום החלפת ההקפאה, ומחלקים 1.5 מיליליטר aliquots לתוך קריוביאלים עם פיפט העברת פלסטיק.

סוגרים את כל הכובעים ושומרים במקפיא במינוס 84 מעלות לפני השימוש. למחקרי תיוג חיסוני של חלבונים, הכינו 0.1% של אורניל אצטט באצטון. כאשר התמיסה מתבהרת, יש לסנן באמצעות מסנן של 0.2 מיקרומטר ולהוציא 1.5 מיליליטר לתוך קריוביאלים.

שומרים במקפיא במינוס 84 מעלות לפני השימוש. כדי לוודא שיש את העקביות המתאימה של כדורים מסוגי תאים שונים, תאי שמרים גולמיים במינימום של מדיום נוזלי שלם כדי להשיג אחד 10 עד תשעת התאים. Escherichia coli במדיום DTY כדי להשיג חמישה תאי חיידקים 10 עד 10

Leishmania flagellum במדיום AM ו-Trypanosoma brucei במדיום SDM79 כדי להשיג חמישה 10 עד שמונה תאי טפיל. העבירו את מדיום התרבות המכיל תאי השעיה לצינור פרופילן של 50 מיליליטר וצנטריפוגה למשך שלוש דקות בחום של 1, 500 גרם. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים בהתאמה.

צנטריפוגה בצינור מיקרו-צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-3, 900 גרם. הסר את הסופרנטנט לחלוטין. לשיטת הקפאת צלילה יש להשתמש בבקבוק פרופאן עם צינור המחובר לגליל הפרופאן.

פרופאן הוא חומר נפץ פוטנציאלי, הבינו את הנזילות בחדר מאוורר היטב או במכסה אדים. אסור להדליק אש גלויה. יש ללבוש תמיד ציוד מגן אישי כולל כפפות קריוגלבה בעת שימוש בחנקן נוזלי.

שים כמות קטנה של חנקן נוזלי במגש פוליסטירן. מניחים את הפליז בחנקן נוזלי. מופיעות בועות.

המתן עד שהבועות ישככו. לאחר מכן מקפיאים את הפליז. הכנס את הצינור המחובר לגליל הפרופאן במגע עם דופן מכסה הפליז.

פתח בעדינות את שסתום צילינדר הפרופאן. הרבה עשן נוצר מכיוון שפרופאן לא מתחיל להתנזל. כאשר הפרופאן מתחיל להתנזל, העשן נעלם.

עצור את הנזילות על ידי סגירת שסתום צילינדר הפרופאן והסרה מהירה של הצינור המחובר לגליל הפרופאן. מלאו את מגש הפוליסטירן בחנקן נוזלי עד חמישה מילימטרים מהחלק העליון של הפליז. הקפיאו כוסות פליז קטנות בהן נחליף את הדגימה לאחר ההקפאה על ידי הכנסתן לחנקן נוזלי.

שים אחת לדגימה אחת. היזהר לא לערבב דוגמאות. כדי להשיג את העקביות המתאימה של הגלולה, יש צורך לכבד את תנאי התרבות ופרמטרי הצנטריפוגה שצוינו קודם לכן.

הקפיאו את הפינצטה לפני השימוש בהם. קח רשת מיקרוסקופיה נחושת של 400 רשת חתוכה עם Formvar. צלול מחט חיתוך כפולה בגלולה.

הניחו, בעזרת הכלי, טיפת גלולה על הרשת. מהר מאוד צוללים את הרשת לפרופאן נוזלי ומערבבים מספר שניות. העבירו במהירות את הרשת הקפואה בכוס הפליז הקטנה.

עבור כל דגימה, צור לפחות שלוש רשתות. אל תשכח להקפיא את הפינצטה לפני שאתה לוקח רשת. הקפיאו את הפינצטה לפני השימוש בהם.

הסר במהירות את הכוס והעביר את הרשתות הקפואות לתוך הקריוביאל באמצעות הפינצטה. החזר את הכובע לקריוביאל. חזור על הפעולה עבור כל רשת של כל דגימה.

סוגרים את האותיות ומערבבים את הקריוביאל כדי לוודא שהדגימות נמצאות במדיום החלפת הקפאה. הניחו לקריוביאל למשך שלושה ימים במקפיא מינוס 84 מעלות. נשא את הקריוביאלים במגש פוליסטירן כדי למנוע עלייה פתאומית בטמפרטורה למקפיא מינוס 30 מעלות.

תנו לשעה אחת במינוס 30 מעלות. נשא את הקריוביאלים במינוס 15 מעלות למשך שעתיים, ואז שים את הדגימות על ארבע מעלות למשך שעתיים, ו-30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את אמצעי החלפת ההקפאה באמצעות פיפטות העברה מפלסטיק והכניס אותו לבקבוק פסולת מתאים שזוהה בבירור.

שים כ -500 מיקרוליטר של 100% אצטון. פתח את בקבוקון הזכוכית וערבב את הקריוביאל והכניס במהירות את מדיום החלפת ההקפאה לבקבוקון זכוכית. יש לשטוף קריוביאל אחד עם 100% אצטון.

שוטפים שלוש פעמים 10 דקות עם 100% אצטון. נשא את הקריוביאלים במגש פוליסטירן כדי למנוע עלייה פתאומית בטמפרטורה למקפיא מינוס 30 מעלות. תנו לשעתיים במינוס 30 מעלות.

לאחר הכנסת דגימות לבקבוקון פוליפרופילן, החלף את מדיום החלפת ההקפאה במדיום החלפת הקפאה טרי ותן לשעתיים במינוס 30 מעלות. יש לשטוף שעה אחת עם 100% אצטון ושלוש פעמים שעה עם 100% אתנול. שיטת החלפת הקפאה/הקפאה של צלילה הביאה לשימור מצוין של המבנים התוך-תאיים של תאי ההשעיה.

ב- Saccharomyces cerevisiae, המבנים אינם מכווצים והציטופלזמה נראית צפופה. יתר על כן, הממברנות חלקות, וזו הוכחה לשימור טוב. ניתן לזהות בצורה מושלמת את כל האברונים, כגון גרעין, מיטוכונדריה ווואקואולים.

השתמרות מצוינת נצפתה גם ב-Leishmania flagellum, Trypanosoma brucei ו-Escherichia coli. בגרעין, קרום כפול היוצר מעטפת גרעינית, נקבוביות גרעיניות, גוף קוטב ציר וריבוזומים המחוברים על הממברנה החיצונית של המעטפת הגרעינית נראים בבירור. במיטוכונדריה, פלישות הממברנה הפנימית, הנקראות cristae, נראות בבירור.

אברונים קריטיים הם הוואקואולים, מכיוון שגבישי קרח גדולים יכולים להתפתח בקלות. בתמונה, ואקואולים נשמרים בצורה מושלמת ללא נזק לגביש קרח. ניתן להשתמש בשיטת החלפת הקפאה/הקפאה בצלילה גם לביצוע אימונולוקליזציה של חלבונים.

ההליך שומר בצורה מושלמת על אנטיגניות החלבון, וכאברונים מזוהים בבירור. נוגדנים שונים כבר נבדקו כדי להתמקד בחלבונים שונים בשמרים, כגון אנטי-ATP סינתאז ואנטי-פורין. ניסוי כזה אפשרי גם עבור מערכות ניסוי שונות, כמו בלישמניה, שם חלבון הפלברין היה מקומי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דגימות בשיטת החלפת הקפאה/הקפאה של צלילה להדמיה שלהן במיקרוסקופ אלקטרונים שידור. טכניקה זו מהירה, קלה לשימוש, בעלות נמוכה ומעניקה שימור מצוין של תשתיות התאים. היזהר עם חנקן נוזלי, אך במיוחד עם אוסמיום טטרוקסיד ואורניל אצטט.

יש לטפל בהם במכסה האדים תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, כולל מעיל מעבדה וכפפות.