מדידת הניטריט ו חנקתי, מטבוליטים במסלול תחמוצת החנקן, חומרים ביולוגיים באמצעות שיטה chemiluminescence

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בכימילומינסנציה כדי לכמת תחמוצת החנקן בדגימות ביולוגיות על ידי כימות רמות של ניטריט וחנקה, באמצעות תמיסות להפחתת טריודידים ונדיום-כלוריד. פרוטוקול זה מספק כלי רב עוצמה למעקב אחר חילוף החומרים והאיתות של תחמוצת החנקן, הן אזורית והן אורכית ממגוון דגימות ביולוגיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות והרגישות הגבוהה שלה.

מי שתדגים את ההליך הזה תהיה קטלין קאסל, עמיתת IRTA שלנו. היא תראה לנו כיצד למדוד ניטריט על ידי כימילומינסנציה יחד עם תמיסת טריודיד. כדי להתחיל, הכינו תמיסה לשימור ניטריט.

הכן תמיסה המכילה NEM אחד של 118 מילי-מולרית ו-890 מילי-מולרית אשלגן-פרוציאניד במים מזוקקים. ממיסים את המוצקים עד שהתמיסה צהובה צלולה ללא גבישים. לאחר מכן הוסף פתרון זה ל-NP 40 ביחס של 9 ל-1 נפח לפי נפח.

מערבבים את התמיסה בעדינות כדי למנוע קצף. לעולם אל תערבב את התערובת הזו. ניתן להשתמש בתמיסת שימור הניטריט למשך כשבוע אם היא מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

ניתן להשתמש בפרוטוקול על דגימות ביולוגיות רבות שהושגו לאחרונה. במקרה זה דם טרי שנלקח צנטריפוגה כדי לקבל דגימת פלזמה לבדיקה. חשוב מאוד לעבד דם או כל דגימות ביולוגיות שמכילות כמות גדולה של חלבוני הם, כמו למשל המוגלובין או מיוגלובין, במהירות האפשרית, מאחר שחלבוני הם יגיבו עם הניטריט, ויהרסו את הניטריט.

כעת, על מנת לשמר את רוב הניטריט האנדוגני בדם, ערבבו מיד את הפלזמה עם תמיסה משמרת ניטריט ביחס של 1 עד 4 נפח בנפח. בכל שלב של הכנה זו, ניתן להקפיא את הדגימה על קרח יבש. כדי לנטרל את הדגימה, ערבבו אותה עם חלק שווה של מתנול קר.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-13000 גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לזרז חלבונים. קח את הסופרנטנט והשתמש בו למדידת ניטריט. עבור מידה רגישה של ניטריט, תמיסה להפחתת טריודידים נחשבת ליעילה ביותר.

בעת הכנתו, וודאו שכל הגבישים מתמוססים. שמור את התמיסה בבקבוק כהה והשתמש בה תוך שבוע מההכנה. תמיסה להפחתת ונדיום-כלוריד מציעה את הדיוק הרב ביותר למדידת חנקה.

תמיסה מיקרו-מולרית של ניטריט משמשת לקביעת העקומה הסטנדרטית עבור ניטריט, כמו גם חנקה. הגדר את מנתח תחמוצת החנקן בהתאם להוראות היצרן. ראשית, פתחו את מיכל החמצן, הפעילו את המכשיר וחברו אותו למלכודת חומצה, המכילה נתרן הידרוקסיד מולארי אחד.

לאחר מכן, פתח את מיכל ההליום, ולאחר מכן חבר את תא תגובת הזכוכית למיכל ההליום. כעת, טען את תא התגובה בתמיסת טריודיד למדידת ניטריט. הוסף חומר אנטי מקציף.

התאם את קצב זרימת הגז כדי להאט את הבעבוע. ואז חבר את מלכודת החומצה לתא התגובה. באמצעות ניסוי וטעייה, התאם את זרימת ההליום בצורה נכונה, כך שתתאים ליניקת המכשיר.

כעת, הפעל את תוכנת הנוזל המבוססת על תכנות חזותי. ראשית, אפשר תקשורת בין המכשיר לתוכנת הרכישה מתפריט נתונים, ואז מהתפריט הראשי בלוח הקדמי התחל את הניתוח. המתן עד שמצנן מכפיל הפוטו יתקרר מתחת למינוס 12 מעלות צלזיוס, ועד שהפוטו-מכפיל יתייצב.

לאחר כ-30 דקות, קו הבסיס יתייצב לטווח של 1 או 2 מילי-וולט. יציבות הערך היא קריטית, לא הערך עצמו. לאחר שהמנתח התייצב, השתמש במזרק המילטון שטוף היטב כדי להזריק תמיסות.

ראשית, יש להזריק לפחות שלושה נפחים שונים של תקן הניטריט המיקרו-מולרי 1. הזרקו את התמיסות לתמיסת ההפחתה דרך המחיצה. הזריק כל תקן או דגימה פעמיים.

אם צפויות רמות ודגימות ניטריט גבוהות, שקול להזריק נפח רביעי גדול של תמיסת ניטריט סטנדרטית לקביעה טובה יותר של שיפוע העקומה הסטנדרטית. התבונן תמיד בפלט והמתן עד שהמנתח יתייצב מחדש לקו הבסיס לפני הזרקת הדגימה הבאה. זה לוקח לפחות דקה.

השתמש בנפחי דגימה שמגיעים לשיא מתחת ל-700 מילי-וולט לקבלת תוצאות מדויקות. בין הריצות יש לשטוף היטב את המזרק במים נטולי יונים. חשוב מאוד לשטוף את המזרק ביסודיות.

לאחר ביצוע כל המדידות, לחץ על אפשרות העצירה בתוכנה. הנתונים יישמרו אוטומטית. לחיצה על ביטול תסיים את המדידה מבלי לשמור את הנתונים.

סגור את זין העצירה על גבי כלי התגובה ונתק את הצינור המחבר בין מלכודת החומצה לכלי התגובה. לאחר הניסוי, העבר את המנתח למצב המתנה. לחץ על ניתוח בלוח הראשי ואשר שהוא נכנס למצב המתנה.

לאחר מכן, כבה את אספקת החמצן. נתק את הצינורות ממיכל ה-O2 למלכודת חומצה. לאחר מכן שטפו את תמיסת הטריודיד באמצעות הליום.

לאחר מכן, סגור ונתק את מיכל ההליום מכלי תגובת הזכוכית. לבסוף, נקו את הכלי באמצעות אתנול ומים לפי הצורך. תקני בדיקה יחד עם דגימות פלזמה מראים כי מיד לאחר הזרקתם, מתח מכפיל הפוטו עולה וחוזר לקו הבסיס לאחר הפחתת כל הניטריט, מה שיכול לקחת עד דקה.

כדי לכמת את האות נבנתה עקומה סטנדרטית מהתקנים, תוך שימוש בשטח שמתחת לשיא קפיצת המתח. באמצעות העקומה הסטנדרטית, כימות הדגימות היה ניתן לשחזור מאוד בין ההזרקות הכפולות שלהן. כימילומינסנציה נחשבת לתקן הזהב לקביעת ריכוזי ניטריט.

לאחר השליטה, מגבלת הרגישות לניטריט נמוכה עד עשרים מילי-טוחנות. הדבר החשוב ביותר בעבודה עם כימילומינסנציה הוא דיוק. בשל הרגישות הגבוהה של השיטה, כל טעות תשפיע על התוצאה הסופית.

אז קחו את הזמן ואל תמהרו. לאחר שטכניקה זו פותחה בתחילת שנות ה-2000, היא סללה את הדרך לחוקרים לחקור מסלולים מטבוליים של תחמוצת החנקן, וללמוד כי מחסור בחנקן חמצני גורם למחלות רבות, במיוחד מחלות לב וכלי דם.