Name: מדידת הניטריט ו חנקתי, מטבוליטים במסלול תחמוצת החנקן, חומרים ביולוגיים באמצעות שיטה chemiluminescence (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: למד כיצד לכמת חנקן חד-חמצני בדגימות ביולוגיות באמצעות כימילומינסנציה. השיטה מודדת רמות ניטריט וניטרט כדי לעקוב אחרי מטבוליזם וסיגנלינג של NO בביו-כימיה ובביולוגיה כלייתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחברים רוצים להכיר תרומות קריטיות של ד&quot;ר א &#39;Dejam ו MM פלטייה בפיתוח שימוש פתרון לשימור ניטריט למדידות ניטריט בדם.

כל הפרוטוקולים כולל השימוש בבעלי חיים אושרו לשימוש על ידי טיפול בבעלי חיים NIDDK ועדת שימוש ודם אדם הושג מבנק דם NIH מתורמים בריאים. לדוגמא הכנה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון לשימור ניטריט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה המכילה 890 ferricyanide אשלגן מ&quot;מ (K 3 Fe (CN) 6) ו -118 מ&quot;מ NEM (N-ethylmaleimide) במים מזוקקים. ממיס היטב עד שברור צהוב ללא גבישים נוכחיים. להוסיף NP-40 (octyl phenoxylpolyethoxylethanol) ביחס של 1: (V / V, NP-40 / פתרון) 9 יחס. מערבבים בעדינות כדי למנוע הקצפה ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כשבוע). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף והכנת דגימות דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם באמצעות לפחות מחט 20 G כדי למנוע המוליזה עם הפרין כדי למנוע קרישה (5 U / ml). עבור כל דגימת הדם, לערבב דם עם שמירת ניטריט פתרון מיידית ביחס של 1: 4 (נ/ V פתרון / דם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות פלזמה כדורית דם אדום, בצנטריפוגה הדם שנאסף במשך 5 דקות ב 4000 XG ב 4 ° C להפריד תאי דם אדומים (RBC) ופלזמה. קח את supernatant (פלזמה) ולערבב אותו עם ניטריט שמירת פתרון כפי שתואר לעיל עבור קביעת רמות ניטריט בפלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות הנותרים מעיל פלזמה באפי מהדגימה, מדגם פיפטה RBC מתחתית הצינור כדי למנוע זיהום על ידי סוגים אחרים של תאי דם באמצעות קצה פיפטה חתוכים, ולהעביר אותו לתוך צינור המכיל פתרון לשימור ניטריט באותו יחס כנ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים כל דגימה (פלזמה RBC) עם מתנול קר ביחס 1: 1 או 1: 2 (V / V מדגם / מתנול) צנטריפוגות אותם 13,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לזרז חלבונים. קח את supernatant ולהשתמש בו למדידת ניטריט או להקפיא דגימות מוכנות, במידת צורך, על קרח ולאחסן יבש ב -80 מעלות צלזיוס. הערה: ניטריט במהירות REACTS עם oxyhemoglobin (oxyHb) ב חנקתי להרכיב דם. מאז oxyHb הוא תמיד נוכח עודף גדול מעל ניטריט, תגובה זו גורמת כמעט מוחלטת השמדת ניטריט דם ילידים עם מסגרת זמן של 10 דקות ~. כדי לשמר את מרבית ניטריט דם אנדוגני, פתרון משמרי ניטריט מתווסף דגימות דם כולו מיד לאחר לקיחת הדם. הפתרון יהיה lyse תאי דם אדומים במהירות לחמצן oxyHb לתוך methemoglobin (metHb), צורה פעילה של המוגלובין שאינו מגיב כימית עם ניטריט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת דגימות מסוגים אחרים של נוזלי גוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף מדגם לתוך מיכל מתאים, ומערבבים היטב עם שמירה ניטריט פתרון, deproteinate ולמדוד מיד או להקפיא ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף והכנת דגימות רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות של רקמות חיות perfused עם תמיסת מלח heparinized (10 U HEPAרין / מ&quot;ל). בלו על 1 גרם של רקמות רצויות homogenize או באמצעות homogenizer ידנית או אוטומטית homogenizer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ידוע כמות ניטריט שימור פתרון לפי צורך כדי להשיג homogenate החלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרקמות הן הומוגני, לזרז חלבונים באמצעות מתנול קר (1: 1 או 1: 2 נ יחס / v מדגם / מתנול) כפי שתואר לעיל, אזי דגימות צנטריפוגות ב 13,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף רמות ניטריט supernatant ולמדוד. במידת הצורך, להקפיא דגימות בכל שלב של הכנה על קרח ולאחסן יבש ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. הכנת צמצום פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tri-יודיד (אני 3) צמצום פתרון הניטריט ו R- (X) -NO מינים נחישות 1,3,4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של 301 מ&quot;מ KI יחד עם 138 מ&quot;מ לי 2 פתרון במים. מערבבים עם חומצה אצטית קרחונית ב 2: 7 יחס (v / v פתרון / חומצה) על בוחש מגנטי עבור ~ 30 דקות עד שכלגבישים הם מומסים. רצוי לשמור בבקבוק כהה, כמו יודיד אור רגיש, ולהשתמש תוך שבוע הכנה. הערה: פתרון זה יקטין ניטריט לתוך NO וזה גם ישחרר NO מ R-Sno, R-Nno ו Fe-NO קבוצות פונקציונליות (R (X) -NO), אך חנקתי לא יושפע. האות המתקבל ממחשב הקבוצות הפונקציונליות NO המבוסס לעיל ניתן להפריד אות ניטריט נכון על ידי טיפול של מחצית המדגם עם sulfanilamide acidified (AS) והשוואת אות AS שטופל וטופל כראוי. AS באופן בלתי הפיך יוצר קטיון diazonium עם ניטריט ומורכב זה לא יכול להיות מופחת על ידי לי 3 פתרון. כל טיפול, להכין פתרון 290 מ&quot;מ של sulfanilamide ב 1 M HCl ולהוסיף אותו aliquot של המדגם ביחס 1: 9 (V / V AS / לדוגמה). מדוד את האות CL בחלקים AS שטופלו ומטופלים כראוי של המדגם. חשב את האות ניטריט נכון כהבדל של חלק AS שטופלו ומטופלים כראוי של המדגם. ניטריט ניתן גם נמדד באמצעות ניט סלקטיביתטקס צמצום פתרון של תערובת חומצה אסקורבית / אצטית כמתואר חלק 2.2. עם זאת, בשל כמות בדרך כלל קטנה של R- (X) -NO מינים בהווה, מדידות באמצעות דגימות AS-מטופל הם ברוב המקרים קירוב טוב מאוד של תוכן ניטריט הכולל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומצת אסקורבית / חומצה אצטית (4A) פתרון זיהוי סלקטיבית של ניטריט 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 500 מ&quot;מ חומצה אסקורבית במים. מערבבים את הפתרון הזה עם חומצה אצטית קרחונית על יחס 1: 7 (V / V, חומצה אסקורבית / חומצה אצטית) כדי להכין את תערובת התגובה. הערה: פתרון זה הוא ספציפי עבור ניטריט, לא תשחרר NO מכל R- (X) -NO מינים או ניטראט. עם זאת, הפתרון של אסקורבית וחומצה אצטית חייב להיות מוכן טרי כל יום לפני המדידות, כמו חומצה אסקורבית מתחמצנת בקלות בתמיסה. השלמתי הפחתת ניטריט תלוי בריכוז חומצת אסקורבית; ולפחות חומצה אסקורבית 50 מ&quot;מימ מומלצת לחדרים מלאיםeduction של ניטריט פלזמה. עם זאת, מומלץ לבצע כמה ניסויי טייס עם ריכוזים שונים של חומצה אסקורבית וסטנדרטים ניטריט בטווח ריכוז ניטריט הצפוי לפני מדידות מדגם סופיות. זכור כי חומצה אסקורבית מהכלה מעט במהלך המדידות, כך שינויים תכופים של תערובת תגובה בתא תגובת זכוכית מומלצים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ונדיום (III) פתרון צמצום כלוריד לקביעה חנק 9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 51 מ&quot;מ פתרון של VCL 3 ב 1 M HCl. פתרון סינון דרך 200 מיקרומטר מסנן ולאחסן בבקבוק כהה, השתמש בתוך שבועיים. הערה: פתרון זה יקטין חנק, ניטריט וכל R- (X) -NO מינים, כך שאם בכמויות דומות של ניטריט או R- האחר (X) -NO מינים נמצאים יחד עם חומר נפץ, התוכן חנק סופית שיחושב כהפרש בין אותות CL שהושג עם VCL 3 ואני3 צמצום פתרונות. </li></ol></li></ol> 3. chemiluminescence (CL) Setup ומדידות Analyzer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון רגיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 מיקרומטר פתרון של סודיום ניטריט (Nano 2). אותו הפתרון יכול לשמש קביעות הניטריט ו חנק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש NO מנתח הערה: בשלב זה יש שני מנתחים זמינים אין מסחרי רגישים מספיק למטרות מחקר ביולוגיות - סיברס נוע Ecophysics CLD 88Y. שניהם פועלים על אותו העיקרון; ההבדל העיקרי הוא כי CLD 88Y משתמשת חמצן מאוויר המקום לעשות אוזון (O 3), בעוד NOA דורש מיכל חמצן חיצוני למטרה זו. ההליך שלהלן מתאר את להגדיר עבור סיברס NOA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת Instrument <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההגדרה הראשונית של NO מנתח על פי המלצות היצרןכפי שאפשר לראות על איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טנק להרחיב O 2 מחובר המכשיר. בחר &quot;ניתוח&quot; ו &quot;להיכנס&quot; מהתפריט הראשי בלוח הקדמי. במסך הבא לבחור &quot;התחל&quot; ולחץ על &quot;Enter.&quot; חבר את מלכודת חומצה (המכיל 1 M NaOH) למכשיר כפי שניתן לראות באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד המכפיל מתקרר לטמפרטורה מתחת -12 מעלות צלזיוס בתא התגובה יפונה עד 6 Torr. זה לוקח בערך 30 דקות כדי להגיע בסיס שטוח ויציב. הבסיס צריך לייצב בתוך 1 - 2 mV, בערכו הנקוב הוא פחות חשוב מאשר את יציבותו. הערה: אם חנק נמדדת, להדליק את באמבט מי קירור (להגדיר ב 4 ° C, אשר ממשמש מלכודת קרה עבור אדי חומצה ומים) באמבט מי חימום (תא התגובה העיקרי, 95 ° C). שיעור ההפחתה של חנק לתוך NO בתמיסת VCL 3 הוא טמפרטורה תלויה, הוא איטי מאוד בטמפה בחדרrature, כך עלייה משמעותית של הטמפרטורה יש צורך לבחון את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הטנק הוא וחברת את תא תגובת זכוכית, ללכוד חומצה כפי שאפשר לראות על איור 1. ממלא את חדר התגובה עם פתרון הפחתה מתאים, להפחית את המבעבע למינימום ולהתחבר תא תגובה למלכודת החומצה. באמצעות ניסוי וטעייה, להתאים את קצב מבעבע הוא להתאים את קצב שאיבה מכשיר (בדרך כלל ~ 200 מ&quot;ל / דקה של NOA Siever). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מחשב שליטה המכשירה ולהתחיל תוכנה נוזלית מבוססת Labview. כדי להפעיל את התקשורת בין המכשיר ואת תוכנת הרכישה, לחץ על &quot;זן&quot; כאשר &quot;בתפריט נתונים&quot; עד מסך קורא &quot;פלט מופעל&quot;, ולאחר מכן קש &quot;ברור&quot; לחזור שוב אל מסך נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה שמץ בסיס יציב על המסך ולהתחיל הזרקת דגימות וסטנדרטים ניטריט בדבר הפחתת פתרון באמצעות מחץ. תמיד לחכות להגיע ומאחור בסיס יציבאה השיא. זה יכול להימשך עד 2 דקות. התוכנה הנוזלת אופציה &quot;סימן&quot; בעתות הזרקה ותסמן את הזריקה וזה יהיה לייצא הערות אלה לקובץ נפרד (filename.info) כהשלמה שימושית לקובץ הנתונים (filename.data). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגימות וסטנדרטים נמדדים, לבחור &quot;להפסיק&quot; אפשרות בתפריט התוכנה נוזלי - זה יכתוב נתונים מקובץ זמני לקובץ קבוע, הידוע בשם &quot;filename.data&quot;. &quot;להפיל&quot; לחיצת אפשרות תסתיים מדידה מבלי לכתוב נתונים רכשו לקובץ קבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסיים את הניסוי, לנתק את המכונית מספינת התגובה ידי כיבוי הברזלים על גבי כלי תגובה וניתק את הצינורות בין מלכודת חומצת כלי תגובה (ראה איור 1). עכשיו להפסיק מנתח NOA - עיתונות &quot;ברור&quot;, ללכת &quot;ניתוח&quot;, לשים מכונים על &quot;מתנה&quot; מתנה &quot;אישור&quot;. אם נעשה שימוש קבוע,מכשיר ניתן להשאיר במצב המתנה במשך כמה שבועות. סגור את אספקת החמצן. ואז לשטוף את הפתרון לצמצום מאולם התגובה, ניתק ולסגור את הטנק הוא מספינת תגובת הזכוכית לסיים את ניקוי כלי תגובה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקני זריקות מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 50 μl של פתרון ניטריט 1 מיקרומטר לתוך תערובת התגובה באמצעות מזרק המילטון היטב שטף. חכו לפחות 1 - 2 דקות בין זריקות כדי להשיג הפרדה טובה של פסגות. הזרקת חזור של 50 μl לקבל כפילויות לכל נקודת נתונים. לשטוף מזרק עם מים ללא יונים לאחר כל הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכוש סט מלא של נתונים עבור עקומה סטנדרטית, להמשיך עם זריקות כפולות של 100, 150 μl (נוספים 200 μl עשויים להידרש אם ריכוזים גבוהים של ניטריט או ניטראט צפויים) של פתרון ניטריט 1 מיקרומטר. בכל מקרה, לטפל לחכות עד האות נופלת חזרה אל הבסיס ולאחר מכן לרכוש 1 - 2 מילn של הבסיס כדי להשיג הפרדה טובה של פסגות. הערה: תקני ניטריט יכול להימדד בכל עת במהלך הניסויים. עם זאת, עדיף לרכוש את עקומת סטנדרט לפני המדידה הנתונים, כפי שהוא משמש גם בדיקה עצמאית של פונקציונליות המכשיר. כאשר נתונים נאספים, כמות המדגם מוזרקת צריכים להוביל פסגות מבוטאות היטב. עם זאת יש לזכור כי מכפיל הוא ליניארי רק עד ~ 800 mV, כך שאף אחד השיא צריך להיות גבוה יותר מ ~ 700 mV. זו יכולה להיות מושגת באמצעות הפחתה של מדגם מוזרק כמות או דילול מדגם עם מים ללא יונים. כל נקודה יש ​​למדוד לפחות בשני עותקים. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Nitrite+in+Blood+Samples+Using+the+Ferricyanide-Based+Hemoglobin+Oxidation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay.</a> Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Nagababu, E., Rifkind, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+nitrite+by+chemiluminescence+without+interference+of+S-%2C+N-nitroso+and+nitrated+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species.</a> Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).</li>
<li>Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPinder%2C+AG+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Redox-Mediated+Signal+Transduction%22">Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction</a>. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).</li>
<li>Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+blood+and+plasma+nitrite+by+chemiluminescence%3A+pitfalls+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions.</a> Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).</li>
<li>Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+circulating+nitrite+and+S-nitrosothiols+by+reductive+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B%22%5BJournal%5D)">Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence.</a> J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).</li>
<li>Bryan, N. S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+detect+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples.</a> Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).</li>
<li>Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+gas-phase+chemiluminescence+and+flow+injection+analysis+for+measurement+of+nitric+oxide+pool+in+biological+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices.</a> Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).</li>
<li>Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+the+sensitive+and+specific+measurement+of+S-nitrosothiols%2C+iron-nitrosyls+and+Nitrite+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples.</a> Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).</li>
<li>Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+serum+nitrate%2C+a+stable+end+product+of+nitric+oxide%2C+in+women+with+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia.</a> Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).</li>
<li>Beckman, J. S., Congert, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Measurement+of+Dilute+Nitric+Oxide+in+Solution+with+an+Ozone+Chemiluminescent+Detector%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%3A+A+companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector.</a> Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).</li>
<li>Bates, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+measurements+by+chemiluminescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroprotocols%3A+A+companion+to+Methods+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection.</a> Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).</li>
</ol>

ד&quot;ר אלן שכטר מופיע בתור שיתוף הממציא על מספר פטנטים שהונפקו ה- National Institutes of Health עבור השימוש במלחים ניטריט לטיפול במחלות לב וכלי דם. הוא מקבל תמלוגים על בסיס רישוי NIH של פטנטים אלה לפיתוח קליני אבל אין תמורה כלשהי.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול Aliquots של כל הפתרונים (כולל המים) המשמשים להכנה, לדלל או אחרת לטיפול דגימות מקוריות צריך להישמר ובדק עבור ניטריט האפשרי או (לעתים קרובות יותר) זיהום חנק. גילינו כי רוב זיהום מקורם במים רבים כימיקלים המשמשים לטיפול מדגם (ferricyanide בפרט) מכילים גם כמות משמעותית של זיהום ניטראט במגרשים כמה מפריע הנחישות חנק אנדוגני. לפיכך, אנו בודקים את כל הכימיקלים שלנו עבור מזהמים ניטריט ניטרט לפני ש...

ניטריט, וכדי חנק להאריך פחות, רמות בדם משקפים מצב כללי של גוף NO מטבוליזם. ריכוזי ניטריט בדם ורוב האיברים והרקמות הם רק nanomolar גבוהה או טווח מיקרו נמוכה, חנקתי הוא בדרך כלל נוכח כמויות גבוהות בהרבה - בטווח מיקרו. שינויים ברמות ניטריט בשל התקדמות המחלה או שינויים בהרגלי התזונה הם די קטנים וניתן למדוד רק באמצעות שיטה רגישה מאוד. בגלל הרמות מאוד שונות התהליכים מטבוליים שונים שלהם, נחישות נפרדת של רמות ניטריט ניטרט היא חיונית. מה שנקרא &quot;אין בקביעה x&quot; איפה ניטריט ניטרט נמדדים ביחד יש ערך מועט מאוד. מספר שיטות לכימות ניטריט ב דגימות ביולוגיות שונות פותחו - הנפוצה ביותר להיות בכור אחד, המבוסס על תגובת Griess אשר תוארה לראשונה בשנת 1879. אפילו עם modificatio המודרניתNS, המגבלה הרגישה ניטריט השגה בשיטה &#39;Griess נמצאת בטווח מייקרו נמוך. Chemiluminescence (CL), בשילוב עם פתרון להפחתת יודיד תלת, נחשב כיום השיטה הרגישה ביותר, המאפשר כימות בטווח nanomolar נמוכה של ריכוזי ניטריט 1-8,10,11. השיטה הזהה CL, בשילוב עם ונדיום (III) כלוריד צמצום פתרון, יכולה לשמש למדידות רגישות של חנק, עם דיוק בטווח nanomolar 9. CL מזהה NO דלק חינם. לכן, ניטריט, ניטראט, R-nitrosothiols (R-Sno), R-nitrosoamines (R-Nno), או תרכובות מתכת-NO (בהמשך כתב היד המכונה בשם &quot;R- (X) -NO&quot;), חייב להיות מומר לשחרר אין גז על מנת לכמת הסכומים המקוריים שלהם באמצעות CL. המרה ל NO מושגת באמצעות מספר פתרונות לצמצום שונים, בהתאם לאופי של NO המטבוליט. לאחר המרה, גז NO חינם נמחק כליל כלי התגובה ידי גז מוביל (הוא, N2 או Ar) לתוך תא התגובה של מנתח CL שבו אוזון (O 3) בשילוב עם NO ליצירת תחמוצת החנקן (NO 2) במצב מופעל שלה. עם החזרה למצב הקרקע, NO 2 * פולט באזור אינפרא אדום פוטון שנפלט הוא זוהה על ידי מכפיל (PMT) של מכשיר CL. עוצמת האור הנפלט היא ביחס ישר ל NO ריכוז בתא תגובה, המאפשר חישוב של הריכוז של המינים המקוריים באמצעות עקומות כיול ראויות. בפרוטוקול שלנו, אנו נחישות CL המבוסס הנוכחית הראשון של הניטריט ו חנק בהגדרות הקליניות הנפוצות ביותר - בדם ופלזמה, ולאחר מכן אנו דנים כיצד לקבוע יונים אלה בדגימות רקמה. אנו גם להסביר בפירוט כיצד לשמר את ריכוז ניטריט הפיזיולוגי המקורי בסביבות ניטריט-reactive, כגון דם והתאים שלה, פלזמה ותא דם אדום.

<table><tbody><tr><td>אשלגן פריציאניד; K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-אתילמלימיד</td><td>סיגמא</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-נונילפניל-פוליאתילן גליקול</td><td>סיגמא</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>סולפנילמיד; AS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית, חומצה</td> אסקורבית <td>קרחונית Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן יודיד; KI</td><td>Sigma</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>יוד; תת2</td><td>Sigma</td><td>207772</td> נתרן <td>ניטריט רעיל ורגיש לאור</td></tr><tr><td>; NaNO2</td><td>Sigma</td><td>563218</td><td></td></tr><tr><td>ונדיום(III) כלוריד; VCl3</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>רגיש לליגט, רעיל</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sievers NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&nbsp; אקופיזיקה&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת הניטריט ו חנקתי, מטבוליטים במסלול תחמוצת החנקן, חומרים ביולוגיים באמצעות שיטה chemiluminescence

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

תחמוצת החנקן (NO) הוא אחד מולקולות הרגולטור הראשי הומאוסטזיס וסקולרית וגם מוליך עצבי. NO מיוצר enzymatically מתחמצן לתוך הניטריט ו חנקתי על ידי אינטראקציות עם חלבונים אצטילן-heme שונים ועדיין אחרים לא מסלולים ידועים. התהליך ההפוך, הפחתה של הניטריט ו חנקתי לתוך NO התגלה ביונקים בעשור האחרון והוא צובר תשומת לב כאחד המסלולים ניתן גם למנוע או להקל על מגוון שלם של לב, חילוף חומרים והפרעות שרירים כי הם חשבו להיות מזוהה עם רמות של NO ירד. לכן חשוב לאמוד את הסכום של NO מטבוליטים שלו בתאים שונים בגוף - דם, נוזלי גוף ואת הרקמות השונות. דם, בשל נגישותו הקלה, הוא התא העדיף המשמש להערכת NO מטבוליטים. בשל החיים הקצרים שלה (כמה אלפיות) וריכוז תת-nanomolar נמוך, מדידות אמינות ישירות של דם NO &lt;em&gt; In vivo נוכחי קשיים טכניים נהדרים. לפיכך אין הזמין בדרך כלל מוערך על בסיס הסכום של מוצרי חמצון שלה, הניטריט ו חנק. מטבוליטים אלה שני תמיד נמדדים בנפרד. ישנן מספר שיטות מבוססות היטב כדי לקבוע הריכוזים שלהם נוזלים ביולוגיים ורקמות. כאן אנו מציגים פרוטוקול השיטה chemiluminescence (CL), מבוסס על זיהוי spectrophotometrical של NO לאחר הפחתת ניטריט או ניטראט ידי יודיד תלת או ונדיום (III) פתרונות כלוריד, בהתאמה. רגישות ניטריט וזיהוי חנק נמצאת בטווח nanomolar נמוך, ומגדירת CL כשיטה הרגישה ביותר הקיימים כיום כדי לקבוע שינויי NO מסלולים מטבוליים. אנחנו מסבירים בפירוט כיצד להכין דגימות נוזלים ביולוגיים ורקמות כדי לשמר סכומים מקוריים של ניטריט ובהווה חנק בעת האיסוף כיצד לקבוע את גובה הסכומים שלהם בדגימות. מגבלות הטכניקה CL הם גם explained.

איור 2 מציג תוצאות נציגים שנאספו סטנדרטים וחמישה מדגמים שונים. כפי שניתן לראות בנתון זה, עליות מתח מכפיל מייד לאחר ניטריט המכיל פתרון (תקני או דוגמאות) מוזרקות צמצום פתרון (פעמי זריקות מסומנות על ידי חצים אדומים מתחת העקומה) וחוזר לערך הבסיס פעם כל נוכחי ניטריט ב מוזרק פתרון הופחת. ברור גם מדמות זו כי מדידות נפח מדויקות נחוצות כדי לקבל נתונים לשחזור ביותר. אנו ממליצים להשתמש מזרקי דיוק המילטון למדידת כמויות הזרקה. ההפסד של צמצום קי...

תחמוצת החנקן (NO) היא מולקולת איתות חשובה בהומאוסטזיס של כלי הדם. אין ייצור in vivo נמוך מדי למדידה ישירה. כימילומינסנציה מספקת תובנה שימושית לגבי מחזור NO באמצעות מדידת קודמיו ותוצרי החמצון, ניטריט וחנקה. מוסברת קביעת ניטריט / ניטראט ברקמות הגוף ובנוזלים.

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בכימילומינסנציה כדי לכמת תחמוצת החנקן בדגימות ביולוגיות על ידי כימות רמות של ניטריט וחנקה, באמצעות תמיסות להפחתת טריודידים ונדיום-כלוריד. פרוטוקול זה מספק כלי רב עוצמה למעקב אחר חילוף החומרים והאיתות של תחמוצת החנקן, הן אזורית והן אורכית ממגוון דגימות ביולוגיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות והרגישות הגבוהה שלה.מי שתדגים את ההליך הזה תהיה קטלין קאסל, עמיתת IRTA שלנו. היא תראה לנו כיצד למדוד ניטריט על ידי כימילומינסנציה יחד עם תמיסת טריודיד. כדי להתחיל, הכינו תמיסה לשימור ניטריט.הכן תמיסה המכילה NEM אחד של 118 מילי-מולרית ו-890 מילי-מולרית אשלגן-פרוציאניד במים מזוקקים. ממיסים את המוצקים עד שהתמיסה צהובה צלולה ללא גבישים. לאחר מכן הוסף פתרון זה ל-NP 40 ביחס של 9 ל-1 נפח לפי נפח.מערבבים את התמיסה בעדינות כדי למנוע קצף. לעולם אל תערבב את התערובת הזו. ניתן להשתמש בתמיסת שימור הניטריט למשך כשבוע אם היא מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.ניתן להשתמש בפרוטוקול על דגימות ביולוגיות רבות שהושגו לאחרונה. במקרה זה דם טרי שנלקח צנטריפוגה כדי לקבל דגימת פלזמה לבדיקה. חשוב מאוד לעבד דם או כל דגימות ביולוגיות שמכילות כמות גדולה של חלבוני הם, כמו למשל המוגלובין או מיוגלובין, במהירות האפשרית, מאחר שחלבוני הם יגיבו עם הניטריט, ויהרסו את הניטריט.כעת, על מנת לשמר את רוב הניטריט האנדוגני בדם, ערבבו מיד את הפלזמה עם תמיסה משמרת ניטריט ביחס של 1 עד 4 נפח בנפח. בכל שלב של הכנה זו, ניתן להקפיא את הדגימה על קרח יבש. כדי לנטרל את הדגימה, ערבבו אותה עם חלק שווה של מתנול קר.לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-13000 גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לזרז חלבונים. קח את הסופרנטנט והשתמש בו למדידת ניטריט. עבור מידה רגישה של ניטריט, תמיסה להפחתת טריודידים נחשבת ליעילה ביותר.בעת הכנתו, וודאו שכל הגבישים מתמוססים. שמור את התמיסה בבקבוק כהה והשתמש בה תוך שבוע מההכנה. תמיסה להפחתת ונדיום-כלוריד מציעה את הדיוק הרב ביותר למדידת חנקה.תמיסה מיקרו-מולרית של ניטריט משמשת לקביעת העקומה הסטנדרטית עבור ניטריט, כמו גם חנקה. הגדר את מנתח תחמוצת החנקן בהתאם להוראות היצרן. ראשית, פתחו את מיכל החמצן, הפעילו את המכשיר וחברו אותו למלכודת חומצה, המכילה נתרן הידרוקסיד מולארי אחד.לאחר מכן, פתח את מיכל ההליום, ולאחר מכן חבר את תא תגובת הזכוכית למיכל ההליום. כעת, טען את תא התגובה בתמיסת טריודיד למדידת ניטריט. הוסף חומר אנטי מקציף.התאם את קצב זרימת הגז כדי להאט את הבעבוע. ואז חבר את מלכודת החומצה לתא התגובה. באמצעות ניסוי וטעייה, התאם את זרימת ההליום בצורה נכונה, כך שתתאים ליניקת המכשיר.כעת, הפעל את תוכנת הנוזל המבוססת על תכנות חזותי. ראשית, אפשר תקשורת בין המכשיר לתוכנת הרכישה מתפריט נתונים, ואז מהתפריט הראשי בלוח הקדמי התחל את הניתוח. המתן עד שמצנן מכפיל הפוטו יתקרר מתחת למינוס 12 מעלות צלזיוס, ועד שהפוטו-מכפיל יתייצב.לאחר כ-30 דקות, קו הבסיס יתייצב לטווח של 1 או 2 מילי-וולט. יציבות הערך היא קריטית, לא הערך עצמו. לאחר שהמנתח התייצב, השתמש במזרק המילטון שטוף היטב כדי להזריק תמיסות.ראשית, יש להזריק לפחות שלושה נפחים שונים של תקן הניטריט המיקרו-מולרי 1. הזרקו את התמיסות לתמיסת ההפחתה דרך המחיצה. הזריק כל תקן או דגימה פעמיים.אם צפויות רמות ודגימות ניטריט גבוהות, שקול להזריק נפח רביעי גדול של תמיסת ניטריט סטנדרטית לקביעה טובה יותר של שיפוע העקומה הסטנדרטית. התבונן תמיד בפלט והמתן עד שהמנתח יתייצב מחדש לקו הבסיס לפני הזרקת הדגימה הבאה. זה לוקח לפחות דקה.השתמש בנפחי דגימה שמגיעים לשיא מתחת ל-700 מילי-וולט לקבלת תוצאות מדויקות. בין הריצות יש לשטוף היטב את המזרק במים נטולי יונים. חשוב מאוד לשטוף את המזרק ביסודיות.לאחר ביצוע כל המדידות, לחץ על אפשרות העצירה בתוכנה. הנתונים יישמרו אוטומטית. לחיצה על ביטול תסיים את המדידה מבלי לשמור את הנתונים.סגור את זין העצירה על גבי כלי התגובה ונתק את הצינור המחבר בין מלכודת החומצה לכלי התגובה. לאחר הניסוי, העבר את המנתח למצב המתנה. לחץ על ניתוח בלוח הראשי ואשר שהוא נכנס למצב המתנה.לאחר מכן, כבה את אספקת החמצן. נתק את הצינורות ממיכל ה-O2 למלכודת חומצה. לאחר מכן שטפו את תמיסת הטריודיד באמצעות הליום.לאחר מכן, סגור ונתק את מיכל ההליום מכלי תגובת הזכוכית. לבסוף, נקו את הכלי באמצעות אתנול ומים לפי הצורך. תקני בדיקה יחד עם דגימות פלזמה מראים כי מיד לאחר הזרקתם, מתח מכפיל הפוטו עולה וחוזר לקו הבסיס לאחר הפחתת כל הניטריט, מה שיכול לקחת עד דקה.כדי לכמת את האות נבנתה עקומה סטנדרטית מהתקנים, תוך שימוש בשטח שמתחת לשיא קפיצת המתח. באמצעות העקומה הסטנדרטית, כימות הדגימות היה ניתן לשחזור מאוד בין ההזרקות הכפולות שלהן. כימילומינסנציה נחשבת לתקן הזהב לקביעת ריכוזי ניטריט.לאחר השליטה, מגבלת הרגישות לניטריט נמוכה עד עשרים מילי-טוחנות. הדבר החשוב ביותר בעבודה עם כימילומינסנציה הוא דיוק. בשל הרגישות הגבוהה של השיטה, כל טעות תשפיע על התוצאה הסופית.אז קחו את הזמן ואל תמהרו. לאחר שטכניקה זו פותחה בתחילת שנות ה-2000, היא סללה את הדרך לחוקרים לחקור מסלולים מטבוליים של תחמוצת החנקן, וללמוד כי מחסור בחנקן חמצני גורם למחלות רבות, במיוחד מחלות לב וכלי דם.

measuring-nitrite-nitrate-metabolites-nitric-oxide-pathway-biological

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ייצור אנדוגני של תחמוצת החנקן (NO) מסדיר מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים. מתברר יותר ויותר כי שיבוש או dysregulation של איתות NO מבוסס מעורב מחלות אנושיות רבות. שיטות לכמת רלוונטי מטבוליטים אינו רשאי לספק סמנים ביולוגיים מנבא אבחון או הרומן של מחלות אנושיות.

טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן

רמות של מולקולת האיתות התאית הדלקתית תחמוצת החנקן (NO) נבדקות בדרך כלל באמצעות מגיב גריס. בפרוטוקול זה, יצרנו בדיקת גריס מותאמת תוך שימוש ברקמת מוח חיה של דרוזופילה על מנת לזהות הפרשת NO בשיטה פשוטה, ניתנת לכימות וניתנת לחזרה רבה.

בדיקה כמותית חדשה של רקמה שלמה של רמות תחמוצת החנקן בתגובה נוירו-דלקתית של דרוזופילה

במאמר זה נתאר שיטה קלה מותאמת יחסית באמצעות צבע פלואורסצנטי diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2da) ו dihydroethidium (DHE) לגילוי סימולטני אן-פאס וויזואליזציה של תחמוצת חנקן תאית (NO) אניון סופראוקסיד (O 2 .- ) בהתאמה, טרי מבודד aortas השלם של מודל עכבר להשמנה.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

עבודות קודמות מצביעות על כך שההרכב האיזוטופי של חנקן של תחמוצות חנקן אטמוספריות עשוי להבחין בהשפעה של מקורות שונים בסביבה. אנו מדווחים על שיטה אוטומטית, ניידת ומבוססת שדה ליעילות איסוף גבוהה של NOx אטמוספרי לניתוח איזוטופי N ברזולוציית זמן שעתית.

אוטומטיות, מערכת איסוף ניידת ברזולוציה גבוהה עבור ניתוח איזוטופי החנקן של NO<sub&gt; x</sub

מאמר זה מתאר את תחמוצת החנקן (NO) פרוטוקולים ההדברה מזיקים לאחר הקטיף. צ'יימברס ההדברה הם סמוקים עם חנקן (N2) להקים ultralow חמצן בתנאים לא מוזרק. בסוף, צ'יימברס הם סמוקים ב N2 כדי לדלל לא לפני חשיפת מוצרים אויר כדי למנוע חשיפה2.

תהליכי מעבדה ההדברה להדברה בגז תחמוצת החנקן

Α-hydroxylation של nitrosamines מסרטנים מאת ציטוכרום P450s הוא מסלול מטבולי מקובל שמייצר מזיקות-DNA intermediates, לגרום מוטציות. עם זאת, נתונים חדשים מציין עוד חמצון כדי nitrosamides יכול להתרחש. אנו מתארים גנרל שיטה לגילוי nitrosamides המופק במבחנה ציטוכרום P450 מזורז מטבוליזם של nitrosamines.

שיטה כללית לגילוי Nitrosamide היווצרות בחילוף החומרים במבחנה של Nitrosamines מאת ציטוכרום P450s

סדרה של שיטות כדי לקבוע את שיעור DNRA פוטנציאלי מבוסס על 14NH4+/15NH4+ ניתוחים מסופק בפירוט. NH4+ מומר N2O באמצעות מספר שלבים וניתח באמצעות ספקטרומטריה גז quadrupole כרומטוגרפיה-מסה.

מדידה של שיעורי חנקה דיספילציה הפחתת אמוניום מבוסס על 14NH4+/15NH4+ ניתוחים באמצעות המרה רציפים N2O

אנו מציגים פרוטוקולים לשלוש שיטות שונות להומוגניזציה של ארבע קבוצות שרירים שונות של רקמת שריר שלד חולדה כדי למדוד ולהשוות את רמות החנקות והניטריט. יתר על כן, אנו משווים משקלים שונים של דגימות כדי לחקור אם גודל דגימת הרקמה משפיע על תוצאות ההומוגניזציה.

הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לאיתור תחמוצת החנקן ונגזרותיה הרלוונטיות מבחינה ביולוגית באמצעות מבחנים מבוססי כימילומינסנציה בעלי רגישות גבוהה.

מבחנים מבוססי כימילומינסנציה לזיהוי תחמוצת החנקן ונגזרותיה מאוטוקידציה ותרכובות ניטרוסטיות

פרוטוקול זה מתאר שיטה לכימות ייצור תחמוצת החנקן (NO) בתרביות אפיתל בדרכי האוויר המובחנות בממשק אוויר-נוזל (ALI) על ידי מדידת ניטריט בהפרשות אפיקליות באמצעות בדיקת כימילומינציה מבוססת טריודיד.

מדידת ייצור תחמוצת חנקן בתרביות תאי אפיתל של קנה הנשימה בעכברים הממוינים בממשק נוזל האוויר

למד כיצד לכמת חנקן חד-חמצני בדגימות ביולוגיות באמצעות כימילומינסנציה. השיטה מודדת רמות ניטריט וניטרט כדי לעקוב אחרי מטבוליזם וסיגנלינג של NO בביו-כימיה ובביולוגיה כלייתית.

מדידת הניטריט ו חנקתי, מטבוליטים במסלול תחמוצת החנקן, חומרים ביולוגיים באמצעות שיטה chemiluminescence

גלה סרטונים נוספים