ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה Zea Mays מותיר

המטרות הכלליות של ניתוח זה הן לקבוע את הבסיס התאי של צמיחת עלי תירס, ולהשתמש בנתונים אלה כדי לחקור מנגנוני ויסות גדילה מולקולרית על ידי ביצוע אסטרטגיות דגימה התפתחותיות ספציפיות לשלב. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בביולוגיה התפתחותית של צמחים. כיצד חלוקת תאים והרחבת תאים תורמים להבדלים בצמיחת איברים שלמים?

גישה זו מאפשרת חקירה ומיפוי מרחבי של תהליכים ביוכימיים, מולקולריים ופיזיולוגיים, העומדים בבסיס צמיחת איבר הצמח כולו. למרות שמערכת זו יכולה לספק תובנה לגבי צמיחת עלי תירס, הטכניקה יכולה לשמש למערכות אחרות. כולל מיני דשא ואיברים אחרים.

הדגמה חזותית של שיטות אלה היא קריטית. בעת הקציר, קשה לבצע שלבי ביבלציה ומדידה ללא הדגמה זו. המדגימות את ההליך יהיו קתרין ספרינג'רס וויקטוריה אברמובה.

שני סטודנטים לדוקטורט מהמעבדה שלי. כדי לבצע ניתוח צ'נמטי מלא של צמיחת עלים בחד-קוטיות, יש לגדל לפחות 15 צמחים לכל טיפול וגנוטיפ, בתנאים מבוקרים בחדר גידול. כאשר מופיע עלה מעניין, השתמש בסרגל כדי למדוד את אורך העלה, כלומר האורך מהאדמה לקצה העלה, מדי יום עד שהעלה מתרחב במלואו.

בשלב ההתפתחותי של העניין, חתכו את החלק הקרקעי של הצמח מחמישה צמחים מייצגים לפחות קרוב ככל האפשר לשורשים, כדי לשמור על האזור המריסטמטי שלם. לאחר מכן, החל מהעלים החיצוניים, פרש בעדינות את כל העלים עד לעלה המעניין, בזה אחר זה. הוצאת כמה מילימטרים נוספים מהבסיס כדי לנתק את העלים לפי הצורך.

לאחר מכן, הסר את הקודקוד ואת העלים הקטנים המוקפים בעלה המעניין, וחתוך קטע של שלושה סנטימטרים מהעלה, החל מהבסיס בצד אחד של הווריד האמצעי. חיוני לחתוך את העלה בדיוק במקום בו הוא מחובר לגבעול. כמו חיתוך לגבוה, יוביל להערכת חסר של גודל המריסטם.

אחסן את הקטע במבחנה של 1.5 מיליליטר, מלאה בשלוש שתיים נפח אחד בנפח תמיסת חומצה אצטית אתנול מוחלטת, בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עד מספר חודשים. מהצד השני של הווריד, חתכו קטע של 11 סנטימטר מהבסיס, ואחסנו את הקטע הזה בצינור של 15 מיליליטר מלא באתנול מוחלט, בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שש שעות לפחות כדי להסיר את הפיגמנטים. לאחר סיבוב שני של 24 שעות באתנול מוחלט בארבע מעלות צלזיוס, החליפו את האתנול בחומצה לקטית טהורה, ואחסנו את הקטע בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות נוספות, או עד לניתוח נוסף.

כדי למדוד את המריסטם, העבירו תחילה את קטע העלה של שלושה סנטימטרים למאגר שטיפה טרי שהוכן למשך 20 דקות. בתום הדגירה, העבירו את הקטע למיכל של תמיסת צביעה Dapi, למשך שתיים עד חמש דקות על קרח בחושך. לאחר מכן, הרכיבו במהירות את הרקמה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית, וכסו את הקטע בזכוכית כיסוי.

אשר את הפלואורסצנטיות של תאי האפידרמיס במיקרוסקופ, באמצעות פלואורסצנטיות UV. לאחר מכן, הרכיבו את הדגימה בטיפת מאגר שטיפה על שקופית מיקרוסקופ חדשה עם מכסה זכוכית חדש. באמצעות הגדלה פי 20, החזר את הקטע למיקרוסקופ וגלול דרך הדגימה כדי לאתר דמויות מיטוטיות מתרבות.

הימנע מכל חלוקת תאים מעצבת של הגזמה המתפתחת, ולאחר מכן הגדר היכן ממוקמת הדמות המיטוטית הדיסטלית ביותר. באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, מדוד את האורך המלא של מסגרת התמונה. בדוגמה זו, 645 מיקרומטר.

לאחר מכן ספרו את מספר המסגרות המכסות את אורך המריסטם המלא מהדמות המיטוטית הדיסטלית ביותר ועד לבסיס העלה, והכפילו את המספר הזה באורך מסגרת אחת כדי לקבל את אורך המריסטם המלא. כדי לקבל פרופיל אורך תא, העבירו את הקטע של 11 סנטימטר מחומצת החלב, לספסל, והשתמשו באזמל כדי לחתוך את הרקמה ל-10 מקטעים של סנטימטר אחד. הרכיבו את קטעי העלים המתקבלים על שקופית מיקרוסקופ אחת, וטיפה קטנה של חומצה לקטית.

הנחת כל החלקים עם אותו צד כלפי מעלה. ואז, העבירו את השקופית מתחת למיקרוסקופ המצויד באופטיקה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות. החל מהקטע הקרוב ביותר לבסיס העלה, השתמש בתוכנת ניתוח תמונה מתאימה כדי למדוד את אורכם של לפחות 20 תאי אפידרמיס משוכפלים וקבצים הסמוכים ישירות לקבצי הגזע, כדי להבטיח בחירה עקבית של אותו סוג תא במיקומים שווים לאורך כל אחד מהקטעים.

קח את המיקום המתאים לכל מדידה לאורך העלה. לאחר מכן קבע את אורך התא הממוצע בכל מילימטר לאורך ציר העלה באמצעות הליך החלקה פולינומי מקומי המיושם בסקריפט R הזמין כקובץ משלים ראשון. היזהר לא להחליק יתר על המידה.

ההחלקה אמורה להסיר את הרעש בנתוני התאים, אך לא להשפיע על הצורה הכללית של העקומה. כאן, מוצגת השוואה בין צמחים מושקים היטב, לבין צמחים הנתונים לתנאי עקת בצורת מבחינת צמיחת העלים שלהם. אורך העלים הסופי של צמחי הביקורת היה נמוך ב-40 אחוזים מזה של צמחי הבצורת, עקב קצב התארכות עלים נמוך יותר.

קצב התארכות העלים של צמחים בלחץ בצורת, נמוך ב-73 אחוזים מזה של בקרות מושקות היטב, עקב ייצור תאים מופחת. אשר בטרן, נגרם בעיקר על ידי קצב חלוקת תאים מופחת. ניתוח קינמטי מספק מפה של לוקליזציה של אזור גידול העלים, ומאפשר דגימה ברזולוציה תת-אזורית לניתוח מולקולרי וביוכימי.

לדוגמה, כימות MDA לאורך אזור הגידול של עלה התירס בצמח הנתון לבקרת השקיה טובה ותנאי בצורת, מדגים עלייה משמעותית בתוצר זה של פירוק שומנים בכל אזור הגידול בתגובה לתנאי עצירת מים. עקב התקצרות העלים בתגובה לבצורת, אזורי ההתפתחות לא התאימו בביקורת ובצמחים הלחוצים בניסוי זה. עם זאת, באמצעות פרופיל אורך התא ניתן לקבוע את אורך אזורי ההתפתחות, מה שמאפשר להשוות את רמות ה-MDA באזורים הבודדים.

לאחר השליטה, ניתן לעבד דגימה בודדת תוך ארבע שעות, אם הטכניקה מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על המריסטם שלם במהלך הקציר שלו. בעקבות הליך זה ניתן ליישם טכניקות אחרות, כגון קביעת פרמטרים מולקולריים וביוכימיים, כדי לחקור את מעורבותם בוויסות הגדילה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת את חלוקת התאים והתרחבות התאים בגידול עלה תירס, לקבוע את גודל אזורי הגידול השונים ולפרש נתונים מולקולריים וביוכימיים בהתאם. אל תשכח שעבודה עם חומצות חלב וחומצות אצטיות, ו-EDTA עלולה להיות מסוכנת. לכן, תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות וניקוי המיקרוסקופ בכל שלב לאחר השימוש, בעת ביצוע הליך זה.