Name: ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה Zea Mays מותיר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: למדו כיצד לכמת חלוקת תאים והתרחבות בעלי תירס Zea mays כדי לחקור מנגנוני גדילה מולקולריים. שיטה זו מאפשרת מיפוי מרחבי של תהליכים ביוכימיים ופיזיולוגיים לאורך אזורי הגדילה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק דוקטורט מאוניברסיטת אנטוורפן VA; המילגה דוקטורט של קרן המדע פלמית (FWO, 11ZI916N) כדי KS; מענקי פרויקט מן FWO (G0D0514N); פעילות מחקרית מתואמת מענק מחקר (GOA), &quot;גישה ביולוגיה מערכות של ליף המורפוגנזה&quot; ממועצת המחקר של אוניברסיטת אנטוורפן; הפולנים ואת המשיכה הבינאוניברסיטאי (IUAP ז / 29, MARS), &quot;תירס ו ארבידופסיס רוט ולירות צמיחה&quot; ממשרד מדיניות המדע הפדרלית הבלגית (BELSPO) כדי GTSB האן Asard, Sizani Bulelani ל &#39;חמאדה AbdElgawad כל תרמו וידאו .

הערה: הפרוטוקול הבא לניתוח קינמטיקה תקף רק עלים במהלך הצמיחה יציבה. זה מצביע על שיעור התארכות עלה יציב ודפוסי מרחב של אורך תא והתרחבות עלה במהלך תקופה של מספר ימים 6. צמח צמיחת 1. ומדידות של דרג התארכות ליף (הימלר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עלו בצמיחה יציבה ואת שלב ההתפתחותי של עניין. הערה: יש הבדל בין צמיחה היציבה וצמיחה חוזרת, מה שמרמז תבניות המרחביות דומות על עלים רצופים על אותו ציר. במהלך השלבים המוקדמים של צמיחת שתיל, עלים רצופים בדרך כלל גדלים יותר ויותר מהר בגלל הגודל הגובר של אזור צמיחת 7. למרות כמה תפקידים עלה גבוה יכול להיות דפוס צמיחה דומה 8, זהו שלב חולף העשויים להיות מושפעים על ידי טיפולים תחת חקירה. לכן חשוב להשוות קווי tr<html> eatments ורק על העמדה עלה אותו, למרות שזה ניתן לפתח בזמן אחר. אפילו בקצב התארכות מתמיד, פרופיל שיעור הצמיחה אינו בהכרח זהה בשלבי התפתחותיים שונים. לכן, חשוב לנתח העלים באותו שלב התפתחותי 8, בדרך כלל מוגדר במספר ימים לאחר הופעתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע ניתוח kinematic מלא צמיחה עלה ב monocots, לגדול לפחות 15 צמחים עבור כל טיפול ו גנוטיפ בתנאים מבוקרים בחדר צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו הזמן העלה של עניין מופיע (הופעתה מן במערבולת של עלים שמסביב), להתחיל למדוד את האורך של העלה יומי עם סרגל עד העלה מורחב מלא (האיור 1i). אורך ליף מרמז על אורך מרמה הקרקע עד קצה העלה. היזהר שלא לשבור או לפגוע עלה, כיוון שזה עלול לשנות את צמיחתה. </li></ol>בתשובה לשאלה 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54,887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1:. סקירה סכמטי של ניתוח kinematic עלי תירס העלה של ריבית נמדד עם שליט במשך שלושה ימים רצופים כדי לחשב את שיעור ההתארכות ליף (הימלר). לאחר מכן, העלה שנקטף וקטע שלושה סנטימטר משמש לקביעת גודל meristem. הדבר נעשה על ידי מדידת אורך מהבסיס עד הדמות mitotic הדיסטלי ביותר לאחר מכתים DAPI. (א) דוגמאות של דמויות mitotic שגשוג ו (ב) דמויות mitotic מכוננות. אחד עשרה הסנטימטרים הראשונים מהבסיס עלה בצד השני של הווריד באמצע משמשים לחתוך עשרה קטעים חד-סנטימטר למדידות אורך תא. מדידות אלה מספקים את הבסיס ליצירת פרופיל אורך התא, המשמש כדי לקבוע את אורך התא הבוגר (מחצלת l) ואורך תאים עוזב את meristem (div l). ה <em&gt; הימלר מחצלת l משמשים לחישוב שיעור ייצור תאים (P), בעוד div L ו- L mer משמשים כדי לחשב את מספר התאים meristem (N mer). בתורו, P ו- N mer משמשים לחישוב שיעור חלוקת התא הממוצע (D), שהוא ההופכי של משך מחזור התא (ג T). חצים של אותו הצבע עולים פרמטרים המשמשים לחישוב הפרמטר הבא על החצים האלה. ברי סולם = 40 מיקרומטר. מספרים רומים משמשים להתייחס להליכים ספציפיים ניסיוני כמתואר בפרוטוקול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> קציר 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב ההתפתחותי של עניין (למשל, ביום השלישי לאחר הופעתה), לבחור לפחות חמש p נציגlants מהאצווה שעליו לנהל את ניתוח kinematic. המשך מדידת שאר הצמחים כמוסבר בשלב 1.3 כדי לקבוע את אורך הדף האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלק מעל הקרקע של המפעל. כדי לשמור על חלק meristematic שלם, לחתוך קרוב ככל האפשר אל השורשים (איור 1ii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל העלים החיצוניים, להסיר את כל העלים עד העלה עניין ידי unrolling אותם אחד בעדינות על ידי אחד. במידת צורך, להסיר כמה מילימטרים נוספים מהבסיס לנתק את העלים. כמו כן להסיר את עלי איפקס קטנים וסגורים על ידי עלה העניין (איור 1iii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים מקטע 3 ס&quot;מ, החל מבסיס בצד אחד של וריד באמצע, ולאחסן אותו צינור 1.5 מ&quot;ל מבחן מלא 3: 1 (v: v) אתנול אבסולוטי: פתרון חומצה אצטית (זהירות: ללבוש כפפות) ב 4 ° C. במשך 24 שעות עד מספר חודשים (איור 1iv). קטע זה ישמש מאוחר יותר כדי לקבוע את האורך של meristem. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ הבצד השני של הווריד, לחתוך קטע 11 ס&quot;מ מבסיס (איור 1 נ) ולמקם אותו בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל מלא אתנול אבסולוטי ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 שעות כדי להסיר פיגמנטים (איור 1 vi). הערה: בהמשך, השתמשו רק 10 הסנטימטרים הראשונים כדי לקבוע את פרופיל אורך תא (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדשו את אתנול אבסולוטי לסיבוב נוסף של ניקוי על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות (איור 1vi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להחליף את אתנול האבסולוטי עם חומצה לקטית טהורה (זהירות: ללבוש כפפות) לניקוי ואחסון ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות או עד לשימוש נוסף (איור 1vi). </li></ol> 3. מדידות אורך meristem <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ שטיפה המכילים נתרן כלורי 50 מ&quot;מ (NaCl), 5 מ&quot;מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA; זהירות: ללבוש כפפות) ו -10 מ&quot;מ טריס (hydroxymethyl) חומצה aminomethane-הידרוכלורית (טריס-HCl; pH 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את קטע 3 ס&quot;מ בסעיף 2.4 וכן הלאהAK אותו למאגר במשך 20 דקות (איור 1vii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה, להשתמש חיץ שטיפה להכין פתרון מכתים 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל, שמירה על אותה על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם הגרעינים ידי צבת במגזר meristem במשך 2-5 דקות בתמיסה המכתימה DAPI. עבודה על הקרח בחושך (איור 1vii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו אותות קרינה על ידי הרכבה במגזר במהירות על כוס מיקרוסקופיה והמריחה עם מכסה זכוכית. תאי אפידרמיס צריכים להראות קרינה, בעוד שכבות תאי הבסיס לא צריכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המכתים אינו מספיק, לשים במגזר בחזרה הפתרון המכתים DAPI עבור כמה דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את המכתים, הר המגזרים בטיפת שטיפת חיץ בשקופית מיקרוסקופיה ומכסה כיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מיקרוסקופ מצויד קרינת UV בהגדלת 20X, המאפשר הדמיה של כ -1,000 epidermאל תאים בבת אחת. גלול לאורך קטע ולחפש דמויות mitotic שגשוג (metaphase, anaphase, telophase, ו cytokinesis), אך להימנע חלוקת התא המכונן של (1viii איור) בפיתוח הפיוניות 9. גדר שם דמות mitotic הדיסטלי ביותר ממוקמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את אורך meristem על ידי מדידת המרחק בין הבסיס של העלה והדמות mitotic ביותר דיסטלי אפידרמיס. השתמש תמונות תוכנה לניתוח (למשל, ImageJ) כדי למדוד את אורכו של מסגרת התמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר המסגרות שמכסות את אורך meristem המלא (מהבסיס עלה לנתון mitotic הדיסטלי ביותר) ו להכפיל את המספר הזה לפי אורך מסגרת אחת כדי לקבל את אורך meristem המלא (1ix איור). </li></ol></li></ol> 4. פרופיל אורך תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח במגזר המאוחסן חומצה לקטית (שלב 2.5) ולמקם אותו בזהירות על הספסל. חותכים את השנינות מגזריםחה אזמל ב 10 מקטעים של 1 ס&quot;מ כל אחת (איור 1x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המגזרים עלו הרצופים בשקופית מיקרוסקופ ב טיפה קטנה של חומצה לקטית. הקפד להתמודד באופן עקבי גם את adaxial או למעלה בצד abaxial. באופן עקרוני, אין העדפת צד מסוים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מיקרוסקופ מצויד התערבות הפרש לעומת זאת אופטיקה (DIC) לנתח את המגזרים, החל מבסיס העלה. מדוד עם תוכנת ניתוח התמונה אורך תאי אפידרמיס לשכפל 20 לפחות ב קבצים סמוכים ישירות לקבצי הפיוניות על מנת לבחור את סוג התא אותו בעקביות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם זה על עמדות ברווחים שווים לאורך אחד ממגזרי (4 עמדות לכל להספיק קטע), ולוודא כדי לרשום את המיקום המתאים לכל מדידה לאורך (1xi איור) עלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את אורך התא הממוצע בכל מ&quot;מ לאורך הציר עלה באמצעות p חלקת פולינום מקומיrocedure, ויושם R-סקריפט (איור 1xii; קובץ משלים 1). הערה: The-סקריפט R מספק סדרה של נתונים עם הגדלת חלקה. כמות החלקה הנדרשת היא שרירותית ו אידיאלי צריך רק להסיר את הרעש המקומי, אך לא להשפיע על עקומת הכולל. הקפד להשתמש באותה כמות של החלקה עבור כל הדגימות בתוך בניסוי אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע אורך תא במיקום כל בין צמחים ובעלי לחשב את סטיית התקן ליצור פרופיל אורך התא לאורך ציר עלה. </li></ol> 5. חישובים של פרמטרים קינמטית (ראה משלים קובץ 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הימלר על ידי לקיחת השינוי באורך עלה בין שתי נקודות זמן רצופות (למשל, 24 שעות, כמו בשלב 1.3) וחלוקתו את מרווח הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את אורך צמיחת האזור (GZ L) המתאים דיסטלי עמד מהבסיס שבו תאים מגיעים 95% של ce הבוגרת שלהםאורך ll על פרופיל אורך תא smoothened. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח לכל עמדה על% 95 פרופיל אורך תא smoothened של הממוצע של כל אורכי התא הבאים עמדה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השוואת אורכי תא smoothened (שלב 4.4) עם אורך תא מחושב 95% בכל אחת מעמדות. החל מהבסיס של העלה, אזור הגידול ומסתיים במצב שבו אורך התא בפועל שווה 95% של אורכי התא הבאים (איור 2; לראות משלי נתונים 2). </li></ol></li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> איור 2:. קביעת מועד לסיום לאזור הצמיחה meristem: במיקום מצוין עם כוכב אדום, גודל התא בפועל הוא קטן מ -95% (קו מקווקו אדום) של גודל התא הממוצע של כל התאים הבאים עמדה זו (אדום מוצק קַו). סופו של אזור הגידול (GZ L; מצוין עם ablue כוכב) ממוקם שבו 95% (קו כחול מנוקד) של גודל התא הממוצע של כל התאים הבאים עמדה זו (הקו הכחול מוצק) שווה לגודל התא בפועל. אגף אזור (D), אזור התארכות (E), ואת האזור הבוגר (M). חצים המקווקווים מציינים ההתכנסות בין הגודל המקומי ו -95% ביחס לגודל הממוצע על החלק הדיסטלי של העלה בעת מעבר מהעמדות הבסיסיות אל קצה העלה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את אורך אזור התארכות (L אל) כהפרש בין אורך של אזור הגידול (GZ L) ואת גודל meristem (L mer; נקבע בשלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את אורך התא הבוגר (מחצלת l) כמו אורך תא הממוצע באזור הבוגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את הימלר ידי מחצלת l כדי להשיג אתשיעור ייצור תאים (P). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר התאים באזור התארכות (N אל) כהפרש בין GZ N ו- N mer. מספר תאי meristem (mer N) שווה למספר המצטבר של תאים הממוקמים במרווחים המתאימים meristem. מספר תאים באזור צמיחה (GZ N) שווה למספר המצטבר של תאים הממוקמים במרווחים החופף את אזור הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את קצב חלוקת התא הממוצע (ד) כפי mer P / N. משך מחזור התא (ג T) שווה ln (2) / D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הזמן באזור ההתארכות (T אל) על ידי חלוקת N אל ידי P. השעה באזור חלוקה שווה log 2 (mer N) * ג T. אורכו של תאים עוזב את meristem (div l)שווה אורך תא מהפרופיל אורך תא smoothened בסוף של meristem. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את קצב התפשטות תאים הממוצע (R אל) באמצעות הנוסחה הבאה: ln (מחצלת l) -ln (div l)] / T אל. </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

ניתוח kinematic מלא על עלי תירס מאפשר קביעת הבסיס הסלולר של צמיחה עלה ומאפשר את העיצוב של אסטרטגיות דגימה יעילות. אף על פי הפרוטוקול הוא פשוט יחסית, קצת זהירות מומלצת השלבים הקריטיים הבאים: (1) חשוב לנתק את העלים הצעירים, סגורים (שלב 2.3) מבלי לפגוע meristem, מאז קביעת אורך meristem (שלב 3) מחייב המלא meristem להיות נוכחת. חלק באימון לפני כן ייתכן שיש צורך. (2) קביעת אורך Meristematic מבוססת על פרשנות של דמויות mitotic. לכן, אנו ממליצים כי, בתוך בניסוי אחד, אותו אדם מקיים מדידות א...

ניתוח צמיחה תלוי סט של כלים המשמשים בדרך כלל על ידי מדעני צמח לתאר הבדלי צמיחה ו / או תשובות פנוטיפי נקבע גנוטיפ לגורמים סביבתיים. הם כוללים מדידות גודל ומשקל של הצמח כולו או איבר וחישובי שיעורי צמיחה לחקור את המנגנונים של צמיחה. צמיחת איברים נקבעת על ידי חלוקת תא והרחיב ברמה התאית. לכן, כולל הכימות של שני תהליכים אלו בצמיחת המנתח הוא מפתח להבנת הבדלים בצמיחה כולו באיברי 1. כתוצאה מכך, חשוב להיות בעל במתודולוגיה לקבוע פרמטרי צמיחה הסלולר כי הוא יחסית קל לשימוש על ידי מעבדות ללא התמחות. ניתוח קינמטית כבר קמה, כגישה מתן מסגרת רבת עוצמה לפיתוח מודלים של גידול איברים 2. הטכניקה כבר אופטימיזציה עבור מערכות לינאריות,כמו שורשי ארבידופסיס thaliana ועלי monocotyledonous, אלא גם למערכות שאינן ליניארי, כגון עלי dicotyledonous 3. כיום, מתודולוגיה זו נמצאת בשימוש יותר ויותר כדי ללמוד איך גנטי, הורמונלית, התפתחותיים, וגורמים סביבתיים משפיעים חלוקת תא והרחיב באיברים שונים (טבלה 1). יתר על כן, הוא גם מספק מסגרת לקשר תהליכים תאיים לתקנות ביוכימיים, מולקולריות, ופיזיולוגיים הבסיסיות שלהם (טבלה 2), למרות מגבלות שניתן להטיל לפי גודל איבר וארגון מרחבי טכניקות הדורשות כמויות גדולות יותר של חומר צמחי (למשל, המטבוליט מדידות, פרוטאומיקה, וכו &#39;). עלי Monocotyledonous, כגון התירס (Zea Mays) עלה, מייצגים מערכות ליניאריות שבו תאים להעביר מהבסיס של העלה כלפי הקצה, ברצף עוברים דרך אזור meristem ואת ההתארכות להגיע הבוגרתאֵזוֹר. זה עושה את זה מערכת מודל אידיאלית עבור מחקרים כמותיים של התבניות המרחביות של צמיחה 4. יתר על כן, עלי תירס יש אזורי צמיחה גדולים (meristem אזור התארכות פורשים כמה סנטימטרים 5) ולספק אפשרויות ללימודים ברמות ארגוניות אחרות. זה מאפשר חקירת מנגנוני הוויסות (המשוערים) שליטת חלוקת תא ורחב, לכמת ידי ניתוח kinematic באמצעות מגוון של שיטות מולקולריות, מדידות פיסיולוגיות, וגישות ביולוגיה של תא (טבלה 2). כאן, אנו מספקים פרוטוקול לביצוע ניתוח kinematic בעלי monocot. ראשית, נסביר כיצד לבצע ניתוח נכון של שני חלוקת התא ואת התארכות התא כפונקציה של המיקום לאורך ציר עלה וכיצד לחשב פרמטרים קינמטיקה. שנית, אנחנו גם להראות איך זה יכול לשמש כבסיס לעיצוב דגימה. כאן, אנו דנים בשני מקרים: דגימה ברזולוציה גבוהה<html> ד ממוקד דגימה, המאפשר פרשנות נתונים משופרות ולחיסכון בזמן / כסף, בהתאמה. סקירת טבלת 1. קינמטיקה מנתח שיטות כימות של חלוקת תא והרחבה באיברים שונים. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> אֵיבָר </td><td> התייחסות </td></tr><tr><td> עלי monocotyledonous </td><td> 16, 20, 21, 22 </td></tr><tr><td> טיפים שורש </td><td> 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 </td></tr><tr><td> עלי dicotyledonous </td><td> 21, 30, 31 </td></tr><tr><td> לירות meristem הפסגה </td><td> 32 </td></tr></tbody></table> סקירת טבלת 1. קינמטיקה מנתח שיטות כימות של חלוקת תא והרחבה באיברים שונים. ther.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54887/54887table2.jpg" /> קישור טבלה 2. בין תהליכים תאיים לכמת ידי ניתוח kinematic לרגולציה שלהם ברמה המולקולרית. הפניות למחקרים שונים מקשרים כימות של תהליכים תאיים לתוצאות מבחני ביוכימיים ומולקולריים במינים ואיברים שונים. Endotransglucosylase Xyloglucan (XET), malondialdehyde (מד&quot;א), קינאזות תלויות-ציקלין (CDK). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הטבלה.</a>

<table><tbody><tr><td>סירים</td><td>כל</td><td>אחד</td><td>אנו משתמשים בעציצים עם המידות הבאות, אך יכולים להיות שונים בהתאם לטיפול/מחקר: קוטר תחתון: 11 ס"מ, קוטר פתיחה: 15 ס"מ, גובה: 12 ס"מ. אנו מגדלים צמח תירס אחד לכל עציץ.</td></tr><tr><td>מצע שתילה</td><td>כל</td><td>אחד</td><td>אנו משתמשים במדיום עציצים (ג'יפי, הולנד), אך ניתן להשתמש במצעים אחרים, בהתאם לטיפול / מחקר.</td></tr><tr><td>סרגל</td><td>כל</td><td>יש</td><td>צורך בסרגל הארכה המכסה לפחות 1.5 מטר כדי למדוד את אורך העלה הסופי של הצמחים.</td></tr><tr><td>זרעים</td><td>ניתן להזמין כל</td> זרעי <td>NA</td><td>ממגדל.</td></tr><tr><td>אזמל</td><td>כלשהו</td><td></td><td>האזמל משמש במהלך קציר העלים כדי לנתק את העלה המעניין מהעלים הסובבים אותו ומיד לאחר הקטיף כדי לחתוך דגימה מתאימה למדידות אורך התא ואורך המריסטם.</td></tr><tr><td>צינורות בז 15 מ"ל</td><td>כל</td><td>צינורות</td><td>הבז בנפח 15 מ"ל משמשים לאחסון דגימות המשמשות למדידות אורך תאים במהלך פינוי הדגימה עם אתנול מוחלט וחומצה לקטית.</td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף</td><td>כל</td><td>צינורות</td><td>האפנדורף משמשים לאחסון דגימות המשמשות למדידות אורך מריסטם בתמיסת אתנול: חומצה אצטית 3: 1 (v: v).</td></tr><tr><td>כפפות</td><td></td><td>כל</td><td>כפפות לטקס, המגנות מפני ריאגנטים קורוזיביים.</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>כל</td><td></td><td>זהירות: קורוזיבי למתכות, קטגוריה 1 קורוזיה בעור, קטגוריות 1A, 1B, 1C נזק חמור לעיניים, קטגוריה 1; נוזלים דליקים, קטגוריות 1,2,3</td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>כל</td><td></td><td>זהירות: מסוכן במקרה של מגע עור (מגרה), של מגע עין (מגרה), של שאיפה. מעט מסוכן במקרה של מגע עור (מחלחל), של בליעת</td></tr><tr><td>חומצה לקטית&nbsp; >98%</td><td>כל</td><td></td><td>זהירות: קורוזיבי למתכות, קטגוריה 1 קורוזיה בעור, קטגוריות 1A, 1B, 1C נזק חמור לעיניים, קטגוריה 1</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td> <td>כל</td><td></td><td>זהירות: רעילות חריפה (דרך הפה, עור, שאיפה), קטגוריה 4 גירוי בעור, קטגוריה 2 גירוי בעיניים, קטגוריה 2 רגישות בעור, קטגוריה 1 רעילות איברי מטרה ספציפיים &ndash; חשיפה בודדת, קטגוריה 3</td></tr><tr><td>טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן הידרוכלוריד (Tris-HCl)</td> <td>כל</td><td></td><td>חומר זה יכול להיות מגרה, יש להימנע ממגע עם העיניים והעור. שאיפת אבק עלולה לגרות את דרכי הנשימה.</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidine-2&prime;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>כל</td><td></td><td>בדיקה פלואורסצנטית חדירה לכל תא עבור DNA. גורם לגירוי בעור. עלול לגרום לתגובה אלרגית בעור. עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה.</td></tr><tr><td>קרח</td><td>כל</td><td>NA</td><td>יש לשמור את תמיסת ה-DAPI על קרח.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 מבית Zeiss או אחר</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי לקביעת אורך המריסטם.</td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופית</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td></td><td>כל פינצטה דרושה לפתיחת עלה התירס המגולגל מיד לאחר הקטיף על מנת לחתוך דגימה מתאימה למדידות אורך התא ואורך המריסטם.</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונות</td><td>Axiovision (מהדורה 4.8) מבית Zeiss</td><td>NA</td><td>ניתן להוריד את התוכנה בכתובת: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. ניתן להשתמש גם בתוכנות אחרות כגון ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ המצויד ב-DIC</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 מבית Zeiss או אחר</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ, המצויד בניגודיות הפרעות דיפרנציאלית (DIC) למדידת אורכי תאים.</td></tr><tr><td>R תוכנת ניתוח סטטיסטי</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>NA</td><td>קוד פתוח; ניתן להוריד בכתובת https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>R SCRIPT</td><td>NA</td><td>NA</td><td>אנו משתמשים בפונקציית החלקת הליבה של חבילת Kern Smooth (Wand MP, Jones MC.&nbsp; החלקת קרנל: צ'פמן & Hall/CRC (1995)). הסקריפט זמין עבור Mac ו-Windows לאחר בירור עם המחבר המתאים.</td></tr></tbody></table>

ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה<em&gt; zea mays</em&gt; מותיר

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

ניתוחי גדילה משמשים לעתים קרובות במדעי הצמח כדי לחקור גנוטיפים מנוגדים והשפעת התנאים הסביבתיים. ההיבט התאי של ניתוחים אלה הוא בעל חשיבות מכרעת, מכיוון שהצמיחה מונעת על ידי חלוקת תאים והתארכות תאים. ניתוח קינמטי מייצג מתודולוגיה לכימות שני התהליכים הללו. יתר על כן, טכניקה זו קלה לשימוש במעבדות שאינן מתמחות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע ניתוח קינמטי בעלי תירס חד-צידיים (Zea mays). מוצגים שני היבטים: (1) כימות פרמטרי חלוקת התאים והתפשטותם, ו-(2) קביעת מיקום אזורי ההתפתחות. זה יכול לשמש בסיס לתכנון דגימה ו/או יכול להיות שימושי לפרשנות נתונים של מדידות ביוכימיות ומולקולריות עם רזולוציה מרחבית גבוהה באזור צמיחת העלים. אזור הגידול של עלי התירס נקצר במהלך גידול יציב. עלים בודדים משמשים לקביעת אורך המריסטם באמצעות כתם DAPI ופרופילי אורך תא באמצעות מיקרוסקופ DIC. הפרוטוקול מתאים לעלים חד-צידיים שנקטפו במהלך גידול במצב יציב, עם אזורי גידול המשתרעים על פני מספר סנטימטרים לפחות. כדי לשפר את ההבנה של ויסות גדילת צמחים, יש לשלב נתונים על גדילה ומחקרים מולקולריים. לכן, יתרון חשוב של ניתוח קינמטי הוא האפשרות לתאם שינויים ברמה המולקולרית לשלבים מוגדרים היטב של התפתחות התא. יתר על כן, הוא מאפשר דגימה ממוקדת יותר של שלבי פיתוח מוגדרים, דבר שימושי במקרה של תקציב או זמן מוגבלים.

הנה, אנחנו מראים השוואה בין צמחים מושקים (שליטה, 54% תכולת מים בקרקע, (SWC)) וצמחים נתונים בתנאי עקת בצורת (בצורת, 34% SWC) במונחים של צמיחת העלה שלהם. כל הצמחים גדלו בתא צמיחה בתנאים מבוקרים (16 שעות ביום / 8 שעות בלילה, 25 ° C / 18 ° C יום / לילה, 300-400 μEm -2 שניות -1 photosynthetically הקרינה פעילה (PAR). תנאי הבצורת הוקמו על ידי מניעת מים עד הנכון SWC הושג ולאחר מכן עוד נשמר. במחקר ראשוני, הוא הוגדר כי עלה החמישי הוא אח...

לכימות חלוקת התאים והתרחבותם יש חשיבות מכרעת להבנת צמיחת הצמח השלם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחישוב פרמטרים תאיים הקובעים את קצב גידול עלי התירס ומדגישים את השימוש בנתונים אלה לחקירת מנגנוני ויסות צמיחה מולקולרית על ידי הכוונת אסטרטגיות דגימה ספציפיות לשלב ההתפתחות.

ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה<em&gt; Zea Mays</em&gt; מותיר

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

המטרות הכלליות של ניתוח זה הן לקבוע את הבסיס התאי של צמיחת עלי התירס, ולהשתמש בנתונים אלה כדי לחקור מנגנונים מולקולריים לוויסות הצמיחה באמצעות ביצוע אסטרטגיות דגימה ספציפיות לשלבים התפתחותיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלה מרכזית בביולוגיה התפתחותית של צמחים: כיצד תורמים חלוקת תאים והתרחבות תאים להבדלים בצמיחה של איבר שלם?גישה זו מאפשרת לחקור ולמפות מרחבית תהליכים ביוכימיים, מולקולריים ופיזיולוגיים, העומדים בבסיס הצמיחה של איבר הצמח השלם. למרות שמערכת זו יכולה לספק תובנות לגבי צמיחת עלי תירס, ניתן להשתמש בטכניקה עבור מערכות אחרות, כולל מיני דשא אחרים ואיברים שונים.הדגמה חזותית של שיטות אלו היא קריטית. שלבי הקצירה, הבי-בלציה של הדגימה והמדידה קשים לביצוע ללא הדגמה זו. את הפרוצדורה ידגימו Katrien Sprangers ו-Viktoriya Avramova.שני סטודנטים לדוקטורט מהמעבדה שלי. כדי לבצע ניתוח קינמטי מלא של צמיחת עלים בצמחים חד-פסיגיים, גידלו לפחות 15 צמחים עבור כל טיפול וגנוטיפ, בתנאים מבוקרים בחדר גידול. כאשר מופיע עלה רלוונטי, השתמשו בסרגל כדי למדוד את אורך העלה, כלומר המרחק מהקרקע ועד לקצה העלה, מדי יום עד להתרחבותו המלאה של העלה.בשלב ההתפתחותי הרלוונטי, גזרו את החלק העלי-קרקעי של הצמח מלפחות חמישה צמחים מייצגים, קרוב ככל האפשר לשורשים, כדי לשמור על האזור המריסטמטי שלם. לאחר מכן, החל מהעלים החיצוניים, פתחו בעדינות את כל העלים אחד אחד עד לעלה המבוקש. הסירו מספר מילימטרים נוספים מהבסיס כדי להפריד את העלים במידת הצורך.בשלב הבא, הסירו את התא apex ואת העלים הקטנים העטופים על ידי העלה המדובר, וגזרו מקטע של שלושה סנטימטרים מהעלה, החל מהבסיס בצדו האחד של העורק המרכזי. חשוב מאוד לחתוך את העלה בדיוק בנקודת חיבורו לגבעול. חיתוך גבוה מדי יוביל להערכת חסר של גודל המריסטמה.אחסן את המקטע בתוך מבחנה של 1.5 מיליליטר, מלאה בתמיסה של אתנול מוחלט וחומצה אצטיתית ביחס נפחי של 3:2:1, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ועד למספר חודשים. מהצד השני של הווריד, חתוך מקטע של 11 סנטימטר מהבסיס, ואחסן מקטע זה במבחנה של 15 מיליליטר מלאה באתנול מוחלט, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שש שעות לפחות כדי להסיר את הפיגמנטים. לאחר סבב שני של 24 שעות באתנול מוחלט בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, החלף את האתנול בחומצה לקטית טהורה, ואחסן את המקטע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות נוספות, או עד לביצוע ניתוחים נוספים.למדידת המריסטמה, העבירו תחילה את מקטע העלה באורך שלושה סנטימטרים למסלק שטיפה שהוכן רגע לפני כן למשך 20 דקות. בסיום הדגירה, העבירו את המקטע למכל עם תמיסת צביעה Dapi, למשך שתיים עד חמש דקות על קרח ובחושך. לאחר מכן, הניחו במהירות את הרקמה על זכוכית מיקרוסקופ, וכסו את המקטע בזכוכית כיסוי.אששו את הפלורסצנציה של התאי האפידרמליים תחת מיקרוסקופ, באמצעות פלורסצנציית UV. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לטיפה של באפר שטיפה על סרטית מיקרוסקופ חדשה עם כיסוי זכוכית חדש. באמצעות הגדלה של 20 פעמים, החזירו את המקטע למיקרוסקופ, וסרוקו את הדגימה כדי לאתר דמויות מיטוטיות פרוליפרטיביות.הימנעו מכל חלוקת תא מעצבת (formative) של הסטמטות (stemmata) המתרגשות, ולאחר מכן הגדירו היכן ממוקמת הדמות המיטוטית הדיסטלית ביותר. באמצעות תוכנה לניתוח תמונות, מדדו את האורך המלא של מסגרת התמונה. בדוגמה זו, 645 micrometer.לאחר מכן, ספרו את מספר הפרייםים המכסים את מלוא אורך המריסטמה, מהדמות המיטוטית הדיסטלית ביותר ועד לבסיס העלה, והכפילו מספר זה באורך של פריים אחד כדי לקבל את אורך המריסטמה המלא. כדי לקבל פרופיל של אורך התאים, העבירו את המקטע באורך 11 סנטימטר מחומצה לקטית אל סביבת העבודה, והשתמשו בסקאלפל כדי לחתוך את הרקמה ל-10 מקטעים של סנטימטר אחד כל אחד. הרכיבו את מקטעי העלה שהתקבלו על משטח מיקרוסקופ יחיד, והוסיפו טיפה קטנה של חומצה לקטית.הנח את כל החלקים כאשר הצדדים הזהים פונים כלפי מעלה. לאחר מכן, העבר את השקופית למסרט Microscope המצויד באופטיקה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (differential interference contrast). החל מהמקטע הקרוב ביותר לבסיס העלה, השתמש בתוכנה מתאימה לניתוח תמונות כדי למדוד את אורכן של לפחות 20 תאי אפידרמיס ושורות תאים חוזרים הסמוכים ישירות לשורות הסטמטליות (stemmatal files), וזאת כדי להבטיח בחירה עקבית של אותו סוג תאים במיקומים במרווחים שווים לאורך כל אחד מהמקטעים.יש להקפיד לרשום את המיקום התואם עבור כל מדידה לאורך העלה. לאחר מכן, קבעו את אורך התא הממוצע בכל מילימטר לאורך ציר העלה באמצעות הליך החלקת פולינום מקומית המיושם בסקריפט R הזמין כקובץ משלים מס' 1. יש להיזהר לא להחליק יתר על המידה.ההחלקקה אמורה להסיר את הרעשים בנתוני התאים, אך לא להשפיע על הצורה הכללית של העקומות. כאן מוצגת השוואה בין צמחים שהושקו היטב לבין צמחים שהוכפפו לתנאי עקה של בצורת, במונחים של צמיחת העלים שלהם. אורך העלה הסופי של צמחי הביקורת היה נמוך ב-40 אחוזים מזה של הצמחים תחת עקת בצורת, בשל קצב התארכות עלים נמוך יותר.קצב התארכות העלה של הצמחים תחת עקה של בצורת נמוך ב-73 אחוזים בהשוואה לבקרה שהושקה היטב, וזאת עקב ייצור תאים מופחת. דבר זה, בתורו, נגרם בעיקר מקצב חלוקה תאי מופחת. ניתוח קינמטי מספק מפה של מיקום אזור צמיחת העלה, ובכך מאפשר דגימה ברזולוציה תת-אזורית לצורך אנליזות מולקולריות וביוכימיות.לדוגמה, כימות MDA לאורך אזור הצמיחה של עלה התירס בצמחים שהוכפפו לקבוצת ביקורת מושקית ולתנאי בצורת, מדגים עלייה משמעותית בתוצר זה של פירוק ליפידים לאורך כל אזור הצמיחה בתגובה לתנאי מניעת השקיה. בשל קיצור העלה בתגובה לבצורת, אזורי הפיתוח לא תאמו בין צמחי הביקורת לצמחים תחת עקה בניסוי זה. עם זאת, באמצעות פרופיל אורך התאים, ניתן לקבוע את אורכם של אזורי הפיתוח, דבר המאפשר להשוות את רמות ה-MDA באזורים הבודדים.ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לעבד דגימה אחת בארבע שעות, בתנאי שהתהליך מבוצע כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על המריסטמה שלמה במהלך קצירה. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן ליישם טכניקות אחרות, כגון קביעת פרמטרים מולקולריים וביוכימיים, כדי לבחון את מעורבותם בבקרת הצמיחה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת חלוקת תאים והתרחבות תאים בעלה תירס הגדלה, לקבוע את גודלם של אזורי הגדילה השונים, ולפרש נתונים מולקולריים וביוכימיים בהתאם. זכרו כי עבודה עם חומצה לקטית, חומצה אצטית ו-EDTA עלולה להיות מסוכנת. לפיכך, יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה, כגון נעילת כפפות וניקוי המיקרוסקופ בכל שלב לאחר השימוש.

kinematic-analysis-cell-division-expansion-quantifying-cellular-basis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

כאן מוצג כיצד לעקוב ולכמת תהליכי התפתחות ב-C. elegans. השיטות המוצגות מבוססות על כלי קוד פתוח הניתנים ליישום בקלות. הוא מודגם כיצד לשחזר מודלים תלת מימדיים בצורת תא, כיצד לעקוב באופן ידני אחר מבנים תת-תאיים וכיצד לנתח זרימת התכווצות קליפת המוח.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

לגנים רבים בעלי חשיבות התפתחותית יש דפוסי ביטוי ספציפיים לתאים או לרקמות. מאמר זה מתאר ניסויי LM RNA-seq לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בגבול להב-נדן עלי התירס ובמוטציות lg1-R בהשוואה לסוג בר. השיקולים הניסיוניים שנדונו כאן חלים על ניתוחים טרנסקריפטומיים של תופעות התפתחותיות אחרות.

עיצוב ניסיוני עבור לייזר Microdissection RNA-seq: לקחים מניתוח התפתחות תירס ליף

הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה.

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

פרוטוקול זה מציג כיצד לחיות התמונה ולנתח את meristems apical לירות מכל מיני צמחים שונים באמצעות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים חיים של השלד המיקרו-טבובול הקליפתי ב"ירי" ומנטר את תגובתו לשינויים בכוחות הפיזיים.

הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical

בהירות אופטית היא יתרון משמעותי לעבודה הביולוגית והפיזיולוגית של התא בדגי זברה. מתוארות שיטות חזקות למדידת צמיחת תאים בבעלי חיים בודדים המאפשרות תובנות חדשות על האופן שבו צמיחת שרירי השלד והרקמות השכנות משולבת עם צמיחת כל הגוף.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

פרימורדיה של עלי תירס עטופה ומגולגלת עמוק, מה שמקשה על מחקרם. כאן, אנו מציגים שיטות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית.

שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית

תהליך זה עושה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם גרעין מסומן פלואורסצנטי וקו סמן כרומטין ב-Arabidopsis thaliana כדי לתעד בו-זמנית את דינמיקת הגרעין והכרומטין בשורשי הערבידופסיס ולחקור שינויים בדינמיקה אלו בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים.

הדמיה כמותית של תאים חיים של צורת גרעין ודינמיקת כרומטין במהלך ההתפתחות ולחץ סביבתי בשורש Arabidopsis thaliana

למדו כיצד לכמת חלוקת תאים והתרחבות בעלי תירס Zea mays כדי לחקור מנגנוני גדילה מולקולריים. שיטה זו מאפשרת מיפוי מרחבי של תהליכים ביוכימיים ופיזיולוגיים לאורך אזורי הגדילה.

ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה

גלה סרטונים נוספים