לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי באתרו Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים
10 בדצמבר 2016
כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לדמיין ולכמת אינטראקציות מיטוכונדריה של רשתית אנדופלזמית באמצעות בדיקת קשירת קרבה באתרה בתאים קבועים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביו-רפואי כדי לנתח טוב יותר אינטראקציות מיטוכונדריה של ER בתאים קבועים באמצעות טכניקת אימונופלואורסצנציה פשוטה. אני מקווה להציע אסטרטגיות טיפול חדשות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לדמיין ולכמת אינטראקציות מיטוכונדריה ER בתאים קבועים וניתן ליישם טכניקה זו על ביופסיות רקמה משובצות פרפין של חולים. באמצעות מבחן קשירת הקרבה באתרו המודגם בסרטון זה, נוגדן ראשוני של עכבר המכוון כנגד VDAC1 בקרום המיטוכונדריאלי החיצוני ונוגדנים ראשוניים של ארנב המכוונים כנגד IP3R1 בקרום הרטיקולום האנדופלזמי משתלבים לאפיטופים שלהם בסמיכות בממשק הממברנה המיטוכונדריאלית. מתווספות בדיקות קשירת קרבה שיש להן זנבות קצה DNA מחוברים ומכוונות כנגד IgG של עכבר וארנב ויכולות ליצור תבניות לקשירת אוליגוס מחברים וניתן להגביר ולהמחיש באמצעות אוליגונוקלאוטידים אדומים של טקסס.זה יכול להתרחש רק אם שני החלבונים הממוקדים נמצאים במרחק מתחת ל-40 ננומטר. בהסכמה עם המרחק בין שני ממברנות האברונים, בממשק הממברנה המיטוכונדריאלי. כדי לתקן ולחסום תאים לבדיקת קשירת קרבה באתר, צלח תאי H7 אנושיים ב-150,000 תאים לכל צלחת תחתית זכוכית לא מקודדת של 35 מ"מ. למחרת, הסר את מדיום התרבות והשתמש ב -1 מ"ל PBS כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן, שאפו את המאגר והוסיפו 1 מ"ל של עשרה אחוז פורמלדהיד. דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר עם תסיסה למשך 10 דקות כדי לתקן את התאים. כדי לעצור את התגובה, הוסף 1 מ"ל של 1 M גליצין וערבב את הצלחות בסיבוב. הסר את תמיסת הגליצין והוסף 1 מ"ל של 1XPBS. לאחר מכן, מערבבים לזמן קצר את הצלחות ושואפים את המאגר. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של 100 מ"מ גליצין לתאים. דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר עם תסיסה למשך 15 דקות. לאחר שאיבת התמיסה, יש לחדור לתאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.1% טריטון-X100 ב-PBS. וחזור על הדגירה. שאפו את חומר הניקוי והוסיפו 1 מ"ל PBS כדי לשטוף את התאים. לאחר הסרת המאגר, הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל צלחת תאים ודגרו את הדגימות בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן הקש על תמיסת החסימה מהכלים, מנסה להשיג כמויות שאריות שוות של חיץ עבור כל שקופית מבלי לאפשר לשקופיות להתייבש. כדי לבצע את בדיקת קשירת הקרבה, השתמש ב-PBS כדי לדלל את הנוגדנים העיקריים. מערבולת ומוסיפים את התמיסה לכלים. דגירה של הדגימות ב-4
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוצדורה להדמיה וכמותית של האינטראקציות בין הרשת האנדופלזמית למיטוכונדריה בתאים מקובעים ברגישות גבוהה. השיטה עושה שימוש ב-in situ proximity ligation assay מותאם כדי להתמקד בקומפלקסים חלבוניים ספציפיים בממשק הממברנה המשויכת למיטוכונדריה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- ביוכימיה
רקע
- הרשת האנדופלזמית והמיטוכונדריה ממלאות תפקידים מכריעים במטבוליזם התאי.
- הבנת האינטראקציות ביניהן חיונית להבהרת תפקודים תאיים.
- בדיקות קישור קרבה (Proximity ligation assays) מספקות שיטה רגישה לחקר אינטראקציות בין חלבונים.
- מחקר זה מתמקד בקומפלקס חלבונים ספציפי המעורב באינטראקציות אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להדמיה של אינטראקציות בין הרשת האנדופלזמית (ER) למיטוכונדריה.
- כימות של אינטראקציות אלו ברגישות גבוהה.
- שיפור ההבנה של מטבוליזם ותהליכי איתות תאיים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בדיקת קישור קרבה (proximity ligation assay) במקום (In situ)
- סימון של קולטן אינוזיטול 1,4,5-טריפוספט
- מעורבות של חלבון 75 מווסת-גלוקוז (glucose-regulated protein 75)
- ניתוח של קומפלקס תעלת אניונים תלוית-מתח וציקלופילין D
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של אינטראקציות בין הרשת האנדופלזמית (ER) למיטוכונדריה.
- כימות של קומפלקסים חלבוניים בממשק הממברנלי.
- הדגמה של רגישות גבוהה בזיהוי אינטראקציות.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מאפשר מחקר מפורט של אינטראקציות תאיות.
- התובנות שניתן להפיק עשויות לתרום להבנת תהליכים מטבוליים.
- ניתן ליישם שיטה זו בתחומי מחקר ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
כימות אינטראקציות אנדוגניות בין הרשתית האנדופלזמית למיטוכונדריה הוא קריטי להפחתת סיכונים בהיפותזות גילוי מוקדמות הקשורות לאיתות תאי וויסות מטבולי. בדיקת ה-proximity ligation assay in situ מאפשרת זיהוי רגיש ומולטיפלקס של נקודות מגע בין אורגנלות ללא ביטוי יתר של חלבונים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי במערכות רלוונטיות למחלה. יכולת זו מחזקת החלטות לגבי תיקי פיתוח בנקודת המפגש בין תיקוף מטרה לניתוח מסלולים מכניסטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה וכימות של מגעים בין הרשת האנדופלזמית למיטוכונדריה ברמה המולקולרית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אישור קרבה של חלבונים אנדוגניים בתאים מקובעים ובביופסיות של רקמות.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות עבור מסלולים המערבים סיגנל סידן ותקשורת בין אבנים.
- משפר את הביטחון החזוי לקידום מטרות המעורבות בהפרעות מטבוליות ובמסלולי איתות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת בדיקה סטנדרטית וניתנת לשחזור לכימות אינטראקציות חלבון-חלבון ברזולוציה תת-אברונית.
- מאפשרת בדיקה של מספר תנאים כדי להעריך את השפעת תרכובות או הפרעות גנטיות על מגעים בין ה-ER למיטוכונדריה.
- מספקת תוצאות כמותיות המתאימות לניתוח השוואתי בין זרועות ניסיוניות.
- תומכת ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור יוזמות סריקה רחבות יותר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מערכות רלוונטיות למחלה על ידי אפשור ניתוח בביופסיות של רקמות מהחולה.
- שומר על המשכיות תרגומית (translational continuity) משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות לאינטראקציות בין אברונים.
- תומך בקידום מבוסס ניהול סיכונים על ידי אספקת ראיות מכניסטיות למעורבות של מסלולים ביולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
בדיקת ליגציה של קרבה (proximity ligation assay) בשיטת in situ זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת כימות חסון של אינטראקציות בין רשתית התוך-פלזמית (ER) למיטוכונדריה בתאים וברקמות מקובעים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים עבור מנגנוני תקשורת בין אברונים.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור קמפיינים של סריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- אנליטיקה: מאפשר זיהוי רגיש של קרבה בין חלבונים במרחק של פחות מ-40 nm, ובכך מאפשר השוואה סטטיסטית של תדרי אינטראקציה.
- מחקר תרגומי: מסייע בהלימה של סממנים ביולוגיים ובתיקוף מנגנוני בדגימות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה רב-פעמית למגוון מחקרי אינטראקציה בין חלבונים במספר תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של זיהוי אינטראקציות של חלבונים אנדוגניים ברגישות וספציפיות גבוהות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי אספקת נתונים מכניסטיים חסונים בשלבים מוקדמים של תהליך הפיתוח.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מטרות עם פרופילים מאוששים של אינטראקציות עם אבנים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפרוטוקולים של אימונופלואורסצנציה ובבדיקת קישור קרבה (proximity ligation assay).
- נדרשת גישה לנוגדנים באיכות גבוהה ולתשתית של דימוי פלואורסצנטי.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים להשגת כימות הדיר רב (reproducible) לאורך מחקרים שונים.
- ניתן להתאמה הן לקווי תאים והן לביופסיות של רקמה טבועה בפרפין לצורך רלוונטיות טרנסלציונלית.
- מוגבל לדגימות מקובעות; אינו מתאים למחקרי אינטראקציה דינמיים בתאי חיים.
