ACT-Presto: סליקה רקמות ביולוגיות ושיטות immunolabeling הדמיה נפח
31 בדצמבר 2016
ACT-פרסטו (הקשורים בלחץ טכניקת בהירות פעיל העברה יעילה ויציבה של מקרומולקולות לאיברים) מאפשרת סליקת רקמות מהירה, יעילה, אבל לא יקרה וחדירת נוגדן מהירה לרקמות מסומנות על ידי דיפוזיה פסיבית או מסירה סייע בלחץ. באמצעות שיטה זו, מגוון רחב של רקמות יכול להיות מסומן, immunolabeled ידי נוגדנים מרובים, ו-צלם נפח.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבל את הרקמה הנקייה והשלמה ולדמיין את המידע המולקולרי התלת מימדי שלה באמצעות שיטות תיוג חיסוני. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי מדעי המוח והביולוגיה ההתפתחותית כגון קשרים עצביים, סיווג מולקולרי ושינוי מבני במהלך ההתפתחות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהרקמה מאפשרת בבירור ניתוח ברמה תת-תאית של דגימות גדולות ללא חתך.
כדי להתחיל בהליך זה, דגרו את האיברים הקבועים בתמיסת מונומר הידרוג'ל A4P0 בארבע מעלות צלזיוס למשך 12 עד 24 שעות בניעור עדין. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת מונומר הידרוג'ל לצינור תחתון עגול של 10 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו אליו את דגימת המוח של העכבר ועטפו את החלק העליון של הצינור ב-Parafilm.
לאחר מכן, בועות חנקן דרך הנוזל עם דגימת המוח המוחדרת בהידרוג'ל למשך דקה אחת. סגור במהירות ובחוזקה את הדגימה המכילה צינור. העבירו את הצינור לאמבט מים למשך שעתיים.
לאחר מכן, בדוק את צמיגות ההידרוג'ל ולאחר מכן שטוף את הדגימה המפולימרת לזמן קצר עם 0.1 X PBS כדי להסיר עודפי הידרוג'ל. בשלב זה, העבירו את הדגימה הפולימרית למיכל רקמות. והנח את מיכל הרקמות בתא ה-ETC.
לאחר מכן, מלאו את תא ה-ETC במאגר ETC באמצעות משאבה פריסטלטית. הגדר את תנאי ה-ETC והפעל אותו. פרוסות מוח בעובי של מילימטר עד שניים מנוקות תוך שעתיים.
ומוח שלם מתנקה מספיק תוך חמש עד שש שעות. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר עם 45 מיליליטר של 0.1 X PBS. שטפו את הדגימה מספר פעמים עם 0.1 X PBS עד שלא נראו בועות כאשר הצינור מטלטל לזמן קצר כדי לאשר הסרה מוחלטת של SDS.
כדי לבצע c-PRESTO, העבירו דגימה קטנה לתוך שפופרת של 1.5 מיליליטר. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת דילול נוגדנים עם מקדם דילול של 1 עד 500 עבור נוגדן קולגן מסוג 4 וצנטריפוגה את הצינור ב-600 פעמים גרם למשך שעתיים. לאחר מכן, שטפו את הדגימה המוכתמת עם 0.1 X PBS על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 600 פעמים גרם למשך 30 דקות.
לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת דילול נוגדנים עם מקדם דילול של 1 עד 500 עבור נוגדן משני מצומד נגד ארנב Cy3 וצנטריפוגה אותו 600 פעמים גרם למשך שעתיים. לאחר מכן, שטפו את הדגימה המוכתמת עם 0.1 X PBS על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 600 פעמים גרם למשך 30 דקות. כדי לבצע s-PRESTO עבור רקמות גדולות יותר, העבירו את הדגימה למזרק המחובר לשסתום תלת כיווני במצב השסתום הסגור.
הוסף חמישה עד שבעה מיליליטר של תמיסת דילול נוגדנים עם מקדם דילול של 1 עד 500 עבור נוגדן קולגן מסוג 4. לאחר מכן, הוסף את תמיסת הנוגדנים לדגימה על ידי פתיחת השסתום. לאחר מכן, במצב השסתום הפתוח, הגדר את בוכנת המזרק למצב של 17 מיליליטר כדי לספק מספיק מקום לתנועת נסיגת העירוי.
לאחר מכן, סגור את השסתום התלת-כיווני לאחר סיום הגדרת המזרק. הנח את המזרק המכיל את הדגימה על משאבת מזרק. הגדר את תנאי משאבת המזרק לנפח משיכת עירוי של עשרה מיליליטר לדקה וזמן הפסקה של ארבע דקות במצב מחזור רציף.
לאחר מכן, הפעל את משאבת המזרק למשך שלוש עד 24 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, פתח את השסתום התלת-כיווני והחלף את התמיסה ב-0.1 X PBS. שטפו את הדגימה המוכתמת פעמיים עם 0.1 X PBS למשך שעה בכל פעם, באמצעות משאבת המזרק.
לאחר מכן, החלף את PBS בתמיסת דילול הנוגדנים המכילה נוגדן משני מצומד Cy3 Anti Rabbit והפעל את משאבת המזרק למשך שלוש עד 24 שעות. לאחר מכן, פתח את השסתום התלת-כיווני והחלף את התמיסה ב-0.1 X PBS. לפני ההדמיה, דגרו את הדגימה המוכתמת בכמות מתאימה של תמיסת הרכבה מעוקבת למשך שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.
לאחר שעה יש להחליף את התמיסה בתמיסת הרכבה מעוקבת טרייה ולדגור למשך שעה נוספת. מכיוון שנוגדנים אינם יכולים לחדור לרקמות צפופות על ידי דיפוזיה, שיטות התיוג החיסוני של PRESTO נועדו להחדיר באופן פעיל מקרומולקולות ולהעביר ריאגנטים לרקמות צפופות. הפעלת כוחות צנטריפוגליים באמצעות צנטריפוגה סטנדרטית על השולחן הקלה באופן ניכר על אספקת הנוגדנים.
הפעלת זרימת הסעה עם משאבת מזרק שיפרה גם את חדירת הנוגדנים. עבור s-PRESTO, נעשה שימוש במשאבת מזרק כדי לספק את הנוגדנים. איברי העכבר, כמו הכליות והכבד, סומנו בקולגן מסוג 4.
בהשוואה לשיטות הקונבנציונליות, שלוש שעות של c או s-PRESTO משפרות באופן ניכר את עומק התיוג. בכליות ובכבד, עומק ציר ה-z מגיע ל-300 עד 350 מיקרומטר או עמוק יותר בדגימות PRESTO, בעוד שדגימות בקרה מסומנות בעומק של 40 עד 50 מיקרומטר בלבד. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקות אלה ביום עבור רקמות בבירור אם הן מבוצעות כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על זמן קיבוע הרקמות תחליב מונומר הידרוג'ל ורקמה אלקטרופורטית בבירור. לאחר ההליך, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תיוג חיסוני על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ניתוח דינמיקה תאית וזיהוי שקע עצבי על פני מספר איברים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי הרפואה לחקור אבחון מחלות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הטמעת הידרוג'ל ופילמור רקמות. אל תשכח שעבודה עם תמיסת מונומר הידרוג'ל עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
ACT-PRESTO היא טכניקה חדשנית להבהרה יעילה של רקמות ולחדירת נוגדנים, המאפשרת ויזואליזציה מפורטת של מידע מולקולרי ברקמות מבהרות. שיטה זו מקלה על ניתוח ברמה התת-תאית של דגימות גדולות ללא צורך בחיתוך.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- ACT-PRESTO מאפשר ביצוע של הבהרת רקמות מהירה וזולה.
- טכניקה זו תומכת בסימון אימונו-היסטוכימי באמצעות מספר נוגדנים.
- היא משפרת את עומק הסימון ברקמות גדולות.
- ניתוח תת-תאי אפשרי ללא צורך בחיתוך של הרקמה.
מטרת המחקר
- להדמיה של מידע מולקולרי תלת-ממדי ברקמות.
- לחקירת קשרי עצבים ושינויים מבניים במהלך ההתפתחות.
- לשיפור חדירות הנוגדנים ברקמות צפופות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דגירה של איברים מקובעים בתמיסת מונומר של Hydrogel.
- שימוש במשאבת מזרק להחדרת נוגדנים.
- הפעלת כוחות צנטריפוגליים לשיפור חדירות הנוגדנים.
- סימון אימונולוגי של איברים שונים בעכבר.
תוצאות עיקריות
- עומק סימון משופר ברקמות כליה וכבד.
- עומק הסימון הגיע ל-300-350 micrometers במדגמי PRESTO.
- שיפור משמעותי לעומת שיטות קונבנציונליות.
- ניתן להשלים את הטכניקות בתוך יום אחד אם הן מבוצעות נכון.
מסקנות
- ACT-PRESTO הוא כלי רב עוצמה לניתוח רקמות במחקר רפואי.
- הוא מאפשר מחקרים מפורטים של דינמיקה תאית ומבנים נוירונליים.
- טיפול נכון בתמיסות Hydrogel הוא קריטי לבטיחות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ACT-PRESTO מאפשר שקיפות רקמות מהירה וניתנת לשחזור וסימון אימונולוגי עמוק עבור דימות תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של דגימות ביולוגיות שלמות. יכולת זו נותנת מענה לצוואר בקבוק קריטי בשלבי מחקר של גילוי, על ידי שימור מידע מולקולרי מרחבי והאצת בחינת ארכיטקטורות רקמה מורכבות. השיטה תומכת ברציפות תרגומית משלבי הגילוי המוקדמים ועד לפיתוח מודלים פרה-קליניים, באמצעות היתכנות למיפוי מולקולרי חסון במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מקל על מיפוי מולקולרי ומבני מקיף ברקמות שלמות לצורך תיקוף מטרות.
- מאפשר הפחתת סיכונים פונקציונלית על ידי חשיפת הארגון התאי וההתפלגות המולקולרית ללא ארטיפקטים של חיתוך.
- תומך בביטחון ניבויי לגבי מעורבות המטרה ואנליזה של מסלולים באמצעות סימון אימונולוגי נפחוני.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין רקמות שקופות ומסומנות אימונו-היסטוכימית כמערכות מתוקפות עבור תהליכי סריקה המשכיים.
- מספק עומק סימון אימונו-היסטוכימי סטנדרטי וניתן לשחזור לצורך פיתוח בדיקות כמותיות.
- מאפשר הכנה בהיקף רחב של דגימות רקמה גדולות עבור דימות וניתוח בעלי תוכן גבוה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים פלטי דימות מולקולרית למודלים של רקמות הרלוונטיים למחלה עבור מחקרי ביומרקרים תרגומיים.
- שומר על ההקשר המרחבי לצורך תיקוף פרה-קליני של היפותזות טיפוליות.
- מפחית את הסיכון לאובדן מידע במהלך עיבוד הרקמה, ובכך תומך בקבלת החלטות פרה-קלינית רהוטה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
ACT-PRESTO משתלב בממשק שבין ביולוגיית גילוי למחקר פרה-קליני, ומאפשר מעבר חלק מבדיקת היפותזות מולקולריות לניתוח רקמות מעמיק.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת במיפוי מונחה-היפותזה של מאפיינים מולקולריים ותאיים באיברים שלמים.
- סריקה: מספקת סימון אימונולוגי כמותי וניתן לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת מערכי נתונים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח השוואתי של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: משמרת ארכיטקטורה רקמנית רלוונטית למחלה לצורך התאמה ותיקוף של סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פרוטוקול מהיר וניתן להרחבה, הניתן להתאמה לסוגי רקמות שונים ולתוכניות מחקר מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים מבוססי רקמות.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה מהירות, סטנדרטיות וניתנות לשחזור של הבהרה וסימון רקמות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקה של תהליכים (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום נכסי גילוי ונכסים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמות, סימון אימונולוגי וניתוח דימויים בתלת-ממד.
- מחייב גישה לתאי אלקטרופורזה, משאבות מזריקים ופלטפורמות דימוי ברזולוציה גבוהה.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים של פרוטוקולי הכנת דגימות וסימון.
- ניתן להשמה במערכות איברים שונות, אך עשוי להצריך אופטימיזציה עבור צפיפות רקמה וחדירות נוגדנים.
- הטיפול במונומרים של הידרוג'ל מחייב נקיטת אמצעי בטיחות מחמירים עקב ריאגנטים מסוכנים.
