Name: כימות היסטולוגית של אוטם שריר לב כרוני אצל חולדות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למדו שיטה היסטולוגית לכימות אוטם שריר לב כרוני בחולדות באמצעות דגימה שיטתית וניתוח תמונות של חתכי לב צבועים בטריכרום. טכניקה זו מאפשרת הערכה מדויקת של גודל האוטם ושל שינויים בחדר השמאלי במהלך תהליכי שיקום הלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי הקרן הלאומית השוויצרית [SNF 310030-149986 ל-MNG], אוניברסיטת פריבורג ובית החולים פריבורג.

כל החיות קיבלו טיפול אנושי בהתאם לאמנה האירופית על טיפול בבעלי חיים. הליכים כירורגיים בוצעו בהתאם לחוק צער בעלי חיים השוויצרי לאחר קבלת אישור של משרד וטרינר ממשלתי, פריבורג, שאושר על ידי משרד וטרינרית הפדרלי השוויצרי, שוויץ. קציר לב 1. הערה: כל התערבות כירורגית בוצעו תחת הרדמה isoflurane. נעשו מאמצים להקטין סבל לבעלי חיים. בפרט, כל החיות קיבלו הזרקה תת עורית של 0.1 מ&quot;ג /-הרדמה מראש עצירות ק&quot;ג. הפרוטוקול כירורגית עבור inducting אוטם שריר לב תואר בעבר במקום אחר 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע sternotomy על חית myocardially אוטמת בהרדמה (חיה מחוברת לצינורות, 2.5% isoflurane, הרדמה תקינה אושר על ידי רפלקס קמצוץ כפה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את החיה על ידי חיתוך העור ולאחר מכן את השריריםעם מספריים כירורגיות. חותכים את הצלעות על ימין ועל שמאל, ולאחר מכן הסר את החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ההידבקויות הנותרות לאחר הניתוח הקודם (קשירת LAD). חותכים את אבי העורקים ולהסיר את הלב. שים את רקמות 1 M KCl (PBS), ולאחר מכן לשטוף אותו עם PBS. </li></ol></li></ol> 2. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב אוטם אורכי מטריקס לב עכברוש אקריליק. שמור את זה ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הלב ישירות במטריצה ​​באמצעות סכין גילוח עם משוכל. ודא כל פרוסה הוא בעובי 2 מ&quot;מ. חותך כ 5 - 7 שקופיות עבור כל לב (בהתבסס על רמת השיפוץ); זה נקרא דגימה שיטתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, ביצוע כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium מכתים (TTC) הוא אופציונלי (לשמור על הכיוון של base-to-איפקס פרוסות הלב). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגירים TTC 1% ב PBS במשך 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. דגירה זה paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות עד 1 שעה. שים את הסעיפים between שני לוחות זכוכית עם מפרידי 2 מ&quot;מימ ומצלמים עם מיקרוסקופ stereological מצמיד עם מצלמה בהגדלה 15X. זְהִירוּת! Paraformaldehyde רעיל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפאת שקופיות (אפשרות st 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כל שקופית בתוך תבנית פלסטיק (10 x 10 x 5 מ&quot;מ) עם הרכבה בינונית עבור cryotomy (הטמפרטורה חיתוך אופטימלי, אוקטובר), לשמור על האוריינטציה (למקם את הצד איפקס מונחה של הסעיף למטה בחלק התחתון של עובש). להקפיא את אובניים עם אדי 2-methylbutane תחת חנקן נוזל קירור במשך 10 - 15 דקות. לבסוף, לאחסן את הרקמה ב -80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Paraffinization (2 אפשרות nd) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח כל שקופית הטבעת קלטות (לשמור על האורינטציה על ידי נחת צד אורינטציה-איפקס של הסעיף למטה בחלק התחתון של הקלטת) ולאחר מכן ב 4% PFA למשך 24 שעות. שים את זה בתוך לילה מכונה מעבד רקמות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זה 70% אתנול עבור שעה 2. דגירה זה ethanol 95% עבור 2 שעות. דגירה זה 100% אתנול עבור 3 שעות. דגירה זה xylol עבור 4 שעות. דגירה זה פרפין (מותכת ב 60 ° C בתנור) במשך 5 שעות. לבסוף, לעשות בלוקים על ידי הטבעת כל שקופית לב פרפין. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. מסון-גולדנר Trichrome מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך קטעי רקמה מבלוקים פרפין עם microtome ידנית (עובי: מיקרומטר 5) או מבלוקים אוקטובר עם cryostat מוגדר -18 ° C (עובי: מיקרומטר 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם שקופיות אחד מכל חלק לב לכל חולדה (3 - 4 חלקים משוכל לכל שקופית) עם מסון-גולדנר trichrome מכתים (ראה נספח). הערה: התחל שלב זה עבור חלקי פרפין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס בתנור. מתחת למכסה מנוע קטר, deparaffinize אותם xylol פעמים במשך 10 דקות כל אחד. רעננותם אותם אתנול 100%, 95% אתנול, 70% אתנול, ומים מזוקקים במשך 3 דקות כל אחד. הערה: התחל שלב זה עבור cryosectionים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן אותם לילה פתרון Bouin. לאחר מכן, לשטוף אותם במים זורמים מהברז במשך 10 - 15 דקות. יש לשטוף אותם במים מזוקקים. דגירה אותם hematoxylin של מאייר במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות ולהשאיר אותם במים מזוקקים למשך 5 דקות. לאחר מכן, דגירה אותם בחומצה Fuchsin-Ponceau למשך 5 דקות. יש לשטוף אותם 1% חומצה אצטית 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, דגירה אותם בחומצה phosphomolybdic אורנג G דקות 1. יש לשטוף אותם 1% חומצה אצטית דקות 1, דגירה אותם לצבוע בצבע ירוק בהיר במשך 10 דקות, ולשטוף אותם בחומצת 1% אצטית דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש אותם אתנול 70% (30 שניות), 95% אתנול (30 שניות), ו -100 אתנול% (5 דקות). לשים טיפה אחת של הרכבה בינונית שרף על סעיפי רקמות, לכסות אותם עם coverslips, ולתת להם להתייבש. </li></ol></li></ol> 4. ניתוח גודל האוטם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סריקתתמונה אחד מכל להחליק על (בהגדלה 15X) סטראו יחד עם המצלמה. לצלם שליט עם אותה הגדרהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי למדוד את עובי הצלקת באמצע האוטם, עובי מחצה, חדר השמאלי באזור החלל (LV), באזור האוטם, ואזור רקמת LV משתמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קנה המידה עם התמונה השלטת (איור 1 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקישו על מדידות ולאחר מכן בחר Set המרה גורם. צייר קו בסרגל הכיול. קליק ימני על התמונה ולחץ על כיול הסוף. הערת הערך הבר, ולאחר מכן לחץ על אישור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את LV מתמונת הלב המוכתם (האיור 1B). השתמש בכלי סגמנטים רבים. בחר את הנקודה-ידי נקודות LV, קליק ימני ואז העתק / הדבק בכל מקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את עובי הצלקת מחצה באמצעות כלי מדידה למגזר אחד (איור 1 ג </stרונג&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי אוטומטי של החלל, אוטם LV, ואזורי LV שימוש באפשרות מדידת השטח האוטומטית במצב RGB (1D איור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכלי. הפעל רק גבולות רציף במצב RGB. לבסוף, לחץ בתוך השטח של עניין לזהות אותו. במידת הצורך, להשתמש בכלי דיוק. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את גודל האוטם כיחס באזור האוטם לאזור LV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב המדד הרחבה כדלקמן: [אזור חלל LV / כל אזור LV] / [עובי אוטם / עובי מחצה], עם אזור LV כולו כולל הוא את חלל LV ואזורי רקמות LV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, חשב &quot;ממוצע&quot; עבור כל לב כדלקמן: [ממוצע של מדד הרחבה מן השקופיות האוטמות] [מספר השקופיות אוטמות / סה&quot;כ שקופיות] *. </li></ol>

<ol><li>Amsterdam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHA%2FACC+Guideline+for+the+Management+of+Patients+with+Non-ST-Elevation+Acute+Coronary+Syndromes%3A+a+report+of+the+American+College+of+Cardiology%2FAmerican+Heart+Association+Task+Force+on+Practice+Guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">AHA/ACC Guideline for the Management of Patients with Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines.</a> J Am Coll Cardiol. 64, e139-e228 (2014).</li>
<li>Konstam, M. A., Kramer, D. G., Patel, A. R., Maron, M. S., Udelson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+remodeling+in+heart+failure%3A+current+concepts+in+clinical+significance+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Left ventricular remodeling in heart failure: current concepts in clinical significance and assessment.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 4, 98-108 (2011).</li>
<li>Frobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Value+of+Troponin+I+for+Infarct+Size+to+Improve+Preclinical+Myocardial+Infarction+Small+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prognostic Value of Troponin I for Infarct Size to Improve Preclinical Myocardial Infarction Small Animal Models.</a> Front Physiol. 6, 353(2015).</li>
<li>Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+and+area+at+risk+assessment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice.</a> Exp Clin Cardiol. 17, 268-272 (2012).</li>
<li>Guex, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-functionalized+electrospun+matrix+for+biograft+development+and+cardiac+function+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization.</a> Acta Biomater. 10, 2996-3006 (2014).</li>
<li>Landa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+injectable+alginate+implant+on+cardiac+remodeling+and+function+after+recent+and+old+infarcts+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat.</a> Circulation. 117, 1388-1396 (2008).</li>
<li>Valente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+heart+sampling+and+systematic+evaluation+of+cardiac+therapies+inmouse+models+of+ischemic+injury%3A+Assessment+of+cardiacremodeling+and+semi-automated+quantification+of+myocardial+infarctsize%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized heart sampling and systematic evaluation of cardiac therapies inmouse models of ischemic injury: Assessment of cardiacremodeling and semi-automated quantification of myocardial infarctsize.</a> Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 359-391 (2015).</li>
<li>Csonka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+myocardial+infarct+size+in+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 163-170 (2010).</li>
<li>Zornoff, L. A., Paiva, S. A., Minicucci, M. F., Spadaro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+myocardium+infarction+in+rats%3A+Analysis+of+the+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arq.+Bras+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Experimental myocardium infarction in rats: Analysis of the model.</a> Arq. Bras Cardiol. 93, 434-440 (2009).</li>
<li>Lichtenauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+measurement+using+geometric+angle+calculation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size measurement using geometric angle calculation.</a> Eur J Clin Invest. 44, 160-167 (2014).</li>
<li>Lutgens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+myocardial+infarction+in+the+mouse%3A+cardiac+structural+and+functional+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Chronic myocardial infarction in the mouse: cardiac structural and functional changes.</a> Cardiovasc Res. 41, 586-593 (1999).</li>
<li>Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, L., Giraud, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+for+heart+failure+in+rat%3A+double+thoracotomy+for+myocardial+infarction+and+epicardial+implantation+of+cells+and+biomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy for heart failure in rat: double thoracotomy for myocardial infarction and epicardial implantation of cells and biomatrix.</a> J Vis Exp. , e51390(2014).</li>
<li>Takagawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+measurement+in+the+mouse+chronic+infarction+model%3A+comparison+of+area-+and+length-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches.</a> J Appl Physiol (1985). 102, 2104-2111 (2007).</li>
<li>Fishbein, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phase+acute+myocardial+infarct+size+quantification%3A+validation+of+the+triphenyl+tetrazolium+chloride+tissue+enzyme+staining+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique.</a> Am Heart J. 101, 593-600 (1981).</li>
<li>Weisman, H. F., Bush, D. E., Mannisi, J. A., Weisfeldt, M. L., Healy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+myocardial+infarct+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of myocardial infarct expansion.</a> Circulation. 78, 186-201 (1988).</li>
<li>Mannisi, J. A., Weisman, H. F., Bush, D. E., Dudeck, P., Healy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+administration+after+myocardial+infarction+promotes+early+infarct+expansion.+A+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Steroid administration after myocardial infarction promotes early infarct expansion. A study in the rat.</a> J Clin Invest. 79, 1431-1439 (1987).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול רקמת פיברוטית ניתן להעריך במדויק במודל חולדה כרוני MI באמצעות דגימה שיטתית של לב שנקטף ותמונת מנתח סעיפים היסטולוגית מוכתמת טריים-כרומטית המתקבלים בסיס לקודקוד. שני צעדים חשובים במיוחד עבור יישום פרוטוקול מוצלח. ראשית, השימוש KCl לקציר הלב מאפשר שריר הלב להישמר במצב רגוע. שלב זה חשוב להשוואות של ממדים אוטמים מלבבות שונות. שנית, קיבעון הלילה של הסעיף בתמיסת Bouin הוא ק...

אוטם שריר הלב (MI) הוא הגורם המוביל למוות ונכות בעולם. מחלת לב כלילית היא הגורם העיקרי; MI נובע איסכמיה רצוף לאירועים כליליים כגון חסימה. כאשר רה-פרפוזיה לא מבוצע בתוך 6 שעות, איסכמיה הראשון גורם נמק שריר הלב בלתי הפיך. בחולים, האפיון של MI מסתמך על כלי אבחון שונים, לרבות סימנים קליניים, electrocardiography, הערכת רמות הפלזמה של סמנים ביולוגיים, אקו, הדמית MRI, היסטולוגית מנתח 1. אקוטי וכרוני MI מסווגים לשני שלבים שונים של פגיעה, בהתאם לעיתוי של יחסי נמק שריר הלב אל זמן של חסימה כלילית. בשלב החריף, המתרחשים במהלך 7 הימים הראשונים, מזוהה עם הפסד של cardiomyocytes, דלקת נרחבת, ועל הגיוס של פיברובלסטים. השלב תת-חריפים, מאופיינת הריפוי של רקמת לב ואת היווצרות צלקת, מתרחשבין 1 ל -4 - 6 שבועות. הרחבת האוטם, דליל קיר החדר, ואת התרחבות החדר לאפיין בשלב הכרוני. שיפוץ נרחב של החדר השמאלי תוצאות בהדרגה אי ספיקת לב חמורה 2. MI המושרה על ידי קשירת העורק השמאלי הקדמי היורד קבע (LAD) מייצג את המודל מכרסם רמת אוטם לבבי כרוני. מחק ליגטורה כלילית החסימה כלילית. גודלו של האוטם תלוי באתר של המיתר. אפיון של פגיעת איסכמית שריר לב במודל מכרסם מבוצע באופן קלסי באמצעות רמות פלזמת סמן ביולוגיות, כגון טרופונין I ו- T 3, אקו, MRI, היסטולוגיה 4,5. רמות ביומרקר מתואמות עם היקף הרג cardiomyocyte. אקו מעריך את ירידת הערך השמאלית הפונקציה חדרית הנובע הפרעות תנועת קיר אזוריות. בנוסף, טכניקות הדמיה לא פולשנית, כגון MRI או ברזולוציה גבוההאקו, לאפשר ההערכה של הירידה בתנועת קיר, ההיקף באזור הצלקת עם זלוף מופחת שריר לב קיימא, ואת דליל הקיר. ממדים LV להתיר הערכה מדויקת של גודל האוטם. לבסוף, כימות של שריר לב קיימא והמת יכולה להתבצע לאחר מוות באמצעות כתמים ספציפיים סעיפים היסטולוגית של לבבות שנקטפו ומאפשרת אימות של גודל האוטם (IS). תכונה חשובה נוספת היא ההערכה של מדד ההתרחבות האוטמת (EI) 6. EI קשורה אוטם transmural והתחלות בתוך 3 הימים הראשונים. EI מאופיין הפחתה הדרגתית עובי דופן, גידול בגודל חלל LV, ושינויים סוגרים בכושר LV. על מנת להעריך את היעילות הטיפולית של טיפולים חדשניים - בפרט, אסטרטגיות המשובים מבוססים על תאים, מטריצות, והערכת משלוח-מדויק גן של MI במכרסמים היא בעלת חשיבות עליונה.כאשר נמדדו על חתך יחיד שהושג ברמת שריר פפילרי, הגודל הוא עלול להיות מוטה בשל ההשתנות הגדולה שמקיים בפיתוח האוטם הבא קשירת LAD; ייתכן אוטם איפקס אז וטשטש. חשוב לציין, יותר מתודולוגיות מדויקת לגודל נקבע MI תוארה עבור עכברים 7-9 או חולדות 10. אף על פי כן, IS אינו מספיק כדי לכמת LV שיפוץ במדויק או הפחתות מושרות טיפולי (או סיכולים) של השיפוץ. ואכן, היא מתבטאת בדרך כלל כאחוז נפח LV הכולל הוערך על חתכי רוחב של הלב. אמנם שיטה זו תקפה עבור אוטם לבבי חריף, הדילול של קיר LV המתרחשים במהלך השיפוץ נשאר תחת הערכת 11,12. כימות morphometric מלאות של גודל אוטם ושינויים מבניים צריכות לכמת מספר פרמטרים, כגון אורכי endocardial ו epicardial ובקטרים, כמו גם אוטם ואזורים בריאים. אנו מתארים appr מתודולוגייםאוח כדי להעריך נכון MI שיפוץ במודל חולדה כרונית.

<table><tbody><tr><td>מטריצת לב חולדה אקרילית 2 מ"מ</td><td>72-5015</td><td>הרווארד Appartus</td><td></td></tr><tr><td>Inspira מאוורר מתקדם מבוקר נפח</td> מכשיר <td>הרווארד</td><td>557058</td><td></td></tr><tr><td>צנתר אינסיט 14 G</td><td>BD</td><td>381267</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T</td><td>BDHA361603E</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>T8877-10G</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td></tr><tr><td>מאייר המטוקסילין</td><td>MHS32-1L</td><td>סיגמא חומצה אולדריץ</td><td></td></tr>' <tr><td>פוקסין CI 42685</td><td>F8129-50G</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td></tr><tr><td>פונסו קסילידין CI 16150</td><td>P2395-25G</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td></tr><tr><td>תפוז G CI 16230</td><td>O3756-100G</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td></tr><tr><td>ירוק בהיר CI 42095</td><td>L5382-25G</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>P9333-500G</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td></tr><tr><td>קסילול</td><td>10315083</td><td>HoneyWell</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>10303990</td><td>HoneyWell</td><td></td></tr><tr><td>2-מתילבוטן</td><td>M32631-1L</td> מיקרוסקופ סטריאוגי <td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SM2800</td><td>קלטת הטבעה של Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>99340</td><td>Reactolab</td><td></td></tr><tr><td></td><td>K113.1</td><td>קארל רוט</td><td></td></tr><tr><td>ברסופט תוכנת</td><td></td> מדידת תמונה <td>Bersoft.com</td><td>תוכנה מורשית</td></tr></tbody></table>

כימות היסטולוגית של אוטם שריר לב כרוני אצל חולדות

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

אוטם שריר הלב מוגדר כמוות קרדיומיוציטים עקב איסכמיה ממושכת; תגובה דלקתית והיווצרות צלקת (פיברוזיס) עוקבות אחר הפגיעה האיסכמית. לאחר השלב האקוטי הראשוני, שיפוץ כרוני של החדר השמאלי (LV) משנה את מבנה ותפקוד הלב. קשירה כלילית קבועה בבעלי חיים קטנים שימשה באופן נרחב כמודל ייחוס למודל כרוני של MI. דילול הדופן האוטם מתפתח בהדרגה לפיברוזיס טרנסמורלי. הערכה היסטולוגית של גודל האוטם מבוצעת בדרך כלל; עם זאת, חסרה סטנדרטיזציה של שיטות הכימות ואכן, היבטים מתודולוגיים חשובים, כגון מספר הקטעים שנותחו ושיטות הדגימה והכמות, אינם מתוארים בדרך כלל ולכן מונעים השוואה בין חקירות. לעתים קרובות מדי, כימות מתבצע על קטע בודד המתקבל ברמת השרירים הפפילריים. מכיוון שאסטרטגיות חדשות שמטרתן להפחית את התרחבות האוטם ועיצוב מחדש נמצאות בבדיקה, יש צורך חשוב בסטנדרטיזציה של פרוטוקולי דגימת לב מדויקים. אנו מתארים שיטה מדויקת לכימות גודל האוטם באמצעות דגימה שיטתית של לב חולדה שנקטף וניתוחי תמונה של חתכים היסטולוגיים מוכתמים טריכרומטיים המתקבלים מהבסיס לקודקוד. אנו מספקים גם ראיות לכך שחישוב מדד ההתפשטות (EI) איפשר הערכת גודל אוטם, תוך התחשבות בשינויים של החדר השמאלי לאורך השיפוץ.

שישה שבועות קשירה שלאחר LAD, לבבות נבצרו חולדות לואיס. 2 מ&quot;מ סעיפי רקמות התקבלו מן הקודקוד לבסיס. הליך מכתים TTC בוצע על מנת להמחיש את האזור האוטם, המופיע בלבן, ואת שריר לב הבריא, המופיע באדום (איור 2). בהתאם לאתר של קשירת LAD, גודל האוטם משתנה. עבור MI גדול, אוטמים transmural נצפו מן הקודקוד לבסיס (איור 2 א). קטן אוטמים הציג רקמה לבנה אוטם גלויה מן הקודקוד אל אמצע הקטע של הלב (איור 2 ב). לקבל...

ההערכה שלאחר המוות של אוטם שריר הלב (MI) במכרסמים מבוססת על כימות האוטם בקטעי לב מוכתמים. אנו מתארים שיטה מדויקת לכימות גודל האוטם באמצעות דגימה שיטתית של לבבות חולדות שנקטפו מהבסיס לקודקוד וניתוחי תמונה של חתכים היסטולוגיים מוכתמים בטריכרום.

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

המטרה הכוללת של הליך היסטולוגי זה היא לבצע כימות מורפומטרי של מדד התרחבות האוטם ופרמטרים מבניים של הלב באמצעות מודל של אוטם שריר הלב בחולדה, וזאת כדי להעריך את גודל האוטם ואת עיצובו מחדש (remodeling) של החדר השמאלי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הלב, כגון השפעתה של תרפיה רגנרטיבית לאחר אוטם שריר הלב או אסטרטגיות חדשניות השואפות להפחית את התרחבות האוטם. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא השימוש בדגימה סיסטמטית של לב החולדה שנלקח, כדי להעריך במדויק את גודל האוטם ולהביא בחשבון את השינויים בחדר השמאלי לאורך תהליך העיצוב מחדש.מעקב אחר שיטה זו יכול לספק תובנות לגבי גודל האוטם במודל כרוני של אוטם שריר הלב בחולדה. ניתן ליישמה גם בעכברים או במודלים איסכמיים אחרים, כגון אוטם שריר לב חריף או איסכמיה-רפרפוזיה. כדי להתחיל בהליך זה, בצע סטרנוטומיה בבעל חיים עם אוטם בשריר הלב תחת הרדמה.בצעו חתך בעור ובשרירים לאורך עצם החזה באמצעות מספריים כירורגיים. לאחר מכן, גזרו את הצלעות מצד שמאל ומצד ימין כדי להסיר את בית החזה. לאחר מכן, הסירו את ההדבקות שנותרו לאחר קשירת ה-LAD.גזרו את האורטה והוציאו את הלב, ולאחר מכן הניחו את הרקמה ב-PBS עם potassium chloride בריכוז one molar למשך פחות מדקה לפני השטיפה ב-PBS. כדי לשמר את הרקמה, יש להסיר בזהירות את ה-PBS מתוך הפרונטריקולים. לאחר מכן, העבירו את הלב עם האוטם (infarcted heart) למטריקס אקרילי עבור לב חולדה ומקמו אותו באופן אורכי.לאחר מכן, שמרו את הדגימה בטמפרטורה של 20°C- למשך שעה אחת. לצורך דגימה סיסטמטית לאחר שעה, חתכו את הלב ישירות בתוך המטריקס באמצעות להב תער. ודאו שכל פלח בעובי של 2 mm.בשלב הבא, בצעו צביעת TTC על ידי דגירה של החתכים ב-1%TTC למשך 15 דקות ב-37 degrees celsius, ולאחר מכן דגרו אותם ב-4%PFA למשך 20 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הניחו את החתכים בין שתי לוחיות זכוכית עם מפרידי 2 mm וצלמו באמצעות מיקרוסקופ סטריאולוגי המחובר למצלמה בהגדלה של 15x. נוהל צביעת TTC בוצע כדי להדמיז את אזור האינפארקט, המופיע בלבן, ואת השריר הלבבי הבריא, המופיע באדום.במקרה של אוטם שריר לב רחב, נצפו אוטמים טרנסמוראליים (חוצי-דופן) מהשיא (apex) ועד לבסיס. אוטמים קטנים יותר התבטאו ברקמה מוטמת לבנה שנראתה מהשיא ועד לחלק האמצעי של הלב. עבור אוטמים קטנים שאינם טרנסמוראליים, נצפתה רקמה פיברוטית רק באחד או שניים מהחתכים מהשיא.כדי להקפיא את החתכים, מקמו כל חתך בתבנית פלסטיק עם תוך קיבוע לקריוטומיה (mounting medium for cryotomy) והניחו את הקודקוד כלפי מטה בתבנית. הקפיאו את הבלוקים באמצעות אדי 2-Methylbutane תחת קירור של חנקן נוזלי למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, אחסנו את הרקמות בטמפרטורה של minus 80 degrees celsius.לצורך פראפיניזציה, מקמו כל נתח בקסטת הטמעה כאשר הקודקוד פונה כלפי מטה, ולאחר מכן השאירו את הקסטות ב-4% PFA למשך 24 שעות. לאחר מכן, מקמו אותן במעבד רקמות למשך הלילה. עם סיום התהליך, הכינו בלוקים על ידי הטמעת כל נתח לב בפראפין.בפרוצדורה זו, הכינו חתכי רקמה בעובי 5 מיקרון מבלוקי הפרפין באמצעות מיקרוטום ידני. לאחר מכן, צבעו שקופית אחת מכל חתך לב עבור כל חולדה באמצעות צביעת Masson-Goldner trichrome. עבור חתכי הפרפין, המסו את הרקמות בטמפרטורה של 60 °C בתנור.בתוך מ常用的 מנדף כימי, בצעו הסרת פראפין ב-xylol פעמיים למשך עשר דקות בכל פעם. לאחר מכן, בצעו רהידרציה ב-100%ethanol, 95%ethanol, 70%ethanol, ולאחר מכן במים מזוקקים למשך שלוש דקות בכל שלב. עבור החתכים שעברו הסרת פראפין ועבור חתכי הקריו, בצעו קיבוע בתמיסת Bouin למשך לילה.למחרת בבוקר, שטפו אותם תחת מי ברז זורמים למשך 10 עד 15 דקות, ולאחר מכן שטפו שוב במים מזוקקים. קיבוע ב-Bouin הוא השלב החשוב ביותר להבטחת צביעת Goldner מצוינת. דגרו אותם ב-Mayer's hematoxylin למשך שלוש דקות.לאחר שלוש דקות, הוצא את השקופיות והשאר אותן במים מזוקקים למשך חמש דקות. לאחר מכן, דגור אותן ב-ponceau acid fuchsin למשך חמש דקות לפני שטיפה ב-1%acetic acid למשך דקה אחת. לאחר מכן, דגור את החתכים ב-phosphomolybdic acid orange g למשך דקה אחת ולאחר מכן שטוף אותם ב-1%acetic acid למשך דקה אחת.דגרו בצבע ירוק בהיר למשך עשר דקות ולאחר מכן שטפו ב-1%acetic acid למשך דקה אחת. לבסוף, בצעו דהידרטציה לחתכים ב-70%ethanol למשך 30 שניות, 95%ethanol למשך 30 שניות, ו-100%ethanol למשך חמש דקות באופן רציף. טפטפו טיפה אחת של חומר עיגון שרפי על חתכי הרקמה, כסו אותם בזכוכית כיסוי והניחו אותם לייבוש.בשלב זה, רכשו תמונה אחת מכל סלייד באמצעות מיקרוסקופ סטריאו המחובר למצלמה בהגדלה של 15x. צלמו סרגל תחת אותן הגדרות. נחתכו סדרה של חתכים בעובי חמישה מיקרון מכל פרוסה של הלב, ואלו נצבעו ב-Masson-Goldner trichrome.רקמות בריאות הופיעו באדום ורקמת החיבור בירוק. לאחר מכן, השתמשו בתוכנה לניתוח תמונות כדי למדוד את עובי הצלקת במרכז האוטם (infarct), את עובי המחיצה (septum), את שטח חלל החדר השמאלי, את שטח האוטם ואת שטח רקמת ה-LV. לשם כך, הגדירו את קנה המידה באמצעות תמונת הסרגל.לחצו על measurements ובחרו ב-set conversion factor. שרטטו קו על סרגל הכיול. לחצו קליק ימני על התמונה ולחצו על end calibration.יש לשים לב לערך הסרגל ולאחר מכן ללחוץ על OK. השתמש בכלי המקטעים המרובים (multiple segment tool) כדי לבחור את ה-LV נקודה אחר נקודה, ולאחר מכן לחץ קליק ימני כדי להעתיק ולהדביק בכל מקום. לאחר מכן, מדוד את עובי הצלקת והמחיצה באמצעות כלי מדידת המקטע הבודד (single segment measurement tool). לאחר מכן, בצע זיהוי אוטומטי של חלל ה-LV, האוטם (infarct) ושטחי ה-LV באמצעות כלי מדידת השטח האוטומטי במצב RGB.הפעלו רק את אפשרויות ה-borders וה-contiguous במצב RGB. לבסוף, לחצו בתוך אזור העניין כדי לזהות אותו. לאחר מכן, חשבו את גודל האינפקט כיחס בין שטח האינפקט לשטח ה-LV.לאחר מכן, חשבו את מדד ההתרחבות באמצעות נוסחה זו. לבסוף, חשבו ממוצע עבור כל לב באמצעות הנוסחה המוצגת. מדד ההתרחבות שחושב מצביעת Goldner הוא מדד טוב להערכת התפתחות האוטם.כפי שמוצג באיור, קיים מתאם עם גודל האינפארקט המבוטא כאחוז מהחדר השמאלי ועם מקדם הפליטה שנמדד באמצעות אקו-קרדיוגרפיה. בגרפים מוצגים הרגרסיה הליניארית ומרווחי סמך של 95%. מדד התרחבות האינפארקט חושב כפי שמתואר בנוסחה כאן.את כל שטח ה-LV מדדו כשילוב של שטח חלל ה-LV ושטח רקמת ה-LV. אחוז האוטם חושב כפי שמוצג. התפקוד הוערך ששה שבועות לאחר קשירת ה-LAD באמצעות אקו-קרדיוגרפיה ברזולוציה גבוהה.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ביצוע דגימה שיטתית של הלב וכיצד להעריך את גודל האוטם בהתבסס על ניתוח תמונה של חתכים צבועים.

histological-quantification-of-chronic-myocardial-infarct-in-rats

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מניפולציות גנטיות רבות ו / או זריקות intramyocardial של גנים, חלבונים, תאים, ו / או biomaterials באים על גבי מימד הזמן במחקרים של פגיעה איסכמיה / reperfusion חריפה שיפוץ כרונית בעכברים. וידאו זה ממחיש את הליכי microsurgical עבור איסכמיה / reperfusion, קשירת עורק כלילי קבע, ומחקרים הזרקת intramyocardial.

קשירת עורקים כלילית לבין הזרקת Intramyocardial ב מודל Murine של אוטם

פרוטוקול זה מתאר את המודל חזירי אוטם שריר הלב (MI) באמצעות חסימת 90 דקות סגורות חזה בלון הכליליים של העורק השמאלי הקדמי יורד (LAD), ואחריו reperfusion. יתר על כן, הפרוטוקול למספר פרמטרים תוצאה, כמו תפקוד לב, פרמטרים המודינמיים, התנגדות כלי הדם, וגודל אוטם, הם גם הציגו.

אוטם שריר לב והערכת תוצאה תפקודית בחזירים

מתואר מודל בעל יכולת שחזור גבוהה לאוטם שריר הלב בעכברים עם מניפולציות פולשניות מינימליות. ניתן לבצע את המודל בקלות, וכתוצאה מכך יכולת שחזור ושיעור הישרדות גבוהים. לפיכך, המודל המתואר יפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים כמתבקש על ידי עקרון 3R (החלפה, עידון והפחתה).

נוהל כירורגי זעיר פולשנית של גרימת אוטם שריר הלב בעכברים

שיטה זו מתארת את השימוש בטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת קוונטית (MicroCT) כדי להעריך את המורפולוגיה הלבבית, התפקוד, הזלוף, חילוף החומרים והכדאיות עם חומר ניגוד יוד בעכברים עם איסכמיה של שריר הלב המושרה בניסוי. ניתן ליישם את הטכניקה להדמיה אורכית לא הרסנית בתפוקה גבוהה in vivo של מודלים שונים של בעלי חיים של מחלות לב אנושיות.

In vivo כמותי הערכת מבנה שריר הלב, תפקוד, זלוף ואת הכדאיות שימוש טומוגרפיה לב מיקרו שחושב

הערכת תוצאה אמינה ומדויקת היא המפתח לתרגום של טיפולים פרה-קליניים לתוך טיפול מרפאתי. המאמר הנוכחי מתאר כיצד להעריך שלושה פרמטרים התוצאה העיקרית רלוונטיות קלינית של ביצועי הלב ונזק במודל אוטם לבבי חריף חזיר.

הערכת התוצאה העיקרית במודל חזיר של באוטם שריר הלב

כאן אנחנו מדגימים פרוטוקול לתקנן את תהליכי דגימה מודל חזירי הוקמה של אוטם שריר הלב חריפה על מנת להגדיל את ערכו translational בהבנת הפתופיזיולוגיה של שריר הלב איסכמיה/פגיעה reperfusion פציעה כדי לבחון מועמדים סמים הרומן.

שיפור של מודל חזירי אוטם שריר החזה סגור על ידי סטנדרטיזציה של רקמות ופרוצדורות דגימה דם

כאן אנו מתארים הליך כירורגי המראה כיצד להשיג הארכה קבועה של עורק שמאלי הקדמי כלילית בעכברים. מודל זה הוא בעל רלוונטיות גבוהה לחקור את הפתופסולוגיה של אוטם שריר הלב ואת התהליכים הביולוגיים המקביל.

מודל אוטם שריר הלב באמצעות הארכה קבועה של עורק שמאלי קדמי כלילי יורד

תחת הרדמה מספקת, לב העכבר הוחצן דרך החלל הבין-קוסטלי, ואוטם שריר הלב נגרם בהצלחה על ידי קשירת העורק היורד הקדמי השמאלי (LAD) באמצעות חומרים הזמינים ברוב המעבדות.

שיטה פשוטה שונה להשראת אוטם שריר הלב בעכברים

הבדיקה הנוכחית של 2,3,5-טריפנילטראזוליום כלוריד (TTC) מציגה פרוטוקול צביעה משופר של TTC המאפשר ניתוח פגיעות שריר הלב ברזולוציה מיקרוסקופית, ומפיקה תמונות איכותיות המאפשרות הערכה מדויקת ואמינה של גודל האוטם וחיוניות הקרדיומיוציטים ברמת התא.

בדיקת מיקרוסקופית 2,3,5-טריפנילטרזוליום כלוריד לניתוח מדויק ואמין של פגיעות שריר הלב

המודל של עכברוש אקוטי אוטם שריר הלב (AMI) כדאי ללמוד תוצאה של MI על תפקוד pathophysiological ופיזיולוגיות לב.

באוטם שריר הלב אצל חולדות

למדו שיטה היסטולוגית לכימות אוטם שריר לב כרוני בחולדות באמצעות דגימה שיטתית וניתוח תמונות של חתכי לב צבועים בטריכרום. טכניקה זו מאפשרת הערכה מדויקת של גודל האוטם ושל שינויים בחדר השמאלי במהלך תהליכי שיקום הלב.

כימות היסטולוגית של אוטם שריר לב כרוני אצל חולדות

גלה סרטונים נוספים