Name: זיהוי של חומצות שומן ב Cereus בצילוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: חקור זיהוי חומצות שומן בחיידקים ללא טיהור מוקדם באמצעות כרומטוגרפיית גז וספקטרומטריית מסה. שיטה זו מסייעת לחוקרים להבין מנגנוני הסתגלות חיידקיים וטקסונומיה מיקרוביאלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים תומאס מיסון לתמיכה הטכנית שלו, וכדי רחל קופק עבור תיקון כתב היד.

1. תרבויות חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן דשא של החיידקים (ATCC Bacillus cereus זן 14,579) על ידי הפצת 100 μl של תרבות לילה של המתח וטופח על 30 מעלות צלזיוס LB (בינוני לוריא- Bertani), על פני השטח של צלחת של מדיום אגר LB. דגירה את צלחת הלילה ב C 30 °. </li></ol> 2. ECL: אורך שרשרת Equivalent <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ECL כדלקמן: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/54960/54960eq1.jpg" /> עם: אני, מומס עניין; n, מספר הפחמן של מתיל אסטר חומצת שומן רוויות ישר שרשרת משחררים לפני מומס לי; n + 1, מספר הפחמן של מתיל אסטר חומצות שומן רווי שרשרת ישר משחררים לאחר המומס לי; RTI, RTN, RT (n + 1) פעמים השמירה של פסגות FAME שתוארו לעיל. הערה: קבל את זמני השמירה של אסטרים מתיל חומצות שומן רווי ישר שרשרת בזריקה מתערובת של סטנדרטים (BAME). </li></ol> הכנת FAME 3. וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לקבל חומצות שומן שומנים, תאים חיידקיים הקציר על ידי גירוד מושבות מהצלחת אגר ולהעביר 40 מ&quot;ג (משקל טרי, שווה ערך ל -10 9 תאים קיימא) של חיידקים לתוך צינור זכוכית 10 מ&quot;ל עם פקקי הברגה וחותמות PTFE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע transesterification הניתן בשיטת קישור אסתר 14,15 כמפורט להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של 0.2 M KOH מתנול אל תאים חיידקיים טרי לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. תגובה זו מורכבת methanolysis אלקליין, לשבור את הקישור אסתר ב השומנים והפקת אסטרים מתיל חומצות שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 1 חומצה אצטית M כדי להוריד את ה- pH ל -7.0. בדוק את ה- pH עם רצועות מבחן ה- pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של הקסאן לחלץ fames. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant (שלב אורגני) לתוך צינורות נקיים להתרכז על ידי אידוי בטמפרטורת חדר תחת זרימה רציפה של חנקן לקבל כ 200 μlשל תמצית. מעבירים את המדגם לתוך בקבוקון GC עם הכנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק תמציות לתוך ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסת גז מערכת (GC-MS). </li></ol></li></ol> 4. GC / MS תנאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק דגימות FAME לתוך מכשיר GC-MS מצויד נימי טור ZB-WAX (אורך, 30 מ &#39;; קוטר, 0.25 מ&quot;מ, עובי הסרט, 0.25 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פיית ההזרקה (במצב splitless) הטמפרטורה ל 250 מעלות צלזיוס. השתמש הליום כגז מוביל, עם מהירות הקווית של 37 סנטימטר / sec. החזק את טמפרטורת התנור ב -50 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, להגביר עד 190 ° C בשיעור של 20 ° C / min, ולהגדיל עוד יותר לטמפרטורה סופית של 230 מעלות צלזיוס בשיעור של 2 ° C / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור MS, להקליט את ספקטרה ההמונית על ידי יינון אלקטרון (EI) בשעת 70 eV, ולהגדיר את הרכישה הנוכחית היון הכולל בין 50 ל 400 יחידות מסה אטומיות (האמו) (2 סריקות / sec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר נדרש, להזריק נגזרים DMOX ו picolinyl באותם excep מצבt בתנור בטמפרטורה תוכנית כדלקמן: DMOX: 50 ° C (1 דקות), 20 ° C / min עד 210 ° C ו -2 ° C / min עד 240 ° C (5 דק &#39;); Picolinyl: 6 ° C (1 דקות), 20 ° C / min עד 220 ° C ו -2 ° C / min עד 250 ° C (20 דק &#39;). </li></ol> 5. Picolinyl אסתר הכינה מ FAME 16 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאדות את תמצית FAME מסעיף 3 עם זרימת חנקן (לפחות חומר יבש 10 מ&quot;ג) ו להתמוסס 1 מ&quot;ל של dichloromethane יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון 1.0 M של אשלגן ter T-butoxide ב tetrahydrofuran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תמצית תהילה 0.2 מ&quot;ל 3-pyridinemethanol 0.1 מ&quot;ל של תמיסת עשה צעד 5.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את הפתרון ב 40 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בתוך בקבוקון סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קירור לטמפרטורת החדר, להוסיף מים ללא יונים מטוהרים (2 מ&quot;ל, ראה לוח חומרים) ו הקסאן (4 מ&quot;ל). מערבבים עם מערבולת, לאפשר בשלב להיפרד, לאסוף את השלב האורגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ד&quot;רy אותו על ידי הוספת נתרן גופרתי נטול מים עד השלב האורגני ברור לחלוטין. העבר אותו לתוך צינור נקי. ונמוג 200 μl. מעבירים את המדגם לתוך בקבוקון GC עם הכנס. </li></ol> 6. הכנת DMOX מ FAME 17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאדות את תמצית FAME מסעיף 3 עם זרימת חנקן (לפחות חומר יבש 10 מ&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחלץ FAME יבש, להוסיף 250 מ&quot;ג של 2-אמינו-2-מתיל-1-פרופנול. שטוף את הכלי עם חנקן, להוסיף פקק, ולמקם אותו בתוך גוש חימום לילה ב 190 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קירור לטמפרטורת החדר, להוסיף 3 מ&quot;ל dichloromethane אל הצינור, ו -5 מ&quot;ל מטוהרים מים ללא יונים (ראה לוח חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake עבור הפרדת פאזות ולאחר מכן להסיר את השלב מהימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השלב האורגני במים מ&quot;ל 5. Shake עבור הפרדת פאזות ולאחר מכן להסיר את השלב מהימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי על ידי הוספת נתרן גופרתי נטול מים עד השלב האורגני הוא צלול לגמרילהעביר אותו לתוך צינור נקי. להתאדות תחת זרם של חנקן עד שמגיעים בהיקף של 200 μl. מעבירים את המדגם לתוך בקבוקון GC עם הכנס. </li></ol>

<ol><li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristie%2C+WW+%22Lipid+Analysis+4th+Edition%22">Lipid Analysis 4th Edition</a>. , Oily press. (2010).</li>
<li>HÜbschmann, H. -J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%9Cbschmann%2C+H-J+%22Handbook+of+GC-MS%3A+fundamental+and+application.+Third+edition%22">Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition</a>. , Wiley-vch. (2015).</li>
<li>Sasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Bacteria+by+Gas+Chromatography+of+Cellular+Fatty+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22MIDI+Technical+note%22%5BJournal%5D)">Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids.</a> MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).</li>
<li>Spitzer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+analysis+of+fatty+acids+by+gas+chromatography+-+Low+resolution+electron+impact+mass+spectrometry+of+their+4%2C4-dimethyloxazoline+derivatives+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review.</a> Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarvey%2C+DJ+%22Advances+in+lipid+methodology.+Volume+1%22">Advances in lipid methodology. Volume 1</a>. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).</li>
<li>Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+fatty+acids+in+Bacillus+environmental+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation.</a> Front Microbiol. 6, (2015).</li>
<li>Brillard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Bacillus+cereus+Genes+Specifically+Expressed+during+Growth+at+Low+Temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).</li>
<li>de Sarrau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Anaerobiosis+and+Low+Temperature+on+Bacillus+cereus+Growth%2C+Metabolism%2C+and+Membrane+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).</li>
<li>Diomandé, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+CasK%2FR+two-component+system+in+optimal+unsaturation+of+the+Bacillus+cereus+fatty+acids+during+low-temperature+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth.</a> Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).</li>
<li>Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerkeley%2C+RCW+%22Applications+and+Systematics+of+Bacillus+and+Relatives%22">Applications and Systematics of Bacillus and Relatives</a>. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).</li>
<li>Kämpfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+and+Possibilities+of+Total+Fatty+Acid+Analysis+for+Classification+and+Identification+of+Bacillus+Species%5BTitle%5D)+AND+%22System.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species.</a> System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).</li>
<li>Kaneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty-acids+of+genus+bacillus+-+example+of+branched-chain+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference.</a> Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).</li>
<li>Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+Biosynthesis+of+Unsaturated+Fatty+Acids+in+Bacillus+cereus+ATCC+14579+and+Functional+Characterization+of+Novel+Acyl-Lipid+Desaturases%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).</li>
<li>Sasser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Bacillus+anthracis+from+culture+using+gas+chromatographic+analysis+of+fatty+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22J+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters.</a> J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).</li>
<li>Schutter, M. E., Dick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fatty+acid+methyl+ester+%28FAME%29+methods+for+characterizing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Sci+Soc+Am+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities.</a> Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).</li>
<li>Destaillats, F., Angers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+methodology+for+the+synthesis+of+FA+picolinyl+esters+from+intact+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Oil+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids.</a> J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).</li>
<li>Fay, L., Richli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+double-bonds+in+polyunsaturated+fatty-acids+by+gas-chromatography+mass-spectrometry+after+4%2C4-dimethyloxazoline+derivatization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization.</a> J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).</li>
<li>Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+in+mass+spectrometry+IV-2-alkenyl-4%2C4-dimethyloxazolines+as+derivatives+for+the+double+bond+location+of+long-chain+olefinic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Mass+Spect%22%5BJournal%5D)">Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids.</a> Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).</li>
<li>de Sarrau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsaturated+fatty+acids+from+food+and+in+the+growth+medium+improve+growth+of+Bacillus+cereus+under+cold+and+anaerobic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions.</a> Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).</li>
<li>Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic+characterization+of+fatty+acids.Identification+constants+for+mono-+and+dicarboxylic+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters.</a> Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).</li>
<li>van Den Dool, H., Kratz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalization+of+the+retention+index+system+including+linear+temperature+programmed+gas-liquid+partition+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography.</a> J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).</li>
<li>Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+equivalent+chain+length+values+of+monoenic+and+polyenic+%28methylene+interrupted%29+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+High+Res+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids.</a> J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרופילי הכרומתוגרמה FAS שניתן לראות בטבלת 1 מתאים B. cereus ATCC 14,579 גדל על פני צלחת אגרה. פרופילים דומים התקבלו כאשר החיידק היה גדל בתקשורת נוזלת סודה באותה הטמפרטורה 8. במקרה של חיידקים גדלו בתקשורת נוזלית, ביומסה החיידקים נאספה על ידי צנטריפוגה של מדיום הצמיחה ניתן לכבס על פי פרוטוקולים שתוארו קודם לכן תלויים 8,19 תנאי גידול. זיהוי של FAS השונה המיוצר על ידי B. cereus מותר שינויים בסדר בשיעור של FAS להתגלות זני מוטציה ...

שומן מתיל אסטר חומצה (FAME) גז כרומטוגרפיה (GC) היא שיטה חיונית לאפיון שומנים. הוא מפריד במהירות מכמת את חומצות שומן שונות (FAS) של מדגם אחרי צעד מיצוי קצר. נגזרים של אסטרים מתיל תנודתיות מאוד, יציבה אינרטי לעבר מוט chromatographic, ובכך למנוע פסגות עוקב. סולם ההזדהות שלהם היא די פשוט כאשר המדגם מורכב FAS הידוע משום פרופילי chromatographic או מתפרסמים או בהשוואה לסטנדרטים. בנוסף, ההזרקה החוזרת של סטנדרטי כיול כימות של שונות FAS אינה נדרשת, בהתחשב בתגובה המתמדת שלהם כמעט לגילוי יינון להבה (FID) 1. בנוסף FID, ספקטרומטריית מסה (MS) זיהוי מספק ערכה משלימה של מידע כדי לאשר fames. עם זאת, כאשר fames נזקפת באמצעות יינון אלקטרון (EI), ספקטרה וכתוצאה מכך לא תמיד מאפשרת הזיהוי דואר של המבנה העדין האנגלי. למשל, הסתעפות עמדה (כלומר, קבוצה מהתיל מסועפת) קשה לנבא כי יוני האבחון קשים לזהות 1 ושינוי המאפיין בשפע יון היעד הוא מכונה תלוי, מניעת השימוש בספריות ספקטרה מונית 2. אתגר נוסף טמון בזיהוי מיקום הקשר הכפול בגלל EI גורם גירת קשר כפולה. לפיכך, איזומרים FA עם משתנה עמדות קשר כפולות לא יכולים להיות מובחנים על ידי ספקטרום המסה שלהם. למרבה המזל, בכלים אחרים פותחו לזיהוי FA. לדוגמה, הנוכחות ואת המיקום של הסתעפות או של קשרים כפולים FAS ניתן השערה על ידי חישוב אורך השרשרת שווה ערך (ECL) 3. שיטות derivatization אחרות לגרום ספקטרה מסה שונה, תלוי במיקום של קשר כפול או קבוצה מתיל מסועפת. 4,4-דימתיל נגזר oxazoline (DMOX) 4 לאפשר EASזיהוי y של המיקום של קשרים כפולים חומצת שומן חד בלתי רוויה. 3-pyridylcarbinyl אסתר (אסתר picolinyl) נגזרים לאפשר זיהוי חד משמעי על המיקום של מתיל מסועף 5 FAS. שילוב שמירת chromatographic (ECL) ו ספקטרה ההמונית (DMOX ו picolinyl) מידע מאפשר זיהוי של רוב FAS ללא הצורך להשתמש בשיטות מורכבות של טיהור, כנדרש עבור ספקטרום תהודה מגנטית גרעינית (NMR), שיטת העוררין לאפיון מבני 1 . חיידקים של Bacillus הסוג, הכוללים כמה פתוגנים בני אדם ובעלי חיים, מסוגלים ליישב נישות מגוונות מאוד ולכן מופצים באופן נרחב בסביבה 6. בין הסוג בצילוס, רכב FA מושפע הנישה האקולוגית של המין עם מודולציות בדפוסי FA להתאים למגוון רחב של שינויים סביבתיים (למשל, מדיום גידול, טמפרטורה,pH, וכו &#39;) 7-9. בגלל ההומוגניות היחסית של דפוס FA בין זנים של Bacillus הסוג במהלך צמיחה בתנאים סטנדרטיים, קביעת רכב FA היא אחד הקריטריונים החיוניים המשמשים להגדרת מין Bacillus. מאפיין ייחודי של הסוג בצילוס הוא השפע של FAS מסועפת שרשרת המכילה 12-17 פחמנים 10-12 עם היחס בין ISO ו anteiso איזומרים להיות קובע מפתח של הסתגלות לתנאי סביבה. מיני Bacillus גם להסתגל לתנודות סביבה על ידי שינוי היחס של חומצות שומן בלתי רוויות. במינים מסוימים, כגון cereus Bacillus, שני desaturases חומצת שומן ליצור קשרים כפולים במיקומים שונים של שרשרת אלקיל 13 עם תפקידים שונים בעיבוד 9. הדוגמא של הסוג בצילוס ממחישה את החשיבות של זיהוי בדיוק עמדת הקשר הכפולה ו FA הסתעפות. לאסוףively, זיהוי דפוסי Bacillus FA יש כמה יישומים שימושיים. בזאת, אנו מציעים גישת GC-MS רומן לזיהוי דפוס Bacillus FA אשר מתגבר על המגבלות המובנות של ניתוח קלסי GC-MS. גישה חדשנית זו יכולה לשמש באופן ישיר על חומר ביולוגי גלם, מורכבת משילוב של טכניקות קיימות: מידע על זמני שמירה (ECL) ו ספקטרה ההמונית של נגזרי FAS שונים (FAME, DMOX ו-אסתר picolinyl). אנו משתמשים במינוח האנגלי הבא. אני, א, ו n מצביע iso, anteiso מתיל מסועף, וישר-שרשרת חומצת שומן, בהתאמה. FAS הרווי קבל את שמן C: ד כאשר C הוא מספר אטומי הפחמן חומצת השומן ו- D הוא מספר קשרים כפולים. Δ x מציין את המיקום של הקשר הכפול, שבו הקשר הכפול ממוקם על קשר פחמן-פחמן העשירי, לספור מסוף חומצה קרבוקסילית.

<table><tbody><tr><td>GC/MS</td><td>Shimadzu</td><td>QP2010</td><td></td></tr><tr><td>עמוד נימי ZB WAX</td><td>Phenomenex</td><td>7HG-G007-11</td><td>30 מ' x 0.25 מ"מ x 0.25&nbsp; ומיקרו; m</td></tr><tr><td>מתנול Lichrosolv</td><td>VWR</td><td>1.06018.2500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>THF</td><td>Hipersolv Chromanorm</td><td>28559.320</td><td></td></tr><tr><td>דיכלורומתאן</td><td>Hipersolv Chromanorm</td><td>23373.320</td><td></td></tr><tr><td>הקסאן</td><td>Hipersolv Chromanorm</td><td>24575.320</td><td></td></tr><tr><td>3-פירידין-מתנול</td><td>אולדריץ'</td><td>P6-680-7</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן טרטיובוטוקסיד</td><td>Aldrich</td><td>156671</td><td></td></tr><tr><td>2-אמינו-2-מתיל-1-פרופנול</td><td></td><td>A-9879</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Academic</td><td>Millipore</td><td>ZMQS50001</td><td></td></tr><tr><td>תערובת חומצה חיידקית מתיל אסטר (BAME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47080-U Supelco</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של חומצות שומן ב<em&gt; cereus בצילוס</em

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

מין Bacillus מכיל מסועף שרשרת חומצות שומן בלתי רוויות (FAS) עם עמדות מגוונות של הסניף מהתיל (iso או anteiso) ושל הקשר הכפול. שינויים בהרכב FA לשחק תפקיד מכריע ההסתגלות של חיידקים לסביבתם. שינויים אלה כרוכים בשינוי היחס של iso לעומת anteiso המסועף FAS, וב השיעור ביחס FAS בלתי רווי ל- FAS הרווי, עם קשרים כפולים נוצרו ב בתפקידים שונים. זיהוי מדויק של פרופיל FA יש צורך להבין את מנגנוני ההסתגלות של מיני Bacillus. רבים מן FAS מ Bacillus אינם זמינים מסחרית. האסטרטגיה המוצעת במסמך מזהה FAS באמצעות שילוב אינפורמציה על זמן השמירה (לפי חישוב של אורך השרשרת שווה ערך (ECL)) עם ספקטרה המונית של שלושה סוגים של נגזרים FA: אסטרים מתיל חומצת שומן (fames), 4,4-דימתיל oxazoline נגזרים (DMOX), ו3-pyridylcarbinyl אסתר (picolinyl). שיטה זו יכולה לזהות את FAS ללא הצורך לטהר את FAS הידוע. השוואת פרופילי chromatographic תהילה שהוכנה cereus Bacillus בתערובת מסחרית של תקנים מאפשרת זיהוי של ישר-שרשרת רווי FAS, החישוב של ECL, והשערות על זהותו של FAS האחר. Fames של הקנים רווי FAS, iso או anteiso, להציג תזוזה שלילית קבועה של ECL, לעומת FAS רווי ליניארי עם אותו מספר פחמנים. Fames של FAS בלתי רווי יכול להיות מזוהה על ידי המסה של היונים המולקולריים שלהם, ולגרום לשינוי חיובי ECL לעומת FAS הרווי המתאים. עמדת ההסתעפות של FAS ועמדת הקשר הכפולה של FAS בלתי רווי ניתן לזהות על ידי ספקטרה המונית יינון אלקטרונים נגזרים picolinyl ו DMOX, בהתאמה. גישה זו מזהה את כל הענף הרווי הידועFAS ed, FAS ישר שרשרת בלתי רוויה ו- FAS המסועף בלתי רווי מתמצית cereus ב.

האסטרטגיה של זיהוי FA מתאי חיידקים מוצג באיור 1. כל צעד מספק מידע ספקטרלי משלים או מידע אודות שימור chromatographic. שלב 1 מורכב של זיהוי ראשוני FA באמצעות פתרון סטנדרטי. שלב 2 מאפשר פרשנות FAME EI ספקטרה ECL שלהם, על מנת לזהות את המוצרים בהיסוס. שלב 3 מזהה את המיקום המדויק הסתעפות בשרשרת-FAS מסועף. לבסוף, בשלב 4 מזהה את המיקום המדויק של קשרים כפולים FAS בלתי רווי. <p class="jove_step" fo:keep-together.within-page="1" style=";t...

אנו מציעים פרוטוקול לזיהוי חומצות שומן ללא צורך בטיהורן. הוא משלב מידע על זמני השמירה עם ספקטרום המסה של שלושה סוגים של נגזרות חומצות שומן: אסטרי מתיל של חומצות שומן (FAMEs), נגזרות 4,4-דימתיל אוקסזולין (DMOX) ואסטרי 3-פירידילקרביניל (פיקוליניל).

זיהוי של חומצות שומן ב<em&gt; Cereus בצילוס</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לזהות חומצות שומן מחיידקים ולזהות את מיקומם של פיצולי מתיל וקשרי פחמן כפולים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הבקטריולוגיה, כגון תפקידן של חומצות השומן באופן שבו חיידקים מסתגלים לסביבתם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאין צורך בהרביית חומצות השומן.השלכותיה של טכניקה זו משתרעות על זיהוי חיידקים, בשל חשיבותה של הרכבת החומצות השומניות בטקסונומיה של חיידקים. למרות ששיטה זו פותחה עבור החיידק Bacillus cereus, היא רלוונטית מאוד גם לחקר מינים אחרים המכילים חומצות שומניות בעלות שרשרת מסועפת. באופן כללי, נתקלנו בקשיים במהלך הפיתוח של שיטה זו.מאחר ששיטות הזיהוי הנוכחיות לחומצות שומן אינן מזהות הסתעפות מתיל במיקום הקשר הכפול. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו מדשאת חיידקים על ידי פריסה של 100 µL של תרבית לילה של הזן, שהודגרה ב-30 °C ב-LB, על פני פלטת מצע LB agar. הדגירו את הפלטה למשך לילה ב-30 °C.כדי להשיג חומצות שומן ליפידיות, קצרו את התאים הבקטריאליים על ידי גירוד מושבות מלוחית האגר. העבירו כ-40 milligrams לתוך מבחנה מזכוכית בנפח עשרה מיליליטר עם מכסה הברגה ואטם PTFE. לביצוע טרנס-אסטריפיקציה, הוסיפו חמישה מיליליטר של 0.2 molar potassium hydroxide במתנול לתאים הבקטריאליים הטריים.ערבב במערבל Vortex, והדגר בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסף 1 mL של acetic acid בריכוז 1 M כדי להוריד את ה-pH ל-7. כעת, הוסף 3 mL של hexane וערבב במערבל Vortex למשך דקה אחת כדי למצות את ה-fatty acid methyl esters או ה-FAMEs.העבירו את השכבה העליונה למבחנות נקיות ורכזו על ידי אידוי בטמפרטורת החדר תחת זרימה רציפה של חנקן עד לקבלת כ-200 microliters של תמצית FAME. לאחר מכן, העבירו את התמציות לבקבוקוני GC עם inserts. הזריקו את התמציות למערכת כרומטוגרפיה גזית-ספקטרומטריית מסות (GC-MS) המצוידת בעמודה קפילרית.הגדירו את טמפרטורת יציאת ההזרקה ל-250 °C. השאירו את טמפרטורת התנור ב-50 °C למשך דקה אחת. העלו את הטמפרטורה ל-190 °C בקצב של 20 °C לדקה, והעלו לטמפרטורה סופית של 230 °C בקצב של שתי מעלות צלזיוס לדקה.עבור ה-MS, רשום את ספקטרומי המסות באמצעות יינון אלקטרוני, או EI, ב-70 electron volts, והגדר את רכישת זרם היונים הכולל בין 50 ל-400 atomic mass units, או AMU. המס דגימה של תמצית FAME מיובשת ב-1 milliliter של dichloromethane יבש. לאחר מכן, הוסף את תמיסת התמצית ו-0.2 milliliters של 3-pyridinemethanol ל-0.1 milliliters של potassium tert-butoxide בריכוז one molar בתוך tetrahydrofuran.חממו את התמיסה בטמפרטורה של 40 °C למשך 30 דקות במבחנה סגורה. לאחר קירור התמיסה לטמפרטורת החדר, הוסיפו 2 mL של מים מזוקקים דה-יוניים ו-4 mL של hexane. ערבבו את התמיסה למשך דקה אחת באמצעות וורטקס.לאחר מתן זמן להפרדת הפאזות, אספו את הפאזה האורגנית העליונה. לאחר מכן, הוסיפו נתרן סולפט אנידרי עד שהפאזה האורגנית תהיה צלולה. העבירו את הפאזה האורגנית למבחנה נקייה, ולאחר מכן אידו את הפאזה האורגנית תחת זרם חנקן עד להגעה לנפח של כ-200 µL.הוסף 250 milligrams של 2-amino-2-methyl-1-propanol לדגימה של תמצית FAME מיובשת. שטוף את המבחנה בחנקן וסגור אותה באמצעות פקק. לאחר מכן, חמם את התמיסה בטמפרטורה של 190 degrees Celsius למשך הלילה.לאחר קירור התמיסה לטמפרטורת החדר, הוסף 3 mL של dichloromethane ו-5 mL של מים מזוקקים ומטוהרים. ערבב את התערובת באמצעות Vortex והמתן להפרדת הפאזות. לאחר מכן, הסר את הפאזה המימית.לאחר מכן, שטפו את הפאזה האורגנית עם חמישה מיליליטרים של מים. הוסיפו נתרת סולפט אנידרי עד שהפאזה האורגנית תהיה צלולה. לאחר העברת הפאזה האורגנית למבחנה חדשה, אידו אותה תחת זרם חנקן עד להגעה לנפח של כ-200 µL.ספקטרום המסות של נגזרת ה-picolinal I16 מאשר הסתעפות מתילית. הפער של 28 AMU בין יונים ב-304 ל-332 תואם למקטעים שנוצרו לפני ואחרי הפחמן המסועף. היונים האבחנתיים, 113 ו-126, המאפיינים נגזרות DMOX, מוצגים כאן.היון המולקולרי 307 מאפיין את האיזומר 16:1, ופער של 12 AMU בין 196 ל-208 מעיד על קשר כפול בפחמן. הפער של 12 AMU אינו נצפה יותר כאשר הקשר הכפול נמצא לפני פחמן 7. היון 153 העז, המאפיין קשר כפול בפחמן 5, והיון המולקולרי 307 בספקטרום המסה של נגזרת ה-DMOX זיהו תרכובת זו כ-n16 one delta five.היוני 307 של נגזרת ה-DMOX והיוני 345 של נגזרת ה-picolinal מעידים על איזומר של חומצת שומן 16:1. פער של 28 AMU מצביע על מיקום הפיצול, ופער של 12 AMU עבור DMOX ו-26 AMU עבור picolinal ester מזהים את הקשר הכפול. חומצות שומן והיונים האבחנתיים המתאימים שזוהו ב-Bacillus cereus מפורטים כאן.היונים האבחנתיים מזהים את הסתעפויות המתיל ואת מיקומי הקשרים הכפולים בשרשרת הפחמנית עבור נגזרות ה-DMOX והפיתקולינאל אסתר (picolinal ester). לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה בתוך יומיים, אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לכמת חומצות שומן באמצעות GC-MS ושחרור של נגזרות FAME.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הבקטריולוגיה לחקור את הגיוון הבקטריאלי ומנגנונים של הסתגלות בקטריאלית. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכיבו הבנה טובה על אופן חקר חומצות שומן בחיידקים, כולל חומצות שומן עם הסתעפות מתיל וחומצות שומן לא רוויות. זכרו כי עבודה עם ריאגנטים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במכסה מסיס (fume hood) של המעבדה והרכבת כפפות, בעת ביצוע הליך זה.

identification-of-fatty-acids-in-bacillus-cereus

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

מקור: Ginies, C., et al. זיהוי חומצות שומן ב-Bacillus cereus. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את תהליך הכנת אסטרי מתיל חומצות שומן (FAMEs) מדגימות חיידקים על ידי טיפול בביומסה בתמיסה אלקליין, ולאחר מכן הפרדת פאזה ואידוי ממס לניתוח במורד הזרם.

הכנת חומצות שומן מתיל אסטרים (FAMEs) מביומסה חיידקית

בידוד ואפיון של תחום שומנים בדם של lipopolysaccharide (LPS) מחיידקי גרם שלילי מספק תובנה מנגנוני תא שטח על בסיס של עמידות לאנטיביוטיקה, הישרדות והכושר בקטריאלי, ואיך כימי שומנים מגוונים מינים מולקולריים דיפרנציאלי לווסת תגובות חיסוניים מולדים מארחות.

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

שיטה לקביעת תכולת חומצות שומן והרכב באצות המבוססות על הפרעה מכאנית של תאים, מיצוי שומנים מבוסס ממס, transesterification, וכימות וזיהוי של חומצות שומן באמצעות גז כרומטוגרפיה מתוארת. תקן פנימי tripentadecanoin משמש כדי לפצות על ההפסדים האפשריים בחילוץ וtransesterification שלם.

ניתוח התוכן של חומצות שומן והרכב בMicroalgae

Elegan &lt;em&gt; Caenorhabditis &lt;/ em&gt; הוא מודל שימושי כדי לחקור את הפונקציות של חומצות שומן רב בלתי רוויות בפיתוח ופיזיולוגיה. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להשלמת ג &lt;em&gt; elegans &lt;/ em&gt; דיאטה עם חומצות שומן רב בלתי רוויות.

תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

חומצת שומן מרקר עם מחלות הגישה, קרי, ההטמעה של חומצות שומן כמו כל מולקולה והעברת לתוך רקמות לצרכן ללא או משנית השינוי, היא הקשו על ידי פערי ידע חומצת שומן חילוף החומרים של אדמה קטנים חסרי חוליות. איזוטופולוג פרופיל מסופק כלי חשוב כדי disentangle אינטראקציות עם מחלות.

חומצת שומן 13C איזוטופולוג פרופיל מספק תובנה מטבולי של הגעה צרכנים והעברת פחמן עם מחלות

שיטה זו מספקת מסגרת ללימוד שילוב של חומצות שומן אקסוגני ממקורות מארחים מורכבים לקרומים חיידקיים, בעיקר סטייהילוקוקוס. כדי להשיג זאת, פרוטוקולים עבור העשרת ליפופרוטאין חלקיקים מחלמון ביצת עוף ובעקבות הפרופיל חומצות שומן לאחר מכן של פוספוליפידים חיידקיים ניצול ספקטרומטר מסה מתוארים.

בידוד של חלקיקי ליפופרוטאין מעוף חלמון ביצה לחקר הפתוגן חומצות שומן בקטריאלי התאגדות לתוך ממברנה פוספוליפידים

פרוטוקול מוצג כדי לחלץ את התוכן השומנים הכולל של דופן התא של מגוון רחב של mycobacteria. יתר על כן, מיצוי ופרוטוקולים אנליטיים של סוגים שונים של חומצות מיקוליות מוצגים. פרוטוקול כרומטוגרפי בשכבה דקה לניטור תרכובות מיקובקטיות אלה מסופק גם כן.

ניתוח הרכב השומנים של מיקובקטריה על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מהיר של חלבונים המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים ברצף גנומי באמצעות ספקטרומטריית מסה יחד MALDI-TOF-TOF וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה עם תוכנה שפותחה בתוך הבית. שבר יונים חלבון Metastable בגלל אפקט חומצה אספרטית וספציפיות זו מנוצל לזיהוי חלבון.

זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה

כאן, אנו מציגים שיטה כמותית זולה המשתמשת תחמוצת דאוטריום וספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית גז (GCMS) לניתוח של חומצת שומן כוללת דה נובו ליפוגנזה ברקמת שומן חום in vivo.

קביעה כמותית של סינתזת חומצות שומן דה נובו ברקמת שומן חומה באמצעות תחמוצת דאוטריום

חקור זיהוי חומצות שומן בחיידקים ללא טיהור מוקדם באמצעות כרומטוגרפיית גז וספקטרומטריית מסה. שיטה זו מסייעת לחוקרים להבין מנגנוני הסתגלות חיידקיים וטקסונומיה מיקרוביאלית.

זיהוי של חומצות שומן ב

גלה סרטונים נוספים