Name: ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש במבחנה מערכת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: חקור ניתוח סטיות כרומוזומליות בתאי RAW264.7 לאחר חשיפה לחלקיקי אוויר סביבתיים. שיטה זו מאפשרת הדמיה ישירה של נזק גנטי בתרבית ומסייעת בהערכת השפעת מזהמים סביבתיים על שלמות הגנום בביולוגיה של תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה, בין השאר, על ידי המכון הלאומי של המרכז לבריאות של אקסלנס למחקר ביולוגי [מספר מענק 1P20GM109005], הקונסורציום ארקנסו שטח גרנט דרך התעופה הלאומית שטח המינהל [NNX15AK32A מספר מענק], לבין המכון הלאומי לבטיחות תעסוקתית בריאות (NIOSH) [מספר מענק 2T420H008436]. המחברים מבקשים להודות כריסטופר Fettes עבור הגהה ועריכה כתב היד הזה.

<ol><li>Lim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+risk+assessment+of+burden+of+disease+and+injury+attributable+to+67+risk+factors+and+risk+factor+clusters+in+21+regions%2C+1990-2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380, 2224-2260 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22IARC%3A+Outdoor+air+pollution+a+leading+environmental+cause+of+cancer+deaths%22">IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths</a>. , IARC. Press Release 10-17-2013 (2013).</li>
<li>Putaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+European+aerosol+phenomenology-2%3A+chemical+characteristics+of+particulate+matter+at+kerbside%2C+urban%2C+rural+and+background+sites+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe.</a> Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).</li>
<li>Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+composition+of+remote+and+urban+fine+particulate+matter+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J+Geophys+Res-Atmos%22%5BJournal%5D)">Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States.</a> J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).</li>
<li>Schauer, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+airborne+particulate+matter+using+organic+compounds+as+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers.</a> Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).</li>
<li>Simoneit, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+biomarker+compounds+as+source+indicators+and+tracers+for+air+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).</li>
<li>Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+distribution+of+organic+primary+and+secondary+aerosol+constituents+in+urban%2C+background+marine%2C+and+forest+atmosphere%5BTitle%5D)+AND+%22J+Geophys+Res-Atmos%22%5BJournal%5D)">Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere.</a> J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).</li>
<li>Graber, E., Rudich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+HULIS%3A+How+humic-like+are+they%3F+A+comprehensive+and+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review.</a> Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).</li>
<li>Pöschl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+aerosols%3A+composition%2C+transformation%2C+climate+and+health+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int%22%5BJournal%5D)">Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects.</a> Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).</li>
<li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+methylation+in+tandem+repeat+element+and+elemental+component+levels+in+inhalable+air+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles.</a> Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).</li>
<li>Miousse, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+induced+by+ambient+particulate+matter+in+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages.</a> Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).</li>
<li>Miousse, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Toxicity+and+Epigenotoxicity+of+Different+Types+of+Ambient+Particulate+Matter%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter.</a> Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).</li>
<li>Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEhrlich%2C+M+%22Genome+Instability+in+Cancer+Development%22">Genome Instability in Cancer Development</a>. , Springer. 363-392 (2005).</li>
<li>Michael, S., Montag, M., Dott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+effects+and+oxidative+stress+in+lung+macrophages+and+epithelial+cells+induced+by+ambient+particulate+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter.</a> Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+heme+oxygenase-1+expression+in+macrophages+by+diesel+exhaust+particle+chemicals+and+quinones+via+the+antioxidant-responsive+element%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element.</a> J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).</li>
<li>Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radio-sensitivities+of+human+chromosomes+1+and+2+in+one+donor+in+interphase-+and+metaphase-spreads+after+60Co+gamma-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation.</a> BMC Med. Phys. 9, 6649(2009).</li>
<li>Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxic+effects+in+M5+cells+and+Chinese+hamster+V79+cells+after+exposure+to+7+Li-beam+%28LET%3D+60keV%2F%C2%B5m%29+and+correlation+of+their+survival+dynamics+to+nuclear+damages+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Genet.+Toxicol.+Environ.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).</li>
<li>Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+killing%2C+nuclear+damage+and+apoptosis+in+Chinese+hamster+V79+cells+after+irradiation+with+heavy-ion+beams+of+16+O%2C+12+C+and+7+Li%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Genet.+Toxicol.+Environ.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).</li>
<li>Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+for+determining+the+functional+content+of+organic+aerosols%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Pollut%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review.</a> Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מחקר ציטוגנטית או ניתוח מיקרוסקופי של מספרים או מבנים של כרומוזומים, בעיקר מתפשט metaphase, מספק מידע חיוני עבור הפרוגנוזה, הערכת סיכונים, וטיפול במחלות שונות. עכשיו זה מבוסס היטב, כי אבנורמליות ציטוגנטית מקושרת עם ההתקדמות והתפתחות של מחלות שונות, לרבות סרטן. נכון להיום, קאש נמצא בכל סוגי הגידולים העיקריים. CAs עלול להתעורר באופן ספונטני או על ידי אחד לגירויים חיצוניים או פנימיים, כגון קרינת מייננת (IR) - אחד מגורמי הסיכון החיצוניים הגדולים שיכול לגרום סוגים שונים של שינויים ציטו...

הערכה הוא כי חשיפה לחומר חלקיקים (PM) גורמת מעל 3 מיליון מקרי מוות מדי שנה עודפת, בעיקר ממחלות לב-ריאה וסרטן ריאות סרטן 1. ואכן, אחר הצהריים הוכר מסרטנים לבני אדם על ידי הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן (קבוצה 1), כמו סיכון מוגבר לסרטן ריאות עם העלייה ברמות החשיפה PM הוכח 2. מעניין לציין שכמעט כל תאי סרטן נמל ליקויים מספריים ו / או מבניים כרומוזומליות. פחמן אורגן חלקיקים הנו נגזר, מורכב, תערובת הטרוגנית, אשר תלוי הפצת רכב וגדל על פליטה גם לשינויים פיסיים וכימיים. זה החשבונות של 35-55% ממסת עירוני PM 2.5 (PM 2.5 מיקרומטר בגודל קטן יותר) ויותר מ 60% של PM רקע כפריים קונטיננטלית 2.5 המונית 3, 4. השבר המסיס במים מהווה 30-90% של תרסיס אורגני. מספר רב של תרכובות אורגניותזוהה, כולל פחמימנים אליפטיות, פחמימנים ארומטיים פוליציקליים, ונגזר מחומצן ו הניטריות שלהם, אלדהידים ו כהלי aliphatic, חומצות שומן חופשיות ומלחיהם, חומצות קרבוקסיליות-di, תרכובות רבות תכליתיות, חלבונים, מקרומולקולות דמוי גומין (HULIS) באמצעות שיטות chromatographic בשילוב עם טכניקות ספקטרומטריה 5-8. תרכובות אלה מהוות פחות מ 10-20% של פחמן אורגן חלקיקים, ובכך ביותר של פחמן אורגני היא 9 ידוע. ראיה נסיונית עולה כי cytotoxicity, סטרס חמצוני, ודלקת מעורבים בהתפתחות מצבים פתולוגיים הקשורים PM. הוכח לאחרונה, עם זאת, כי חשיפת PM גם תוצאות מספר שינויים אפיגנטיים, כוללים שינויי מתילציה DNA של אלמנטים חוזרים, בשני ניסיוני במערכות במבחנה בבני אדם 10-12. מעניין במיוחד הן ההשפעות שלPM על DNA לווין - לווינים ראשיים ומשניות - אשר נמצאים באזור הטרוכרומטין ברחבי centromere של הכרומוזומים. זה היה הראה כי תופעות אלה עשויות להיות עקביות מטבעו, כפי שהם יכולים להיות מזוהים לפחות 72 שעות לאחר חשיפת 12. שינויים מתילציה DNA, במיוחד סביב צנטרומר, עלול לגרום להצטברות של תעתיקי mRNA DNA לווין, פשרה שלמות כרומוזומליות במהלך חלוקת התא, ולאחר מכן, לגרום להתפתחות של מגוון מצבים פתולוגיים 13. התאמת הגישה ציטוגנטית לניתוח CAs כמו שינויי נקודת סיום של אפיגנטיים הנגרמים על ידי ראש הממשלה, ובכך, היא בעלת חשיבות גבוהה. כאן אנו מדווחים הגישה לאיסוף PM הסביבה והכנת, בחשיפה במבחנה וניתוח של רשויות אישורים באמצעות מערכת מודל בעכברים מקרופאג RAW264.7. המקרופאגים מהווים את קו ההגנה הראשון נגד הגופים הזרים בשאיפה, ולכן לאקו התאו משמש הקים את המודל הנפוץ ביותר ב טוקסיקולוגיה חלקיקי 11, 12, 14, 15.

<table><tbody><tr><td>סה"כ דגימת חלקיקים מרחפים</td><td>Tisch Environmental</td><td>TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III ספקטרומטר NMR&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2 תוכנה</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR מעבד מהדורה אקדמית</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 מקרופאגים עכבריים</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז גבוה DMEM GlutaMAX מדיה</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>לחמם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)ThermoFisher</td><td></td> <td>15140163</td><td>לחמם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>לחמם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>לחמם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid Solution ב-PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>15212012</td><td>לחמם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>KaryoMAX תמיסת אשלגן כלורי</td><td>ThermoFisher</td><td>10575090</td><td>לחמם ב 37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>מתנול (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית, Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr><tr><td>Decon Contrad 70 חומר ניקוי נוזלי</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-1</td><td></td></tr><tr><td>Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-200733</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של סטיות כרומוזומליות matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

חשיפה לחומר חלקיקי (PM) הוא החשש העיקרי בעולם הבריאות, אשר עשוי לגרום נזק לרכיבים תאיים שונים, לרבות החומר הגנטי גרעיני. כדי להעריך את ההשפעה של PM על שלמות גנטית גרעינית, סטיות כרומוזומליות מבניות הבקיע מתפשט metaphase של תאי מקרופאג העכבר RAW264.7. PM נאסף מאוויר הסביבה עם סמפלר חלקיקים מרחף הכולל בנפח גבוה. החומר שנאסף solubilized ומסוננים לשמור על מסיסים במים, חלק בסדר. החלקיקים מאופיינים עבור הרכב כימי על ידי ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית גרעינית (NMR). ריכוזים שונים של השעית חלקיק מתווספים על תרבות במבחנה של מקרופאגים עכבר RAW264.7 במשך זמן חשיפה כולל של 72 שעות, יחד עם לתאי קבוצת ביקורת. בסוף החשיפה, התרבות מטופלת עם colcemid לעצור תאי metaphase. תאים אז שנקטפו, שטופלו פתרון hypotonic, קבוע acetomethanol, דropped גבי שקופיות זכוכית ולבסוף מוכתם פתרון Giemsa. שקופיות נבדקות כדי להעריך את סטיות כרומוזומליות מבניות (CA) ב metaphase פורשת בהגדלה 1,000X באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. 50 עד 100 התפשטות metaphase הם הבקיע עבור כל קבוצת הטיפול. טכניקה זו מותאמת לצורך זיהוי של סטיות כרומוזומליות מבניות (CA), כגון הפסקות כרומטידה מסוג כרומטידה מהסוג חילופי, שברי acentric, כרומוזומים dicentric וטבעת, דקות כפולות, endoreduplication, ו טרנסלוקציות Robertsonian במבחנה לאחר חשיפת PM. זוהי שיטה רבת עוצמה כדי לשייך הסיום ציטוגנטית ומבוססת לשינויים אפיגנטיים.

בזהירות רבה יש לנקוט בבחירת המיקום של סמפלר TSP, כמו גם את הזמן של השנה כאשר מתבצע איסוף. ההרכב הכימי כמו גם את הגודל של חלקיקים עשויים להשפיע על התוצאות באופן משמעותי. החומר שנאסף צריך להיות גלוי נגד המסנן הלבן. התפשט metaphase עכבר רגיל יהיו 40 כרומוזומים acentric. מטרת הטכניקה היא להפגין שינוי (או ובהעדרו) בשיעור של כרומוזומים לא נורמלים בתאים שטופלו לעומת נבדקי ביקורת. שינוי זה ניתן לכמת אז (מספר כרומוזומים נורמלי) ומוסמך (סוג של מומים). <p...

פרוטוקול זה מתאר שיטות כימות ואפיון של סטיות כרומוזומליות במבחנה מקרופאגים העכבר RAW264.7 לאחר הטיפול עם חומר חלקיקי באוויר הסביבה.

ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לזהות נזק כרומוזומלי המושרה על ידי חשיפת תאים לחלקיקים (particulate matter), שהופקו מאוויר סביבתי. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלה מרכזית בתחום החלקיקים: האם חשיפה לחלקיקים גורמת לנזק כרומוזומלי? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה ישירה של הנזק שנגרם לחומר הגנטי.לאחר איסוף וניתוח החלקיקים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בצעו חשיפה לחלקיקים על ידי חימום של מצע גידול מלא, 0.25% trypsin ו-PBS במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C, למשך 30 דקות לפחות לפני תחילת התרבית. לאחר שטיפת תאי 264.7 גולמיים, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת ה-trypsin החמה לצלוחית ושחררו את התאים מדופן כלי תרבית הרקמה באמצעות גירוד. לאחר מכן, אספו את התאים והכינו סספנסיה של תאים בודדים על ידי פיפטינג חוזר.בעזרת trypan blue, ספרו את מספר התאים, ולאחר מכן השתמשו במצע מלא שחומם מראש כדי לזרוע אותם בצפיפות של 8000 לתא סמ"ר בצלחת תרבית רקמות של 100 מילימטר. לאחר מכן, השתמשו במצע מלא כדי להתאים את הנפח ל-10 מיליליטר, כדי להגיע לריכוז סופי של 50,000 תאים למיליליטר. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees celsius ו-5%CO2 למשך 24 שעות כדי לאפשר להם להיקשר.בתוך קבוב בטיחות ביולוגית, השתמש ב-PBS סטרילי כדי לדלל חלקיקים מסוננים בריכוז של 0.5 milligrams per milliliter, עבור מינון טיפולי של 5 microgram per milliliter, ובריכוז של 5 milligrams per milliliter, עבור מינון טיפולי של 50 microgram per milliliter. כדי לטפל בתאים באמצעות חומר חלקיקי, בדוק את התאים המגודלים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של 10x כדי לוודא צמיחת תאים, מורפולוגיה של התאים, מצב התרבית וזיהומים. התאים צריכים להיות ברמת התמזגות (confluency) של לפחות 30% בשלב זה.בעזרת פפטה סטרילית, שאבו את המצע באופן אספטי והשתמשו ב-2 mL של PBS בטמפרטורה של 37 °C כדי לשטוף את כלי התרבית פעמיים. הוסיפו מנה קבועה מראש של חלקיקים עם מצע טרי, והדגירה את התרביות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 כדי להקביל את החשיפה שנעשתה בניתוח גנוטוקסי ואפיגנוטוקסי מקבילי. כדי לעצור את התאים בשלב המטאפאזה, לאחר שטיפת התאים, הוסיפו לתרבית 2 mL של מצע שחומם מראש עם 5 µL למילטר של תמיסת colcemid, והדגירה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך שעתיים.לאחר הדגירה, יש להסיר לחלוטין את המצע ולשטוף את התאים פעמיים באמצעות PBS חם. לאחר מכן, יש להוסיף תמיסת trypsin ולהדגיר את התרביות בטמפרטורה של 37 degrees celsius למשך דקה אחת. בעזרת גורד תאים (cell scraper), יש לנתק את התאים ולהוסיף 10 milliliters של PBS כדי לנטרל את ה-trypsin.לאחר מכן, בצעו פיפטינג של התאים למעלה ולמטה לפחות עשר פעמים כדי ליצור סספנסיות של תאים בודדים, והעבירו את התאים לתוך מבחנה קונית לצנטריפוגה בנפח 15 milliliter. הניחו את המבחנות בצנטריפוגה עם רדיוס סיבוב משתנה (swing out), וסובבו את סספנסיות התאים במהירות של 400 ×g ובטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. כדי לבצע טיפול היפוטוני, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) מהמבחנות מבלי להפריע למשקע התאים, והשאירו כ-0.5 milliliters של PBS.שברו בעדינות את משקע התאים והשתמשו בפיפט P200 כדי ליצור תרחיף תאים בודדים. לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטר של תמיסת potassium chloride שחוממה מראש, בטיפות ובליווי ניעור עדין. דגרו את תרחיף התאים באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות.לאחר הטיפול ההיפוטוני, קבעו את התאים על ידי הוספת נפח שווה של מקבע למבחנה, וערבבו בעדינות על ידי הפיכת המבחנה. סובבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-400 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות והסירו את הנוזל העליון. בשלב זה, משקע התאים יגדל בנפחיו, יהפוך לצבעה לבנבן ויהיה נראה יותר.הסיר את הנוזל העליון (supernatant). הוסף ארבעה מיליליטרים של מקבע טרי, והדגר את המבחנות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, סבב את המבחנות בצנטריפוגה, הסר את הנוזל העליון, והשתמש בארבעה מיליליטרים של מקבע כדי לשטוף את התאים פעמיים נוספות.הטבילו את השקופיות את הזכוכית באופן מלא בדטרגנט נוזלי בריכוז 10% למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות ביסודיות במי ברז זורמים קרים למשך 30 דקות. השתמשו במים מזוקקים לשטיפת השקופיות שלוש פעמים כדי להסיר לחלוטין את הדטרגנט.לאחר מכן טבול אותן במים מזוקקים, ואחסן את השקופיות במקרר למשך לילה. טפטף 10 µL של תרחיף תאים על שקופית רטובה ומקוררת, והשאר אותה להתייבש למשך לילה בטמפרטורת החדר. לצביעה ולקיבוע של הדגימות, הכן 50 mL של תמיסת צבע גימסה על ידי ערבוב של חלק אחד של תמיסת צבע גימסה עם חלק אחד של PBS, ומזג את התמיסה לצנצנת קופלין.טבול את השקופיות בתמיסת הצביעה למשך 20 דקות, לאחר מכן שטוף את השקופיות במים מזוקקים להסרת שאריות הצבע, וייבש את השקופיות באופן מיידי באמצעות מייבש שיער. השאר את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך הלילה. למחרת בבוקר, הנח טיפה אחת של חומר סגירה (mounting medium) על השקופית.הנח בעדינות זכוכית כיסוי מעל, ואפשר למצע הקיבוע להתפשט לאט על פני השקף. לאחר מכן, השתמש בנייר סופג כדי להסיר עודפי מצע. לבסוף, השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר (bright field) בהגדלה של 100x כדי לבחון את ההשתבשות המבנית של הכרומוזומים בפריסות המטפאזה.תמונה זו מראה כי בפריסת מטאפאזה של עכבר רגיל יהיו 40 כרומוזומים אצנטריים. טיפול בחומר חלקיקים גורם לסטיות כרומוזומליות שונות, כגון שבירת כרומטידה, פרגמנט אצנטרי, כרומוזום טבעתי, כרומוזום דיצנטרי, דבלי מינוטס (double minutes), טרנסלוקציה רוברטסוניאנית ואנדורפליקציה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי יש להשתמש רק בתאים במצב של התחלקות (proliferating cells).בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון M-FISH ו-SKY, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל האם קיימות אברציות יציבות בין-כרומוסומליות. אין לשכוח את האזהרות לגבי חומרים מסרטנים, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות בעת ביצוע הליך זה.

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

Xenopus ביצת התמצית היא מערכת מודל שימושית לחקור מחסום הניזק לדנ"א. פרוטוקול זה מיועד להכנת תמציות ביצת Xenopus ריאגנטים ישכנעו מחסום ניזק לדנ"א. טכניקות אלה הן התאמה למגוון של גישות מזיקות DNA במחקר של איתות מחסום הניזק לדנ"א.

חקר מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות<em&gt; Xenopus</em&gt; תמציות ביצה

סרטון זה מדגים בדיקה רגישה ביותר המבוססת על אימונופלואורסנציה לאיתור נזק חמצוני הנגרם על ידי PM2.5 בליבם של עוברי דגי זברה על ידי מדידת רמות 8-OHdG ו- γH2AX, המצביעות על נזק לדנ"א ושברי DNA דו-גדיליים, בהתאמה.

בדיקת Immunofluorescence לזיהוי נזק ל- DNA בתיווך PM2.5 בעוברי דגים

יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

מסלולי תיקון DNA חיוניים לתחזוקה של שלמות הגנום ומוטצית מניעה וסרטן. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית על ידי תצפית ישירה של סטיות כרומוזום בmetaphase מתפשט מתאי B עכבר באמצעות ניאון הכלאה באתר (FISH) לחזרות דנ"א telomeric.

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

אנו מתארים את השלבים המפורטים של בדיקה כימית בעלת תפוקה גבוהה בנמטודה Caenorhabditis elegans המשמשת להערכת רעילות קו הנבט. בבדיקה זו, הפרעה בתפקוד קו הנבט בעקבות חשיפה לכימיקלים מנוטרת באמצעות מדווח פלואורסצנטי ספציפי לעוברים אנופלואידים.

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

פרוטוקול להערכת שינויים ברמות הנזק ל-DNA וביכולת תיקון ה-DNA שעלולים להיגרם על ידי הקרנה כרונית במינון נמוך in vivo בלימפוציטים של טחול עכבר, על ידי מדידת היסטון זרחני H2AX, מוצג סמן לשבירות דו-גדיליות של DNA, באמצעות זרימה ציטומטרית.

מדידת נזק לדנ&quot;א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני<em&gt; In vivo</em&gt; חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התועלת של הכלאה פלואורסצנטית מרובה באתרה (mFISH) וקריוטיפ ספקטרלי (SKY) בזיהוי סטיות יציבות בין-כרומוזומליות בתאי מח העצם של עכברים לאחר חשיפה לקרינה כוללת של הגוף.

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

הבחנה בשיטת החוץ הגופית היא שיטה מבוססת היטב להערכת הרעילות והרעלת הציטוזה, אך הבקיע את השימוש במיקרוסקופיה ידנית, הוא מפרך וסובל מהבדלים בין השונות לבין השערים. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול שפותח כדי לבצע גרסה אוטומטית לחלוטין של השיטה באמצעות זרימת הדמיה רב ספקטנטרי.

שיטה אוטומטית לביצוע השימוש בשיטת ההדמיה באמצעות הדמיה רב ספקטקטרלית באמצעות זרימה

אנו מתארים כאן שיטות לקוונפיקציה רגיש ומדויק של נגעים 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-דאדו) ו-1,N2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) ב-DNA. השיטות הוחלו על הערכת ההשפעות של חומר מקיף חלקיקי הסביבה (PM2.5) ברקמות (ריאות, כבד וכליות) של עכברים חשופים A/J.

קוונפיקציה של שלוש נגעים DNA ידי ספקטרומטר המוני והערכה של רמות שלהם ברקמות של עכברים חשופים החומר מקיף חלקיקים עדינים

הליך זה הוקם כדי לשמש לפיתוח תרבויות חזה 3D מתקדמות במבחנה, אשר יכול לספק הערכה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית של הסיכונים genotoxic הקשורים חשיפות ננו חומריים על פני משטרי מינון חריפה או ארוכת טווח, חוזרים ונשנים.

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

פיתחנו שיטת QuEChERS-HPLC שונה כדי להעריך את הרמות הפנימיות של 16 PAHs בעוברי דג הזברה.

שיטת QuEChERS-HPLC שונה לזיהוי פחמימנים ארומטיים פוליציקליים בעוברי דג זברה שנחשפו לחלקיקים עדינים

חקור ניתוח סטיות כרומוזומליות בתאי RAW264.7 לאחר חשיפה לחלקיקי אוויר סביבתיים. שיטה זו מאפשרת הדמיה ישירה של נזק גנטי בתרבית ומסייעת בהערכת השפעת מזהמים סביבתיים על שלמות הגנום בביולוגיה של תאים.

ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש

גלה סרטונים נוספים