ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש במבחנה מערכת

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות נזק כרומוזומלי הנגרם מחשיפת תאים לחומר חלקיקי, המופק מהאוויר הסביבתי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח אחת בתחום החלקיקים, והיא האם חשיפה לחומר חלקיקי גורמת לנזק כרומוזומלי? היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא מאפשרת הדמיה ישירה של הנזק הנגרם בחומר הגנטי.

לאחר איסוף וניתוח חלקיקים על פי פרוטוקול הטקסט, בצע חשיפה לחלקיקים על ידי חימום מדיום גידול מלא, 0.25% טריפסין ו-PBS באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות לפחות לפני תחילת התרבות. לאחר שטיפת 264.7 תאים גולמיים, הוסיפו מיליליטר אחד מתמיסת הטריפסין החמה לכלי והעקרו את התאים מתחתית כלי תרבית הרקמה על ידי גירוד. לאחר מכן אספו את התאים וצרו תרחיף חד-תאי על ידי פיפטינג חוזר ונשנה.

עם טריפן כחול, ספרו את מספר התאים, ולאחר מכן השתמשו במדיום שלם שחומם מראש כדי לצלחת אותם בצפיפות של 8000 לסנטימטר רבוע בצלחת תרבית רקמה של 100 מילימטר. לאחר מכן השתמש במדיום שלם כדי להתאים את הנפח ל-10 מיליליטר לריכוז סופי של 50,000 תאים למיליליטר. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-5% CO2 למשך 24 שעות כדי לאפשר להם להיצמד.

בארון בטיחות ביולוגית, השתמש ב-PBS סטרילי כדי לדלל חלקיקים מסוננים בריכוז של 0.5 מיליגרם למיליליטר, עבור מנת טיפול של 5 מיקרוגרם למיליליטר, וב-5 מיליגרם למיליליטר, עבור מנת טיפול של 50 מיקרוגרם למיליליטר. כדי לטפל בתאים עם חומר חלקיקי, בדוק את התאים המתורבתים במיקרוסקופ עם הגדלה פי 10 עבור צמיחת תאים, מורפולוגיה של תאים, מצב תרבית וזיהום. התאים צריכים להיות לפחות 30% מתכנסים בשלב זה.

בעזרת פיפטה סטרילית, שאפו את המדיום באופן אספטי והשתמשו בשני מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס PBS כדי לשטוף את כלי התרבות פעמיים. הוסף מינון קבוע מראש של חומר חלקיקי עם מדיום טרי ודגר את התרביות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 כדי להקביל את החשיפה המשמשת לניתוח גנוטוקסי ואפיגנוטוקסי במקביל. כדי לעצור תאים במטאפאזה, לאחר שטיפת התאים מוסיפים לתרבית שני מיליליטר של מדיום מחומם מראש עם חמישה מיקרוליטר למיליליטר של תמיסת קולצמיד, ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שעתיים.

לאחר הדגירה, הסר לחלוטין את המדיום והשתמש ב- PBS חם כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן מוסיפים תמיסת טריפסין ודוגרים על התרביות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה. בעזרת מגרד תאים, נתק את התאים והוסף 10 מיליליטר PBS כדי להשבית את הטריפסין.

לאחר מכן פיפטה את התאים למעלה ולמטה לפחות עשר פעמים כדי ליצור תרחיף של תא בודד, ולהעביר את התאים לצינור צנטריפוגה חרוטי בנפח 15 מיליליטר. הניחו את הצינורות בצנטריפוגה מתנדנדת, וסובבו את מתלה התאים פי 400 גרם וטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. כדי לבצע טיפול היפוטוני, הסר את הסופרנטנט מהצינורות מבלי להפריע לכדור התא, והשאיר כ-0.5 מיליליטר PBS.

שברו בעדינות את כדור התא והשתמשו בפיפטה P200 כדי ליצור תרחיף תא בודד. לאחר מכן מוסיפים ארבעה מיליליטר של תמיסת אשלגן כלורי מחוממת מראש עם ניעור עדין. דגרו את תרחיף התאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר הטיפול ההיפוטוני, תקן את התאים על ידי הוספת נפח שווה של קיבוע לצינור, וערבב בעדינות על ידי היפוך הצינור. צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 400 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות והסר את הסופרנטנט. בשלב זה, כדור התא יגדל בגודלו ויהפוך לצבע לבנבן וגלוי יותר.

הסר את ה-supernatant. מוסיפים ארבעה מיליליטר של קיבוע טרי, ומדגרים את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות, הסר את הסופרנטנט והשתמש בארבעה מיליליטר של קיבוע כדי לשטוף את התאים פעמיים נוספות.

טבלו את שקופיות הזכוכית לחלוטין בחומר ניקוי נוזלי של 10% למשך 30 דקות. לאחר מכן יש לשטוף היטב את המגלשות במי ברז זורמים קרים למשך 30 דקות. השתמש במים מזוקקים כדי לשטוף את השקופיות שלוש פעמים כדי להסיר לחלוטין את חומר הניקוי.

לאחר מכן טבלו אותם במים מזוקקים, ואחסנו את השקופיות במקרר למשך הלילה. זרוק עשרה מיקרוליטר של תרחיף תאים על מגלשה רטובה צוננת, והניח לו להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. כדי להכתים ולהרכיב את הדגימות, הכינו 50 מיליליטר של תמיסת צביעת גימסה על ידי ערבוב חלק אחד של תמיסת כתמי גימסה, עם חלק אחד של PBS, ושפכו לצנצנת קופלין.

טבלו את השקופיות בתמיסת מכתים למשך 20 דקות, ולאחר מכן שטפו את השקופיות במים מזוקקים כדי להסיר כתמים עודפים, והשתמשו מיד במייבש שיער לייבוש השקופיות. השאירו את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך הלילה. למחרת בבוקר, מרחו טיפה אחת של אמצעי הרכבה על המגלשה.

הנח בעדינות החלקת כיסוי מעל, ואפשר למדיום ההרכבה להתפשט לאט על המגלשה. לאחר מכן השתמש במגבת נייר כדי להסיר עודפי מדיום. לבסוף, השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה של פי 100 כדי לבחון את הסטיות הכרומוזומליות המבניות בהתפשטות המטאפאזה.

תמונה זו מראה כי התפשטות מטאפאזה רגילה של עכבר, תכלול 40 כרומוזומים א-צנטריים. טיפול בחומר חלקיקי גורם לסטיות כרומוזומליות שונות, כגון שבר כרומטי, שבר א-צנטרי, כרומוזום טבעתי, כרומוזום דיצנטרי, דקות כפולות, טרנסלוקציה רוברטסונית, ואנדורדופליקציה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שיש להשתמש רק בתאים מתרבים.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כמו M-FISH ו-SKY, כדי לענות על שאלות נוספות. כמו האם קיימות סטיות בין-כרומוזומליות ויציבות. אל תשכח את האזהרות והחומרים המסרטנים, ואמצעי זהירות כמו לבישת כפפות, תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.