פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

המטרה הכוללת של שיטה זו המבוססת על פפטידים היא להוביל גנים וחלבונים דרך מחסומים תאיים ואורגנליים בצמחים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח באמצעות שינוי צמחים בעזרת תצמידי פפטידים שתוכננו באופן רציונלי, אשר מעבירים גנים וחלבונים שונים כדי לתווך את הביטוי של גנים ספציפיים. היתרון המיידי של טכניקה זו הוא שהיא עושה שימוש בהליך טרנספקציה פשוט של עלי צמחים בעזרת מזרק, המבוסס על פפטידים המסוגלים לחצות גבולות תאיים ואורגנליים.

פיתחנו את שיטת התעתוק (טרנספורמציה) החדשנית, הפשוטה והיעילה הזו לצמחים מכיוון שהשיטות המקובלות הן יקרות, אינן ישימות לסוגי צמחים מסוימים, ואינן מסוגלות להכווין את עצמן לאורגנלות תוך-תאיות. ג'ו-אן צ'רץ' תדגים את ההליך יחד עם יוקו הורי, טכנאית מהמעבדה שלי. הכינו את פורמולציית ה-DNA של פלזמת הפפטיד כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

כאשר מוסיפים את הפפטיד ל-DNA של הפלזמה, יתגבש תמיסה עכורה. התערובת תהפוך לצלולה לאחר דילול במים אולטרה-טהורים לנפח הסופי המפורט בפרוטוקול הטקסט. העבירו 800 microliters מהתמיסה המדוללת לכובבית לצורך אנליזת פיזור אור דינמי (DLS).

קבע את הקוטר ההידרודינמי ואת מדד הפולידיספרסיות של הקומפלקסים שנוצרו באמצעות zetananosizer. השתמש בלייזר הליום-ניאון של 633 nanometer בטמפרטורה של 25 degrees celsius עם זווית גילוי של פיזור אחורי של 173 degrees. לאחר מדידות הגודל, העבר את התמיסה לתא קפילרי מקופל למדידות פוטנציאל זטא בפרמטרים ברירת המחדל של קבוע הדיאלקטריות, מקדם השבירה והצמיגות של מים בטמפרטורה של 25 degrees celsius.

כדי לבחון את התמיסה המורכבת באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי, יש להניח 10 µL על פני השטח החשופים שנוצרו לאחר שבירת לוח מיקה, ולהשאיר את המיקה להתייבש באוויר למשך לילה בכלי פטרי מפלסטיק מכוסה. יש לצלם תמונה של הקומפלקסים באוויר בטמפרטורה של 25 °C באמצעות קנטילבר סיליקון עם קבוע קפיץ של 1.3 N/m במצב tapping. השתמש בצמחי Arabidopsis thaliana בני שלושה שבועות שגודלו במחזור של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך, בטמפרטורה של 22 °C.

בחרו לפחות שלושה עלים לטרנספקציה כדי לשמש כחוזרים (triplicate) לצורך כימות ביטוי הגנים. מלאו מזרק פלסטיק ללא מחט בנפח של 1 מיליליטר ב-100 µL של תמיסה מורכבת עבור טרנספקציה של עלה אחד. לאחר מכן, מקמו את קצה המזרק על פני השטח האבაქסליים (הצד התחתון) של העלה.

הצמד את קצה המזרק בעדינות אל העלה, ולחץ על בוכנת המזרק באיטיות תוך הפעלת לחץ נגדי עם האצבע המורה של יד עוטה כפפת לטקס מהצד opposite. ניתן לזהות חדירה מוצלחת על ידי התפשטות של אזור ספוג במים בעלה. סמן את העלים שחלחלו אותם לצורך זיהוי קל.

הדגרי את הצמח שהועבר אליו ה-DNA של פלסמיד הפפטיד למשך 12 שעות בתא גידול. כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה, ראשית חתוך את כל העלה שעבר טרנספקציה. עבור ניסויי טרנספקציה המשתמשים בווקטור דורש (reporter vector) של Renilla Luciferase, קבע את יעילות הטרנספקציה באופן כמותי באמצעות ערכה לבדיקת Renilla Luciferase.

ראשית, העבירו כל עלה שגזור לתוך מבחנה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. הוסיפו 100 מיקרוליטר של 1X Lysis Buffer לכל מבחנה. באופן דומה, הכינו ליזאטים של עלי בקרה שאינם טרנספקטים בשלוש חזרות.

טחנו את העלה באמצעות פסטל הומוגניזציה והדגירו את הליזאט שהתקבל ב-25 °C למשך שש עד 10 שעות. לאחר ההדגרה, סבבו את הליזאט בצנטריפוגה ב-12,470 ×g במיקרוצנטריפוגה למשך דקה אחת. העבירו 20 µL מהליזאט המזוך לבאר במיקרופלטה של 96 בארות.

השתמשו בנפח הנותר לצורך כימות ריכוז החלבון הכולל באמצעות ערכה לבדיקת חלבון BCA בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר מכן, הוסיפו לבאר 100 µL של תסבסב (substrate) בריכוז 1x עבור בדיקת Renilla Luciferase וערבבו באמצעות פיפוט איטי. הניחו את המיקרופלט בקומינקה (reader) רב-מצב למיקרופלט והתחילו במדידה.

עבור ניסויי טרנספקציה המשתמשים בווקטור דווח של חלבון פלואורסצנטי ירוק, יש לבחון את הפלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזרי קונפוקאלי. ראשית, יש לקצץ את שולי העלה השל כדי לסייע בהסרת כיסי אוויר. לאחר מכן, יש להוציא את הבוכנה ממזרק של 10 milileter ולהניח כל עלה או קטע עלה שגזרו בתוך המזרק.

החזירו את הבוכנה ודחפו אותה בעדינות לתחתית המזרק מבלי למעוך את העלה. שאבו מים למזרק עד שיהיה מלא בערך עד מחציתו. כוון את המזרק כלפי מעלה ולחצו על הבוכנה כדי להוציא את האוויר מהמזרק דרך הפיה.

לאחר מכן, כסו את קצה המזרק ומשכו את הבוכנה למטה באיטיות כדי להוציא אוויר מהעלה. חזרו על תהליך זה מספר פעמים עד שהעלה ייראה שקוף למחצה. לאחר מכן, כסו את פניו של סרט מיקרוסקופ בסרט דבק.

בעזרת להב, חתכו בסרט דביק שטח ריבועי הגדול מספיק כדי להכיל את דגימת העלה, וקלפו את פיסת הסרט הריבועית באמצעות פינצטה כדי ליצור תא לדגימה. הסרט ישמש כמפריד בין הזכוכית למכסה. הניחו את העלה בתא כאשר הפנימי (abaxial) פונה כלפי מעלה, ומלאו את שאר שטח התא במים.

אטמו את העלה בתוך התא באמצעות כיסוי זכוכית (cover slip) ואבטחו את קצות הכיסוי באמצעות סרט דבק. בחנו את דגימת העלה באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזרי קונפוקלי תחת עדשה של 40x או עדשת טבילה במים של 63x. ניתן להדמיא פלואורסצנציית GFP באורך גל עירור של 488 nanometers.

הכנה אופטימלית של פורמולציית ה-DNA פלזמה פפטידית ביחס פפטיד-ל-DNA של 0.5 צריכה להיות בעלת קוטר ממוצע של כ-290 ננומטר ומדד פולידיספרסיות נמוך של כ-0.3, המעיד על התפלגות גודל אחידה. בנוסף, הקומפלקסים צריכים להפגין פוטנציאל זטא של כ-30 מיליוולט. תמונת מיקרוסקופ כוח אטומי מייצגת של קומפלקסי ה-DNA פלזמה פפטידית מוצגת כאן.

נצפו קומפלקסים גלובולריים הומוגניים. באמצעות פורמולציית DNA של פלסמה עם פפטידים, ניתן להשיג הובלה למגוף הגרעין וביטוי של DNA של פלסמה ב-Arabidopsis thaliana, עם ערך מוערך של Renilla Luciferase למיליגרם של כ-100,000. תצפית מיקרוסקופית בוצעה בעלים שטופלו בקומפלקסים שהוכנו באמצעות DNA של פלסמה, המקודד ל-GFP reporter, כדי להעריך את ביטוי הגן.

התמונות גילו כי בתאים שהוחדרו קומפלקסים של DNA פלסמי עם פפטידים לא מכוונים, נצפתה בבירור פלורסצנציה ירוקה דיפוזית התואמת לביטוי GFP, ונמצא כי היא ממוקמת בציטזול. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביוטכנולוגיה של צמחים להחדרה של מטענים שונים מבוססי חלבונים וחומצות גרעין לצמחים חיים. לאחר צפייה בסרטון זה וקריאת הפרוטוקול הכתוב, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ההכנה, האפיון והיישום של פורמולציות אופטימליות שונות עבור כל סוג של מטען, הכוללות DNA פלסמי, DNA או RNA דו-גלגלי וחלבון.