Name: פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: למד שיטת פפטידים חדשנית להעברת גנים וחלבונים לתאי צמחים דרך מחסומים תאיים ואברוניים. השיטה מציעה גישה פשוטה ויעילה להנדסה גנטית בצמחים Arabidopsis thaliana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות במימון מדע יפן וטכנולוגית סוכנות גישוש מחקר לטכנולוגיה מתקדמת (JST-Erato), האנרגיה החדשה התעשייתי טכנולוגית הפיתוח הארגוני (NEDO), וצלב-משרדי אסטרטגי חדשנות קידום התכנית (SIP), יפן .

1. הכנת פורמולציות מבוסס פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות המניות של כל פפטיד כדלקמן: (KH) 9 -BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל או 800 ננומטר), Cytcox- (KH) 9 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו (BP100) 2 K 8 (70 מיקרומטר). לשקול את הכמות הנדרשת של כל פפטיד צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge ולהוסיף מים ultrapure autoclaved לפזר את הפפטיד. מערבבים היטב על ידי pipetting חוזר על עצמו עד פתרון ברור מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר ולטהר את ה- DNA פלסמיד (pDNA), פעמיים גדילי דנ&quot;א (dsDNA) ו- RNA פעמיים תקועים (dsRNA) על פי מתודולוגיות מולקולרי רגיל. ב 1.5 מ&quot;ל צינורות microcentrifuge, להפוך פתרונות מניות עם ריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(pDNA ו dsDNA) או 400 ננומטר (dsRNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון חלבון מניות עם ריכוז של 7 מיקרומטר, על ידי המסת 1 מ&quot;ג של חלבון (למשל., Dehydrogenase אלכוהול, ADH) אבקה ב 1 מיליליטר של תמיסת סודיום קרבונט (0.1 M, pH 9). לייבל החלבון עם fבדיקות luorescent כגון rhodamine B (RHB) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים כדי לאפשר להדמיה מיקרוסקופית של החלבון אל תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המרכיבים השונים בתוך שפופרת microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים פפטיד-pDNA מיקוד הציטופלסמה, להוסיף 6.4 μl של (KH) 9 -BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עד 20 μl של pDNA (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הוסף 773.6 μl מים ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. השתמש מבנה pDNA המיועד ביטוי גרעינית (P35S-RLuc-TNOS, טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים פפטיד-pDNA מיקוד המיטוכונדריה, להוסיף 6.6 μl של Cytcox- (KH) 9 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עד 20 μl של pDNA (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 ° C ולאחר מכן להוסיף 2.4 μl של BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל). אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 256; צלזיוס במשך 15 דקות אחרות. להוסיף 771 μl של מי ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. השתמש מבנה pDNA המיועד ביטוי המיטוכונדריה (pDONR-COX2: rluc, טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים פפטיד-dsDNA, להוסיף 5.1 μl של (KH) 9 -BP100 (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עד 8 μl של dsDNA (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הוסף 786.9 μl מים ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים פפטיד-dsRNA, להוסיף 50 μl של (KH) 9 -BP100 (800 ננומטר) 50 μl של dsRNA (400 ננומטר) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הוסף 700 μl של RNase ללא מים כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסוחים-חלבון פפטיד, להוסיף 16 μl של (BP100) 2 K 8 (70 מיקרומטר) ל -16 μl של ADH (7 מיקרומטר) ומערבביםהיטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. להוסיף 768 μl של מי ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הניסוחים לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. </li></ol> .2 אפיון פורמולציות מבוסס פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כל פתרון (800 μl) לתוך קובט לניתוח דינמי פיזור אור (DLS). לקבוע את מדד בקוטר polydispersity הידרודינמית של מתחמי הקים עם nanosizer זטה, באמצעות לייזר 633 ננומטר הוא Ne-של 25 מעלות צלזיוס עם זווית גילוי backscatter של 173 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מדידות גודל, להעביר כל פתרון (800 μl) לתוך תא נימי מקופל למדידות פוטנציאל זטה ב פרמטרים ברירת המחדל של קבוע דיאלקטרי, מקדם השבירה ואת צמיגות המים במהירות של 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים נפח קטן של פתרון מורכב, המשמש ניתוח DLS, על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). הפקדה של 10 μl של פתרון מורכב על גבי המשטח בקע חשוף הטרי של גיליון יציץ ולהשאיר את המיקה לאוורר לילה יבש בצלחת פטרי פלסטיק מכוסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה של המתחמים באוויר ב 25 מעלות צלזיוס באמצעות שלוחת סיליקון עם קבוע קפיץ של 1.3 N / מ &#39;קשה במצב 27,28. </li></ol> הסתננות 3. עלי צמח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 3 צמחי קרקע-הזדקנו שבוע (ארבידופסיס thaliana 24, ניקוטיאנה benthamiana 24 או 26 צפצפה). Transfect לפחות 3 עלים לשמש בשלושה עותקים עבור כימות של ביטוי גנים או מסירת חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מזרק פלסטיק מחטים 1 מ&quot;ל עם 100 μl של פתרון מורכב עבור transfection של עלה אחד. מקם את קצה המזרק על פני שטח abaxial של העלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על קצה המזרק נגד עלה מעט לוחץ על מתג המזרק לאט תוך הפעלת א-לחץ נגדי עם iאצבע ndex של יד לטקס בכפפות מהצד ההפוך. ניתן לצפות חדירה מוצלחת כמו הפצת אזור ספוגת מים עלה. לייבל העלים הסתננו על מנת להקל על הזיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עלה טרנספקציה משכי אופטימיזציה הבאים חדירה עם-pDNA פפטיד (12 שעות), פפטיד-dsDNA (12 שעות), פפטיד-dsRNA (9 - 48 שעות) ו-חלבון פפטיד (6 שעות) ניסוחים בתנאים הבאים: 16 hr אור / 8 שעות בחושך ב 22 מעלות צלזיוס למשך א thaliana ו צפצפה, או 24 שעות אור קבוע ב 29 מעלות צלזיוס למשך נ benthamiana. </li></ol> הערכת 4. יעילות Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והבלו כולו עלה טרנספקציה של שהמפעלים הקטנים יותר (למשל., Thaliana א) או סעיף 1 ס&quot;מ 2 של האזור הסתננו לצמחים גדולים (למשל., נ benthamiana). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים transfection באמצעות בלוציפראז Renilla (Rluc) וקטור הכתב, לקבוע את transfectioיעילות n כמותית באמצעות ערכת Assay Rluc. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל עלה נכרת או סעיף עלה בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. הוספת 100 μl של 1 × Rluc Assay הצפת תמוגה לכל צינור. באותו אופן, להכין lysates עלי שליטה הלא transfected (בשלושה עותקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחן את העלים באמצעות עלי המגון דגירת lysate כתוצאה במהירות של 25 מעלות צלזיוס במשך 6 - 10 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב g 12,470 × ב microcentrifuge דקות 1. העברת 20 μl של lysate פינה אל באר בתוך microplate 96-היטב, ולהשתמש נפח הנותרים כימות של ריכוז החלבון הכולל באמצעות ערכת Assay חלבון BCA פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של 1 × המצע Assay Rluc (מדולל באמצעות הצפת Assay Rluc) לתוך הבאר ומערבבים ידי pipetting איטי. מניחים את microplate ב קורא microplate multimode וליזום המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הארת הרקע (ממוצע של לאn-טרנספקציה בשלושה עותקים) מכל ההארה של מדגם הניסיון. חשב את היחס בין photoluminescence (יחידות אור יחסי, RLU) לסכום של חלבון (מ&quot;ג). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים transfection באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וקטור הכתב או שכותרתו fluorescently חלבון (למשל., ADH-RHB), ולבחון את הקרינה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקצוות של עלה שלם (כדי לסייע להסרת חללי האוויר), בעוד עלה מחולק יכול לשמש הוא. הסר את הבוכנה של מזרק 10 מ&quot;ל ומניח כל חלק לעלה או עלה ניכר בתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הבוכנה ולחץ עליו בעדינות לתחתית המזרק ללא ריסוק העלה. לשאוב מים לתוך המזרק עד שהוא כמחצית מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המזרק כלפי מעלה ודוחפים את הבוכנה כדי להסיר אוויר מן המזרק דרך קצה. מכסה את קצה המזרק ולמשוך את הבוכנה כלפי מטה לאט לגרש אוויר מן לאהf. חזור על תהליך זה מספר פעמים עד העלה נראה שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את פני השטח של המיקרוסקופ שקופית עם דבק. חותכי שטח מרובע בקלטת הגדולה מספיק כדי להכיל את המדגם עלה באמצעות סכין, לקלף את הפיסה הרבועה של קלטת את עם מלקחיים כדי ליצור תא דגימה. הקלטת תשמש spacer בין השקופיות coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עלה בתא עם המשטח abaxial פונה כלפי מעלה ולמלא באזור תא הנותרים עם מים. חותם את העלה בתוך תא עם coverslip זכוכית ולאבטח את הקצוות של coverslip עם סרט דביק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המדגם עלה באמצעות מיקרוסקופ סורק לייזר confocal תחת מטרה 40X או טבילה אובייקטיבי מים 63X. GFP או קרינת RHB ניתן דמיין באורכי גל עירור של 488 ננומטר או 555 ננומטר, בהתאמה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Altman, A., Hasegawa, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+A+%22Plant+biotechnology+and+agriculture%3A+Prospects+for+the+21st+century%22">Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).</li>
<li>Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+molecular+farming%3A+systems+and+products%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Plant molecular farming: systems and products.</a> Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+the+biology+behind+the+%26%2334%3Bgene-jockeying%26%2334%3B+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &#34;gene-jockeying&#34; tool.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li>
<li>Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Nature. 327, 70-73 (1987).</li>
<li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).</li>
<li>Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transformation+of+plant+protoplasts+with+Ti-plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA.</a> Nature. 296, 72-74 (1982).</li>
<li>Birch, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+transformation%3A+problems+and+strategies+for+practical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Physiol.+Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant transformation: problems and strategies for practical application.</a> Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).</li>
<li>Newell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+transformation+technology.+Developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Plant transformation technology. Developments and applications.</a> Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).</li>
<li>Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+gene+transfer+from+transgenic+plants+to+terrestrial+bacteria--a+rare+event%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event?</a> FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).</li>
<li>Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChuah%2C+JA+%22Engineering+in+Translational+Medicine%22">Engineering in Translational Medicine</a>. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).</li>
<li>Nitta, S., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopolymer-based+nanoparticles+for+drug%2Fgene+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).</li>
<li>Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28amino+acid%29s%2Fpolypeptides+as+potential+functional+and+structural+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+J%22%5BJournal%5D)">Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials.</a> Polym. J. 47, 537-545 (2015).</li>
<li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-based+delivery+systems+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Silk-based delivery systems of bioactive molecules.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).</li>
<li>Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+silk+protein-based+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioengineered silk protein-based gene delivery systems.</a> Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).</li>
<li>Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+nanocarrier+for+macromolecule+delivery+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells.</a> IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).</li>
<li>Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+peptide+Bp100+as+a+cell-penetrating+tool+for+the+chemical+engineering+of+actin+filaments+within+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells.</a> ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).</li>
<li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-based+gene+carriers+with+cell+membrane+destabilizing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides.</a> Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).</li>
<li>Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+mediated+by+recombinant+silk+proteins+containing+cationic+and+cell+binding+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs.</a> J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).</li>
<li>Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-based+nanocomplexes+with+tumor-homing+peptides+for+tumor-specific+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery.</a> Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).</li>
<li>Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+silk-based+gene+carriers+for+tumor+cell-specific+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery.</a> Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).</li>
<li>Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+introduction+into+the+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana+via+peptide-based+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers.</a> Sci. Rep. 5, 7751(2015).</li>
<li>Plant transformation method. Patent. , WO2015133652 A1 (2015).</li>
<li>Ng, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+of+proteins+in+intact+plants+via+fusion+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides.</a> PLoS ONE. 11, e0154081(2016).</li>
<li>Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+gene+delivery+into+plant+cells+using+designed+peptide+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers.</a> Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).</li>
<li>Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+DNA+introduction+into+intact+plants+using+peptide-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes.</a> Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).</li>
<li>Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+gene+silencing+in+plants+via+synthetic+dsRNA+and+carrier+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).</li>
<li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+degradation+processes+of+poly%5B%28R%29-3-hydroxybutyric+acid%5D+and+poly%5B%28R%29-3-hydroxybutyric+acid-co-%28R%29-3-hydroxyvaleric+acid%5D+single+crystals+revealed+by+atomic+force+microscopy%3A+effects+of+molecular+weight+and+second-monomer+composition+on+erosion+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates.</a> Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).</li>
<li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+biopolyester+depolymerase+on+silicon+wafer+and+poly%5B%28R%29-3-hydroxybutyric+acid%5D+single+crystal+revealed+by+real-time+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM.</a> Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).</li>
<li>Kawai, S., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+procedure+for+DNA+transfection+with+polycation+and+dimethyl+sulfoxide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).</li>
<li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li>
<li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+transfection+by+physical+concentration+of+DNA+at+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface.</a> Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).</li>
<li>Boynton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+transformation+in+Chlamydomonas+with+high+velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles.</a> Science. 240, 1534-1538 (1988).</li>
<li>Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+thaliana+Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Plastid transformation.</a> Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).</li>
<li>Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+plastids+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of plastids in higher plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).</li>
<li>Liu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+of+plant+mutants+with+large+genomic+DNA+fragments+by+a+transformation-competent+artificial+chromosome+vector+accelerates+positional+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).</li>
<li>Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shorter+T-DNA+or+additional+virulence+genes+improve+Agrobactrium-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation.</a> Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).</li>
<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+an+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).</li>
<li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Front. Plant Sci. 5, 379(2014).</li>
<li>Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li>
<li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLoeb%2C+TA+%22Transgenic+Crops+I%22">Transgenic Crops I</a>. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול אשר זוהו באופן אמפירי נדונים. על ידי חדירת מזרק, הניסוחים מבוססי פפטיד המוכנסים הנאדיות בתוך עלה הצמח דרך הפיוניות. כדי להבטיח ספיגה מקסימלי של הפתרון, בתהליך החדיר צריכה להתבצע כאשר הצמחים נמצאים תחת תנאים שהם תורמים פתיחת הפיוניות כלומר., מסופקים עם מספיק מים ובתקופת האור. באשר להכנת מתחמי transfection, על ניסוחים שכוללים שילוב של שני פפטידים (למסירת DNA במיקוד המיטוכונדריה), הרצף עבור תוספת של כל רכיב חיוני ולא צריך להיות הפוך. ישנם שינויים רבים סבירים לנוהל. אופציה נוספת עבור חדירת תאי צמח היא השימוש של חדירת אבק, אשר מסוגל להציג את הפתרון המורכב לתוך צמחים שלמים ו / או רקמות חלקיות כוללmeristems הפסגה. עבור הליך חלופה זו, שתילי שקועות הפתרון transfection, ובהתבסס על הלחץ שנוצר על ידי ואקום, מתחמי מטען הפפטיד נאלצים דרך הפיוניות ולתוך בתאי צמח (Yoshizumi, ט, נתונים שלא פורסמו). ביטוי גני חלוף, בהתבסס על מחקרים באמצעות תאים מן החי, מוכיח להגדיל עם ריכוזי DNA גבוהים 29-31. חשוב לציין כי היחס של פפטיד ל- DNA משפיע על מאפייני biophysical (גודל, פריצת שטח) של מתחמים (איור 4), אשר משפיע יעילה transfection; ומכאן, היחס האופטימלי צריך להישמר גם עם ריכוז ה- DNA מוגבר. אחד היתרונות העיקריים באמצעות פפטידים כסוכן למסירת גן / חלבון הוא כי הרצף שלה ניתן כוונון למלא תפקיד רצוי. לדוגמא, תחום מיקוד-המיטוכונדריה של הפפטיד המוביל מתואר הרבעה זוy יכול להיות מוחלף עם רצפים chloroplastic או peroxisomal מיקוד עבור לוקליזציה אברונים אלה. בעוד שתמורה הכלורופלסט אפשרי בכמה צמחים באמצעות biolistics 32-34, לא Agrobacterium ולא שיטת biolistic יכול להציג גנים לתוך המיטוכונדריה או אברונים אחרים מלבד גרעין (טבלה 2). אין מגבלות מארח לטווח קשיחים transfection מבוססי פפטיד, בשונה משיטת מבוססי Agrobacterium (טבלה 2). עד כה, ניסוחים עבור transfection של thaliana א, נ benthamiana וצפצפה מוטבו (טבלה 1), אבל השיטה יכול להיות מיושם גם עבור טבק, זן עגבניות מיקרו-טום, אורז (מבוסס על ניסויים ראשוניים), וצמחים ובי-dicotyledonous אחרים. נכון לעכשיו, אין שום מגבלה ידועה בגודל transgene כאשר פפטידים הם השתמשווקטורי transfection הים. לעומת זאת, מולקולות דנ&quot;א גדולות נמצאו להפחית את יעילות השינוי של שיטות בתיווך Agrobacterium 35,36, ו מגבלת גודל עליון transgenes של כ 200 kb דווח 37-39. שימוש biolistics, מצד השני, קטעי דנ&quot;א גדולים עשויים להיות טעונים במהלך הכנה או מסיר לתוך צמחי 38. אמנם אין גבול עליון נקבע לטרנספורמציה biolistic עד כה, אילוצים פיזיים נמצאו להגביל את הגודל של ה- DNA כי ניתן להעביר הרבה פחות מ -150 KB 40. היתרונות העיקריים של שימוש במערכת מבוססת-פפטיד עבור העברת גנים לעומת הגישות קיימות העסקה או Agrobacterium או הפגזת microprojectile, שנדונו לעיל, מסוכם בטבלה 2. במוגבלות מעטיבשביל שיטה זו כפי שהיא עומדת. ראשית, ממוקד משלוח של pDNA כדי האברונים ספציפיים, כגון mitochondria, הוכח אפשרי על ידי שילוב פשוט של ה- DNA מחייבת חודר תאים רצפים במעבר אברון למרות היעילות הייתה נמוכה. הביטוי transgene ניתן היה לזהות, על ידי מיקרוסקופ confocal, רק אוכלוסייה קטנה של המיטוכונדריה בתוך התאים. לפיכך, שינויים נוספים נחוצים כדי: (i) לשפר את טרנסלוקציה של מתחמים יותר על פני התא / קרום organellar, וכן (ii) לשפר את הניתוק והעברת pDNA מן פפטיד המוביל לתוך אברון היעד לביטוי. שנית, באמצעות מערכת מסירת DNA זה, הביטוי החולף של גני כתב אקסוגניים הושג בהצלחה בתא cytosolic ו המיטוכונדריה של תאים. התאגדות וביטוי יציב של הגנים הציגו את הכור הגרעיני / הגנום organellar לא הוקמו עדיין, עם זאת, בשל העדר של אסטרטגיות בחירה מתאימות. אף שהוא מודה כי ישנם אזורים לשיפור או ד נוסףevelopment, האסטרטגיה נגזרת פפטיד המתוארת כאן נשארת טכניקה פשוטה צדדית סללה את הדרך עבור משלוח מטענים שונים לסוגי צמח מגוונים.

הנדסה גנטית של צמחים משמשת באופן קונבנציונלי להעברת תכונות מועילות לצמחים. בשנים האחרונות יושמה טכנולוגיה זו להמרת צמחים למפעלים ביולוגיים לייצור חלבונים בעלי חשיבות פרמצבטית ובעלי ערך מסחרי, שרבים מהם אינם ניתנים לסינתזה כימית והם יקרים מאוד לייצור באמצעות מערכות בעלי חיים או מיקרוביאליות1. על ידי הכנסת גנים חדשים, ניתן לתמרן את חילוף החומרים של הצמח עצמו לייצור תרופות ביולוגיות שונות כמו נוגדנים, אנזימים מטבוליים, הורמונים, אנטיגנים או חיסון2.
טכנולוגיות העברת גנים מבוססות לצמחים הן אספקה בתיווך אגרובקטריום 3, הפצצה במיקרו-קליעים מצופים DNA (ביוליסטיקה)4, ואלקטרופורציה5 או פוליאתילן גליקול6 טיפול בפרוטופלסטים. טכניקות הדורשות פרוטופלסטים נמנעות בדרך כלל מכיוון שהן גוזלות זמן, מסורבלות ומניבות תוצאות לא עקביות7. כתוצאה מכך, כמעט כל עבודות שינוי הצמח כיום משתמשות באגרובקטריום או במיקרו-קליעים להעברת גנים. שיטת Agrobacterium נמצאת בשימוש נרחב יותר אך אינה ישימה למיני צמחים רבים בעלי חשיבות כלכלית. בינתיים, הפצצת מיקרו-קליעים היא מגוונת יותר בשל מגוון רחב של צמחים רגישים, אך דורשת ציוד מיוחד ולעתים קרובות גורמת לנזק חמור לרקמות. יתר על כן, שיטות אלה כוללות מנגנון אספקה אקראי (ביוליסטיקה) או מורכב (אגרובקטריום) ויש להן שיעורי טרנספורמציה משתנים8. לפיכך, נדרשת טכנולוגיה חדשה לשינוי צמחים שהיא פשוטה אך יעילה, וישימה לסוגי צמחים שונים.
נכון לעכשיו, צמחים נתונים לשינוי גנטי בעיקר על ידי אספקת DNA אקסוגני המקודד תכונה רצויה, ולא על ידי אספקה ישירה של חלבון מטרה. היציבות הגבוהה יותר של DNA על פני חלבונים היא יתרון עיקרי; עם זאת, בעיות פוטנציאליות הקשורות להעברת DNA כוללות החדרה אקראית של DNA אקסוגני לגנום הצמח והעברה לא מכוונת של גנים עמידים לאנטיביוטיקה לחיידקים פתוגניים באמצעות העברת גנים אופקית9. למטרות עריכת גנום, היכולת לערוך גנומים של צמחים מבלי להכניס DNA זר לתאים עשויה לעקוף חששות רגולטוריים הקשורים לצמחים מהונדסים גנטית. לפיכך, אסטרטגיה חלופית נטולת DNA לשינוי צמחים על ידי אספקה ישירה של חלבון תוכל לספק את הצרכים הללו.
כאן אנו מציגים מערכת מבוססת פפטיד, שפותחה במקור עבור ריפוי גנטי אנושי10-14, לאספקה ממוקדת של גנים או חלבונים אקסוגניים בצמחים שלמים. פפטידים מסוגלים להגן על ה-DNA מפני פירוק נוקלאז ויכולים לתווך העברת גנים בין תאים כמו גם ממברנות אורגניות15-17. יש להם גם תכונות מגוונות וניתנות לכוונון מלבד היותם לא ציטוטוקסיים18-20. חשוב מכך, עם השימוש בפפטידים, ניתן למקד גנים במדויק לאברונים תוך-תאיים כגון המיטוכונדריה21 או פלסטידים (כלורופלסטים)22 לביטוי - משימה שאינה ניתנת להשגה על ידי טרנספורמציה ביוליסטית או בתיווך אגרובקטריום. בהתאם לסוג המטען, ניתן לנצל את טכנולוגיית שינוי הצמח החדשה הזו כדי לספק חלבונים23 ולבטא (פלסמיד21,24 או DNA דו-גדילי25) או לווסת למטה (RNA דו-גדילי26) גנים ספציפיים בתוך הצמח, בכל החלל הציטוזולי שלו24-26 או בתוך תא אורגנלרי ספציפי21. פפטידי הנשא המתוכננים מורכבים מתחום קטיוני בצורת פוליליזין (K8) או פוליליזין-קו-היסטידין (KH)9 לקשירה ו/או עיבוי של מטענים בעלי מטען שלילי, המצומד לרצפי חדירת תאים (פפטיד BP100) או מעבר מיטוכונדריה (פפטיד Cytcox).

<table><tbody><tr><td>(KH)9-BP100 פפטיד</td><td>מסונתז בהתאמה אישית על ידי מכון מדעי המוח RIKEN</td><td>N/A</td><td>רצף: KHKHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>(BP100)2-K8 פפטיד</td><td>מסונתז בהתאמה אישית על ידי מכון מדעי המוח RIKEN</td><td>רצף</td><td>: פפטיד KKLFKKILKYLKKLKKIL- KYLKKKKKKKK</td></tr><tr><td>BP100</td><td>מסונתז בהתאמה אישית על ידי מכון מדעי המוח RIKEN</td><td>רצף N/A</td><td>: KKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>Cytcox-(KH)9 פפטיד</td><td>מסונתז בהתאמה אישית על ידי מכון מדעי המוח RIKEN</td><td>N/A</td><td>רצף: MLSLRQSIRFFKKHKHKHKH- KHKHKHKHKHKH</td></tr><tr><td>P35S-GFP(S65T)-TNOS ו-P35S-RLuc-TNOS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>מקודד גנים של חלבון פלואורסצנטי ירוק וגנים של Renilla luciferase, בהתאמה, תחת שליטת המקדם המכונן CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td></tr><tr><td>pDONR-cox2:gfp ו-pDONR-cox2:rluc</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>מקודד גנים של חלבון פלואורסצנטי ירוק וגנים של Renilla luciferase, בהתאמה, תחת שליטת המקדם הספציפי למיטוכונדריה cox2 (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)</td></tr><tr><td>dsDNA (PCR מוגבר מ-pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>מקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק וגנים Renilla luciferase, בהתאמה, תחת שליטת מקדם מכונן CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td></tr><tr><td>GFP5 siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>להשתקה מתווכת הפרעות RNA של חלבון פלואורסצנטי ירוק (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>CHS siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>להשתקה מתווכת הפרעות RNA של סינתאז כלקון (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>1 מ"ל ו-10 מ"ל מזרקי פלסטיק</td><td>TERUMO Corporation</td><td>SS-01T, SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>AS ONE Corporation</td><td>151212</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחת תחתונה</td><td>שטוחה Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>סרט דבק</td><td>Sekisui כימיקלים ושות', בע"מ</td><td>מס' 835</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול דהידרוגנאז</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות', LLC.</td><td>A-7011</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כוח אטומי</td><td>סייקו אינסטרומנטס בע"מ</td><td>SPI3800, SPA 300HV</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כוח אטומי</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>AFM5300E</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>K-A102001593</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Cork Borer</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>Z165220</td><td>לכריתת עלים לדיסקים בקוטר 1 ס"מ</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>C02261</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>759116</td><td></td></tr> תא <tr><td>נימי מקופל</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td></td><td></td>DTS1070</tr><tr><td>מלקחיים</td><td>שימיזו אקירה בע"מ</td><td>נירוסטה 150</td><td></td></tr><tr><td>הומוגניזציה עלי</td><td>Ieda Trading Corp.</td><td>9993</td><td></td></tr><tr><td>מיקה</td><td>נישין EM ושות', בע"מ</td><td>LC23Z</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>BKA46472</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט</td><td>מכשירים מולקולריים תאגיד</td><td>ספקטרה מקס M3</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופית</td><td>מטסונאמי זכוכית תעשייתית, בע"מ</td><td></td><td></td>S011120</tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf Research&reg; בתוספת</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה</td><td>AS ONE Corporation</td><td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי מפלסטיק</td><td>AS ONE Corporation</td><td>1-7484-01</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת רנילה לוציפראז</td><td>תאגיד Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>רודמין B איזותיוציאנט</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות', LLC.</td><td></td><td></td>283924</tr><tr>מים<td>ללא RNase</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>נתרן קרבונט</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-01585</td><td></td></tr><tr><td>להב וידית כירורגיים</td><td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td><td>נירוסטה מס' 14 (להב), מס' 3L (ידית)</td><td></td></tr> <tr><td>מכסה קצה מזרק</td><td>מוסאשי הנדסה בע"מ</td><td>מאזן שקילה NC-3E</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Zeta Potentiometer</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>Zetasizer Nano-ZS</td><td></td></tr></tbody></table>

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי organellar בצמחים

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

היכולת להכניס חלבונים אקסוגניים ולבטא (או לווסת) גנים ספציפיים בצמחים מספקת כלי רב עוצמה למחקר בסיסי כמו גם ליישומים חדשים בתחום הביוטכנולוגיה של הצמח. לשיטות ברות קיימא הקיימות כיום להעברת חלבונים או גנים לתאי צמחים, כלומר אגרובקטריום והפצצת מיקרו-קליעים, יש חסרונות של תדירות טרנספורמציה נמוכה, טווח מארח מוגבל או עלות גבוהה של ציוד ומיקרו-נשאים. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה פשוטה ורב-תכליתית, המשתמשת בפפטידים שתוכננו באופן רציונלי כסוכני העברה למגוון מטענים מבוססי חומצות גרעין וחלבונים לצמחים. פפטידים נבחרים ככלים לפיתוח המערכת בשל יכולתם להתכלות, גודלם המופחת, תכונותיהם המגוונות והניתנות לכוונון וכן היכולת להשיג גישה תוך-תאית/אורגנית. מתוארים ההכנה, האפיון והיישום של ניסוחים מותאמים לכל סוג של מגוון רחב של מטענים שנמסרו (DNA פלסמיד, DNA או RNA דו-גדילי וחלבון). נדונים גם שלבים קריטיים בפרוטוקול, שינויים אפשריים ומגבלות קיימות של השיטה.

מערך מטעני חומצה וחלבון גרעין הוכנס בהצלחה לתוך צמחים שונים באמצעות פפטידים תוכננו וקטורי משלוח. אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין פפטידים קטיוני ומטענים-טעונים שלילי הביאו להיווצרות של מתחמי transfection כי יכול להיות שחדר ישירות לתוך בעלים הצמח באמצעות מזרק מחטים (איור 1). ניסוחים אופטימליים (נקבע באופן אמפירי במחקרים אלה 21,23-26) עבור transfection של בתאי צמח מפורטים בטבלה 1, כאשר כל סוג של מגוון רחב של מטענים נמסר (pDNA, dsDNA, dsRNA וחלבון) מיוצגת. בקטרים ​​הממוצעים של כל הניסוחים מבוססים פפטיד היו בטווח המשוער של 150 - 300 ננומטר. בהתבסס על ניתוח DLS, כל הניסוחים מוצגים polydispersities גודל נמוך יחסית, המעיד כי אגרגטים פפטיד המטען נוצרו יש חלוקה בגודל אחידה. המורפולוגיות שלמתחמי בין פפטיד pDNA (איור 2 א) או חלבון (תרשים 2B), על מיקה, הם צילמו על ידי AFM. מתחמי כדוריים הומוגנית נצפו הן שילובים פפטיד-pDNA פפטיד-חלבון, בהסכמה עם נתונים ממדידות DLS. מבחינת הפוטנציאל זטא של מתחמים (טבלה 1), pDNA- ומכלולים הנגזרות dsDNA היו חיובי שטח נטו שלילי בעוד מתחמים מבוססים dsRNA היה מטען משטח ליד ניטראלי. מתחמי פפטיד-חלבון, ומצד שני, היו בעלי מטען חשמלי חיובי. הנצילות של pDNA פפטיד ניסוחים-dsDNA פפטיד בתיווך transfection של thaliana א או נ benthamiana כמערכות צמח המודל הוערכו כמותית וכן איכותית. את assay ביטוי גנים RLuc הועסק כימות של רמות ביטוי גנים (טבלה 1), ולכן, עבור pDNA בניסוי זה אוdsDNA קידוד הגן RLuc חייב לשמש complexation עם פפטידים המוביל בהתאמה. שימוש (KH) 9 ניסוח -BP100 / pDNA, משלוח גרעיני במיקוד וביטוי של pDNA יכול להיות מושג, לאחר תקופת דגירה של 12 שעות, עם ערך מ&quot;ג RLU / מוערך של כ 1 × 10 5. למסירה במיקוד המיטוכונדריה וביטוי של pDNA, שילוב של פפטידים, Cytcox- (KH) 9 ו BP100, נדרש ליצירת מורכבות. עם תקופת הדגירה באותו אופטימיזציה של 12 שעות, עם זאת, ברמה הרבה יותר נמוכה של transfection (כ 1 × 10 3 RLU / מ&quot;ג) הושגה. בינתיים, תקופת דגירה דומה (12 שעות) ורמת ביטוי גנים (כ 1 × 10 3 RLU / מ&quot;ג) נדרשו / מוקלטת עבור מתחמים מבוססים dsDNA, אף התגבשו באמצעות (KH) 9 -BP100 פפטיד. הערכות איכותיות של ביטוי גנים בוצעו על ידי תצפית מיקרוסקופית ישירה של עלים שטופלה prepar מתחמיםed באמצעות pDNA או dsDNA קידוד גן כתב GFP. בתאים transfected עם מתחמים הלא ממוקד פפטיד-pDNA, מפוזר פלואורסצנטי ירוק להתכתב עם הביטוי של GFP נצפה בבירור ונמצא למקם ב (איור 3 א) cytosol. הבדלים ברורים דפוס לוקליזציה של הקרינה GFP ניכרו תאים הסתננו עם מתחמי pDNA-פפטיד במיקוד המיטוכונדריה. הנה, פלואורסצנטי ירוק punctate כי colocalize עם הכתם המיטוכונדריה היה גלוי, המאשר את הספציפיות של ביטוי גנים באופן בלעדי בתא המיטוכונדריה של תאים (איור 3). במקרה של ניסוחים-חלבון פפטיד, נטייה של מטען החלבון (ADH) על fluorophore (RHB) תאפשר להדמיה של החלבון נשא בתא התאי. בתוך תקופת דגירה קצרה של 6 שעות, ADH-RHB חלבון (כחול) נמצא שיחולקו לאורךcytosol ו vacuole של תאים הסתננו (איור 3 ג). בינתיים, מהיר ויעיל למטה בקרת גנים יכול להיות מושלם בצמחים שונים באמצעות ניסוחים פפטיד-dsRNA. בניסוי הראשון, עלה thaliana א הסתנן עם פפטיד-dsRNA קומפלקסים להשתיק את גן synthase chalcone (CHS) האחראי אנתוציאנין (פיגמנט האדום) ביוסינתזה בתנאי בצורת. ההבדל במראה של thaliana א עלים תחת נורמלי (האיור 3D, א) ותנאי בצורת (איור 3D, ב) ספק אמצעי קל להעריך CHS השתקה באמצעות ניסוח פפטיד-dsRNA אופטימיזציה (חץ 1 מציין באזור הסתנן). בניסוי השני, מתחמי פפטיד-dsRNA הסתננו לתוך העלים של thaliana א המהונדס מבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). הפחתה ניכרת ביטוי YFP ניתן היה לראות את התאים אפידרמיס 9 שעות pOST-transfection (איור 3E, F). האפקטיבי של הניסוח בביטוי גני ויסות למטה במערכת צמחים שונה (צפצפה, 12 שעות שלאחר transfection) גם אושר (האיור 3G, H). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> איור 1: פורמולציות מבוססים פפטיד עבור משלוח חומצות גרעין ומטעני חלבון לתוך חיים וצמחים. פפטידים המובילים שנועדו להכיל polycations מצומדות כדי חודר לתא או רצפי מעבר organellar. Polycations מאפשר מחייב ו / או התעבות של מטענים-טעונים שלילי כמו גם בריחה מתא endosomal הבא הפנמה לתאים. משלוח מטענים לתאים ובהמשך ל אברונים ספציפי מתווך על ידי רצפים חודרים לתא רצפי מעבר organellar, בהתאמה. מטענים שונים שיכולים להיות successfully נמסר לתוך הצמח כוללים חומצות גרעין כגון pDNA, dsDNA ו dsRNA, כמו גם חלבונים מודל כמו אלבומין בסרום שור (BSA), dehydrogenase אלכוהול (ADH) סיטרין (וריאנט של חלבון פלואורסצנטי צהוב). מולקולות ביו מסוגלים להקים מתחמי transfection עם conjugates פפטיד באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות, אשר מוכנסים עלי הצמח על ידי חדירת מזרק. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> איור 2: מורפולוגיות של פורמולציות המבוססות פפטיד. (א) AFM משרעת תמונה של (KH) 9 ניסוח -BP100 / pDNA ב N / P 0.5. (ב) תמונה גובה AFM של (BP100) 2 K 8 / ADH ניסוח בבית רטי טוחנתo 10. לשכפל באישור ממקורות שפורסמו 23,24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> איור 3: הערכה מיקרוסקופית של יעילות transfection באמצעות פורמולציות פפטיד מבוססי אופטימליים. (א) ביטוי GFP Cytosolic (ירוק), להבדיל בין autofluorescence הכלורופלסט (אדום), נצפה בתאי mesophyll הספוגיים של thaliana א עלים הסתנן עם (KH) 9 ניסוח -BP100 / pDNA (N / P 0.5; 12 שעות ). (ב) ביטוי של GFP (ירוק) זוהה במיטוכונדריה (אדום) בתאי האפידרמיס של עלים א thaliana הסתננו עם Cytcox- (KH) 9 / BP100 / ניסוח pDNA (N / P 0.5 לכל peptidדואר; 12 שעות). תמונות מוגדלות של המיטוכונדריה עם ביטוי של GFP מוצגים בלוח הימין הקיצוני. משלוח (C) של ADH-RHB (כחול) לתוך התאים mesophyll הספוגית של thaliana א עלים בתיווך (BP100) 2 K 8 ביחס טוחנת פפטיד / חלבון של 10, דמיינו 6 שעות-חדירת הפוסט. (ד) עלה א thaliana לפני (א) ואחרי (ב) טיפול (KH) 9 -BP100 / ניסוח dsRNA (יחס טוחן 2; 48 שעות), אשר הביא דיכוי המסלול ביוסינתזה אנתוציאנין. ניסוח דומה המכיל GFP5 dsRNA הסתנן לתוך עלה כפי בקרה שלילית (ג). חצי 1 ו -3 מצביעים באזור הסתנן בעוד חצים 2 ו -4 עולים לאזור שאינו הסתנן בתוך העלה. (ה) א thaliana משאיר לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו- (ו) את הקרינה YFP פחתה בעקבות חדירת עם<html> (קרן היסוד) 9 -BP100 / ניסוח dsRNA (יחס טוחנת 2; 9 שעות). (G) עליי צפצפה מהונדסת מבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו- (H) חדירה הבאים קרינת YFP פחתו עם (KH) 9 -BP100 / ניסוח dsRNA (יחס טוחן 2; 12 שעות). לשכפל באישור ממקורות שפורסמו 21,23,24,26. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> איור 4: וריאציה פפטיד-ל-דנ&quot;א (N / P) יחס והשפעתם על מאפייני biophysical של מכלולים. עם הגדלת פפטיד יחס DNA, ניסוחים מבוססים פפטיד להקטין בגודלו בשעת מעבר הערכים זיטה-פוטנציאל שלהם משלילי לחיובי./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> טבלה 1: אפיון והערכה של פורמולציות פפטיד המבוסס השונה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a> <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> טבלה 2: השוואה בין פפטיד מבוסס ואחרים טכנולוגיות משלוח DNA קיימים עבור צמחים שלמים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a>

לשיטות הקיימות לשינוי צמחים יש ישימות מוגבלת. הטכנולוגיה החדשנית שמקורה בפפטיד המוצעת כאן מבטיחה הן פשטות והן יעילות בהחדרת חלבון או גנים אקסוגניים לתאים התוך-תאיים הרצויים של צמחים שלמים.

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

המטרה הכוללת של שיטה זו המבוססת על פפטידים היא להוביל גנים וחלבונים דרך מחסומים תאיים ואורגנליים בצמחים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח באמצעות שינוי צמחים בעזרת תצמידי פפטידים שתוכננו באופן רציונלי, אשר מעבירים גנים וחלבונים שונים כדי לתווך את הביטוי של גנים ספציפיים. היתרון המיידי של טכניקה זו הוא שהיא עושה שימוש בהליך טרנספקציה פשוט של עלי צמחים בעזרת מזרק, המבוסס על פפטידים המסוגלים לחצות גבולות תאיים ואורגנליים.פיתחנו את שיטת התעתוק (טרנספורמציה) החדשנית, הפשוטה והיעילה הזו לצמחים מכיוון שהשיטות המקובלות הן יקרות, אינן ישימות לסוגי צמחים מסוימים, ואינן מסוגלות להכווין את עצמן לאורגנלות תוך-תאיות. ג'ו-אן צ'רץ' תדגים את ההליך יחד עם יוקו הורי, טכנאית מהמעבדה שלי. הכינו את פורמולציית ה-DNA של פלזמת הפפטיד כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.כאשר מוסיפים את הפפטיד ל-DNA של הפלזמה, יתגבש תמיסה עכורה. התערובת תהפוך לצלולה לאחר דילול במים אולטרה-טהורים לנפח הסופי המפורט בפרוטוקול הטקסט. העבירו 800 microliters מהתמיסה המדוללת לכובבית לצורך אנליזת פיזור אור דינמי (DLS).קבע את הקוטר ההידרודינמי ואת מדד הפולידיספרסיות של הקומפלקסים שנוצרו באמצעות zetananosizer. השתמש בלייזר הליום-ניאון של 633 nanometer בטמפרטורה של 25 degrees celsius עם זווית גילוי של פיזור אחורי של 173 degrees. לאחר מדידות הגודל, העבר את התמיסה לתא קפילרי מקופל למדידות פוטנציאל זטא בפרמטרים ברירת המחדל של קבוע הדיאלקטריות, מקדם השבירה והצמיגות של מים בטמפרטורה של 25 degrees celsius.כדי לבחון את התמיסה המורכבת באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי, יש להניח 10 µL על פני השטח החשופים שנוצרו לאחר שבירת לוח מיקה, ולהשאיר את המיקה להתייבש באוויר למשך לילה בכלי פטרי מפלסטיק מכוסה. יש לצלם תמונה של הקומפלקסים באוויר בטמפרטורה של 25 °C באמצעות קנטילבר סיליקון עם קבוע קפיץ של 1.3 N/m במצב tapping. השתמש בצמחי Arabidopsis thaliana בני שלושה שבועות שגודלו במחזור של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך, בטמפרטורה של 22 °C.בחרו לפחות שלושה עלים לטרנספקציה כדי לשמש כחוזרים (triplicate) לצורך כימות ביטוי הגנים. מלאו מזרק פלסטיק ללא מחט בנפח של 1 מיליליטר ב-100 µL של תמיסה מורכבת עבור טרנספקציה של עלה אחד. לאחר מכן, מקמו את קצה המזרק על פני השטח האבაქסליים (הצד התחתון) של העלה.הצמד את קצה המזרק בעדינות אל העלה, ולחץ על בוכנת המזרק באיטיות תוך הפעלת לחץ נגדי עם האצבע המורה של יד עוטה כפפת לטקס מהצד opposite. ניתן לזהות חדירה מוצלחת על ידי התפשטות של אזור ספוג במים בעלה. סמן את העלים שחלחלו אותם לצורך זיהוי קל.הדגרי את הצמח שהועבר אליו ה-DNA של פלסמיד הפפטיד למשך 12 שעות בתא גידול. כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה, ראשית חתוך את כל העלה שעבר טרנספקציה. עבור ניסויי טרנספקציה המשתמשים בווקטור דורש (reporter vector) של Renilla Luciferase, קבע את יעילות הטרנספקציה באופן כמותי באמצעות ערכה לבדיקת Renilla Luciferase.ראשית, העבירו כל עלה שגזור לתוך מבחנה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. הוסיפו 100 מיקרוליטר של 1X Lysis Buffer לכל מבחנה. באופן דומה, הכינו ליזאטים של עלי בקרה שאינם טרנספקטים בשלוש חזרות.טחנו את העלה באמצעות פסטל הומוגניזציה והדגירו את הליזאט שהתקבל ב-25 °C למשך שש עד 10 שעות. לאחר ההדגרה, סבבו את הליזאט בצנטריפוגה ב-12,470 ×g במיקרוצנטריפוגה למשך דקה אחת. העבירו 20 µL מהליזאט המזוך לבאר במיקרופלטה של 96 בארות.השתמשו בנפח הנותר לצורך כימות ריכוז החלבון הכולל באמצעות ערכה לבדיקת חלבון BCA בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר מכן, הוסיפו לבאר 100 µL של תסבסב (substrate) בריכוז 1x עבור בדיקת Renilla Luciferase וערבבו באמצעות פיפוט איטי. הניחו את המיקרופלט בקומינקה (reader) רב-מצב למיקרופלט והתחילו במדידה.עבור ניסויי טרנספקציה המשתמשים בווקטור דווח של חלבון פלואורסצנטי ירוק, יש לבחון את הפלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזרי קונפוקאלי. ראשית, יש לקצץ את שולי העלה השל כדי לסייע בהסרת כיסי אוויר. לאחר מכן, יש להוציא את הבוכנה ממזרק של 10 milileter ולהניח כל עלה או קטע עלה שגזרו בתוך המזרק.החזירו את הבוכנה ודחפו אותה בעדינות לתחתית המזרק מבלי למעוך את העלה. שאבו מים למזרק עד שיהיה מלא בערך עד מחציתו. כוון את המזרק כלפי מעלה ולחצו על הבוכנה כדי להוציא את האוויר מהמזרק דרך הפיה.לאחר מכן, כסו את קצה המזרק ומשכו את הבוכנה למטה באיטיות כדי להוציא אוויר מהעלה. חזרו על תהליך זה מספר פעמים עד שהעלה ייראה שקוף למחצה. לאחר מכן, כסו את פניו של סרט מיקרוסקופ בסרט דבק.בעזרת להב, חתכו בסרט דביק שטח ריבועי הגדול מספיק כדי להכיל את דגימת העלה, וקלפו את פיסת הסרט הריבועית באמצעות פינצטה כדי ליצור תא לדגימה. הסרט ישמש כמפריד בין הזכוכית למכסה. הניחו את העלה בתא כאשר הפנימי (abaxial) פונה כלפי מעלה, ומלאו את שאר שטח התא במים.אטמו את העלה בתוך התא באמצעות כיסוי זכוכית (cover slip) ואבטחו את קצות הכיסוי באמצעות סרט דבק. בחנו את דגימת העלה באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזרי קונפוקלי תחת עדשה של 40x או עדשת טבילה במים של 63x. ניתן להדמיא פלואורסצנציית GFP באורך גל עירור של 488 nanometers.הכנה אופטימלית של פורמולציית ה-DNA פלזמה פפטידית ביחס פפטיד-ל-DNA של 0.5 צריכה להיות בעלת קוטר ממוצע של כ-290 ננומטר ומדד פולידיספרסיות נמוך של כ-0.3, המעיד על התפלגות גודל אחידה. בנוסף, הקומפלקסים צריכים להפגין פוטנציאל זטא של כ-30 מיליוולט. תמונת מיקרוסקופ כוח אטומי מייצגת של קומפלקסי ה-DNA פלזמה פפטידית מוצגת כאן.נצפו קומפלקסים גלובולריים הומוגניים. באמצעות פורמולציית DNA של פלסמה עם פפטידים, ניתן להשיג הובלה למגוף הגרעין וביטוי של DNA של פלסמה ב-Arabidopsis thaliana, עם ערך מוערך של Renilla Luciferase למיליגרם של כ-100,000. תצפית מיקרוסקופית בוצעה בעלים שטופלו בקומפלקסים שהוכנו באמצעות DNA של פלסמה, המקודד ל-GFP reporter, כדי להעריך את ביטוי הגן.התמונות גילו כי בתאים שהוחדרו קומפלקסים של DNA פלסמי עם פפטידים לא מכוונים, נצפתה בבירור פלורסצנציה ירוקה דיפוזית התואמת לביטוי GFP, ונמצא כי היא ממוקמת בציטזול. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביוטכנולוגיה של צמחים להחדרה של מטענים שונים מבוססי חלבונים וחומצות גרעין לצמחים חיים. לאחר צפייה בסרטון זה וקריאת הפרוטוקול הכתוב, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ההכנה, האפיון והיישום של פורמולציות אופטימליות שונות עבור כל סוג של מטען, הכוללות DNA פלסמי, DNA או RNA דו-גלגלי וחלבון.

peptide-derived-method-to-transport-genes-proteins-across-cellular

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

הסחר בין Macromolecular בתאי צמח ניתן להעריך על ידי transiently לבטא חלבון fluorescently-tagged עניין וניתוח ההפצה התוך ואת אינטר שלה על ידי מיקרוסקופיה confocal.

תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic

צמחים מציעים מערכת חדשנית לייצור של חלבוני תרופות בהיקף מסחרי, כי הוא יותר ניתן להרחבה, יעיל וחסכונית ובטוחה יותר מפרדיגמות ביטוי הנוכחיות. במחקר זה, אנו מדווחים גישה פשוטה ונוחה, אך ניתן להרחבה להציג את היעד של גן...

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

עבודה זו מתארת ​​את שיטה חדשה למיקוד סלקטיבי אברונים subcellular בצמחים, assayed באמצעות BioRad ג'ין האקדח.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

תחומים אבץ אצבע הם מיסוד תא חדיר ומסוגל תיווך משלוח חלבון למגוון רחב של סוגי יונקים תא. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט ליישום טכנולוגית אבץ-אצבע למסירת חלבון תאית מוצג.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הכנת כמויות גדולות של סויה protoplasts ללמוד מנגנוני איתות ולניהולו מורכבים בתאים חיים.

שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית

פיתחנו שיטה לביטוי בשיתוף מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים כדי להתגבר על הקשיים של שיטות קונבנציונליות. זה לוקח את היתרון שבשימוש של פלסמיד ביטוי יחיד המכיל מספר חלבון פונקציונלית עצמאית המבטאת קלטות כדי להשיג חלבון ביטוי משותף.

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

אנו מתארים שיטה לאפיון של מובילי הממברנה המונעת על ידי פרוטון בתכשירים ושלפוחית ממברנה המיוצרים על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli והליזה של תאים באמצעות עיתונות צרפתית.

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

כתב יד זה מתאר מכשיר עירוי צמחי ישיר חדשני לבדיקת יעילותן של מולקולות כנגד החיידק (Candidatus Liberibacter asiaticus) או וקטור החרקים שלו (Diaphorina citri, Kuwayama) הקשורים בשילוב למחלת ההדרים Huanglongbing.

מכשיר עירוי ישיר להעברת מולקולות בצמחים

פרוטוקול זה מתאר את הבחירה של סמנים פלסמודסמליים אופטימליים עבור ניתוחים מבוססי מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיקוד חלבונים לפלסמודסמאטה במהלך אינטראקציות וירוס-פלסמודסמאטה או הובלה פלסמודסמלית.

ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיון חלבונים לפלסמודסמאטה בניקוטיאנה בנטמיאנה

למד שיטת פפטידים חדשנית להעברת גנים וחלבונים לתאי צמחים דרך מחסומים תאיים ואברוניים. השיטה מציעה גישה פשוטה ויעילה להנדסה גנטית בצמחים Arabidopsis thaliana.

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

גלה סרטונים נוספים