Name: תרבות של Murine העוברי metatarsals: מודל פיסיולוגי של Endochondral התאבנות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: למדו את שיטת התרבות של metatarsals עובריים מעכברים לחקר התאבנות אנדוכונדרלית וצמיחת עצם. מודל זה שומר על אינטראקציות תאיות פיזיולוגיות לתוצאות מדויקות יותר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה למועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BBSRC) על מימון DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (מימון מענק התוכנית האסטרטגית של המכון BB/J004316/1). אנו מודים גם ל-Arthritis Research UK על המימון ל-KAS (20413). אנו מודים לגברת איליין סירייט על עזרתה בניסויים המפורטים, לד"ר ניל מקנזי על עזרתו בטכניקות הלנטי-ויראליות, ולמר דארן סמית ומר אלכס רוברטסון (מכון רוזלין BRF) על עזרתם במחקרים בבעלי חיים.

נהלים הקשורים בנושאי בעלי חיים בוצעו בהתאם בעלי החיים בבריטניה (הליכים מדעיים) Act 1986 בעלי החיים היו מתוחזקים בהתאם משרד הפנים פרסמו קוד עיסוק עבור השיכון, הטיפול של בעלי החיים Bred, מסופק או משומש למטרות מדעיות. הערה: ניסויים שבוצעו באמצעות עכברי-בר C57Bl / 6J מבוססים היטב ותיאר להלן. Metatarsals העוברי מן הזנים שונים עכבר יכול להיות מתורבת דומה במבחנה, אם כי שיעורי הצמיחה מינרליזציה שלהם עשויים להיות שונים לאלה מפורטים כאן. תנאי Dissection 1. הכנת מכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כל הכנת התקשורת, וניתוחי רקמות תרבות העבודה במנדף זרימה למינרית על מנת להבטיח את סטריליות של תקשורת יסודות עובריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תקשורת בתרבות לנתיחה כדי לאזן במשך לפחות שעה 1 באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר לנתיחהמספריים, דומון # 5 דומון # 4 פינצטה לצד זוג מספריים מיקרו איכותי מאוד Vannas (ישר 8 ס&quot;מ, 3 מ&quot;מ להבים) על ידי מעוקר. לאחר מעוקר, לטבול את הציוד לנתיחה באתנול 70% לפני השימוש. </li></ol> 2. הכנת Dissection ותרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל α-מינימום מדיה Essential (ללא נוקלאוזידים αMEM) ב בופר פוספט (PBS) (1:13) ו resuspend אלבומין בסרום שור (BSA) ב- 2 מ&quot;ג / מ &#39;l לפני מסנן עיקור באמצעות מזרק בקוטר 0.22 מיקרומטר, 33 מ&quot;מ לְסַנֵן. הערה: בינוני Dissection יכול להתבצע, מסנן מעוקרים מאוחסנים aliquots ב -20 ° C ללא הגבלת זמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> metatarsals העוברי תרבות 300 μl של מדיום התרבות (בכל טוב של צלחת תרבות 24 גם). הכן את המדיום התרבות ידי הוספת 0.2% w / v BSA; 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​L-ASCOפוספט וחומצה rbic; 1 מ&quot;מ β-glycerophosphate (βGP; אופציונלי - ראה סעיף תוצאות); 0.05 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​גנטמיצין ו 1.25 מיקרוגרם Amphotericin B כדי αMEM ולסנן לעקר דרך פילטר מזרק בקוטר 0.22 מיקרומטר, 33 מ&quot;מ. </li></ol></li></ol> 3. Murine עובריים המסרק Dissection ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לברור את העכבר בהריון, מחסה עוברים 15 יום בן, על ידי נקע בצוואר הרחם בהתאם להנחיות המשרד הביתי בבריטניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרקדן חיה ולחטא העור על ידי ריסוס עם אתנול 70%. מספריים לנתיחה באמצעות לעשות חתך גדול קו האמצע חודר הוא העור הצפק לחשוף את חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר שתי קרני הרחם של החיה באזור הגבי של חלל הגוף. הסר את קרן הרחם על ידי ראשית חלץ כל רחם מן mesometrium ידי חתכים זהירים עם מספריים לנתיחה ולבסוף חיתוך קרנות הרחם חינם בבסיסם. placדואר קרני הרחם לתוך מדיום לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרד בין העובר על ידי חיתוך בין אתרי השתלה לאורך קרן הרחם ולהסיר את העוברים מן הצ&#39;קים האישיים שלהם באמצעות מלקחיים. עובר דילול על ידי עריפת ראש בהתאם להנחיות משרד ביתי בבריטניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חיטוי של העור על ידי ריסוס עם 70 אתנול%, השתמש Vannas מספריים מיקרו להסיר את הגפיים האחוריות מן העוברים על ידי חריטה סביב הירך הפרוקסימלי. הדבר מבטיח כמה שיותר הגפיים האחוריים ככל האפשר מוסר. מניח את הגפיים האחוריים לתוך צלחת פטרי השקועה במדיום לנתיחה לפני לנתיחת כף רגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, מתחיל להסיר את העור שמסביב למרגלות העובריות, על ידי צובט ומושך אותו באמצעות # 5 פינצטה בעוד מחזיק את הגפיים האחוריים יציב באמצעות # 4 פינצטה. זו מבוצעת בצורה היעילה ביותר על ידי לתפוס את העור סביב הרמה של הטיביה מושך לכיוון הפלנגות. השימוש מספרי בשלב זה לחתוך אתמאוד דק העור אינו נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחזיק את tarsals של כף הרגל העוברית עם פינצטה # 4 ולהסיר את metatarsals הראשון והחמישי ידי צובט המגודר ליד tarsals באמצעות # 5 פינצטה וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם רגל שנערך באותה תנוחה, השתמש # 5 פינצטה לשבש את רקמות החיבור בין שלושת הפלנגות ו metatarsals הנותרים. הכנס את קצה פינצטה 5 # במפרק בין הפלנגות ו metatarsals להסיר את הפלנגות מן metatarsals. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, השתמש # 5 פינצטה לשבש את רקמות החיבור בין tarsals ו metatarsals. שוב הניח את קצה פינצטה 5 # במרחב המשותף בין tarsals ו metatarsals בעדינות לשחרר את metatarsals מן tarsals. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להרים את metatarsals בחינם עכשיו עם # 4 פינצטה מקום במדיום לנתיחה טרי. הערה: לנתיחה זהירות אמורה לספק 6 metatarsals מעובר אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשכל metatarsals נדרש כבר גזור, carefully מקום metatarsals בנפרד לתוך 24 גם צלחות מחומם מראש המכיל 300 μl של התקשורת והתרבות. Metatarsals התרבות ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור 5% לתקופה של עד 14 ימים. הערה: אין לשנות את התקשורת של תרבויות E15 לפחות עד יום 5 של תרבות שכן הדבר עלול לפגוע ביכולת מינרליזציה שלהם 26. הסיבות לכך אינן ברורות אך הצמיחה לינארית מינרליזציה מטריקס עלולה להיות תלויות גירוי על ידי גורמי גדילה שוחררו מן metatarsals. </li></ol> ניתוח מניפולציה 4. של תרבויות כף הרגל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום לנתיחה (יום 0) לבצע מדידות אורך ראשוניות באמצעות מיקרוסקופ עם תוכנת ניתוח מצלמה דיגיטלית מצ&quot;ב תמונה. מדוד את האורך של אזור מינרליזציה המרכזי כאשר הוא מופיע אחרי כמה ימים של תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעת לעת, כנדרש, לבצע מדידות נוספות (בדרך כלל כל 2 nd יום) עד היום האחרון של תרבות ובנקודה מעצמות etatarsal מעובדות תלוי תוצאות הנדרשות (דנו בהקדמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסף הבינוני של תרבויות איבר כף רגל עם גורמי אקסוגניים שונים כגון גורמי גדילה, הורמוני סוכנים תרופתיים מיום 0 תרבות 22,24. בכל המחקרים מסוג זה, לשלוט metatarsals המטופל נדרש. הערה: אם כי מומלץ כי ההעצמות המלאות הן גֶמֶד המקבילה מהרגל הנגדית, לא חלה שום הבדלים בצמיחה ליניארי או פוטנציאל מינרליזציה של nd התרבותי E15 2, 3 rd ו -4 metatarsals ה (ראו להלן, איור 2) . </li></ol>

<ol><li>Farquharson, C., Staines, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skeleton%3A+no+bones+about+it%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The skeleton: no bones about it.</a> J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).</li>
<li>Berendsen, A. D., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+development%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Bone development.</a> Bone. 80, 14-18 (2015).</li>
<li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+the+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423, 332-336 (2003).</li>
<li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+bone+development+and+extracellular+matrix+protein+genes+by+RUNX2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2.</a> Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).</li>
<li>de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+in+the+pathways+of+cartilage+and+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).</li>
<li>Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+BK+%22Bones+and+Cartilage%3A+Developmental+and+Evolutionary+Skeletal+Biology%22">Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology</a>. , Elsevier Academic Press. (2005).</li>
<li>Farquharson, C., Jefferies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+and+longitudinal+bone+growth%3A+The+development+of+tibial+dyschondroplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Poult.+Sci%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia.</a> Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).</li>
<li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495, 375-378 (2013).</li>
<li>Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+vesicles%3A+structure%2C+composition%2C+formation+and+function+in+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification.</a> Front. Biosci. 16, 2812(2011).</li>
<li>Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+involvement+of+PHOSPHO1+in+matrix+vesicle-mediated+skeletal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal.</a> J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).</li>
<li>Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+matrix+vesicles+in+skeletal+and+soft+tissue+mineralisation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation.</a> Bone. 87, 147-158 (2016).</li>
<li>Brighton, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Growth+Plate%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Growth Plate.</a> Clin. Orthop. , 22-32 (1978).</li>
<li>Shim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pubertal+growth+and+epiphyseal+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+pediatric+endocrinology+%26+metabolism%22%5BJournal%5D)">Pubertal growth and epiphyseal fusion.</a> Annals of pediatric endocrinology & metabolism. 20, 8-12 (2015).</li>
<li>Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+to+bone+transitions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cartilage to bone transitions in health and disease.</a> J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).</li>
<li>Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Chondrocyte+Performance+in+Growth-Plate+Cartilage+During+Longitudinal+Bone-Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery-American%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth.</a> Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).</li>
<li>Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+Relationship+Between+The+Volume+Of+Hypertrophic+Chondrocytes+And+The+Rate+Of+Longitudinal+Bone-Growth+In+Growth+Plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates.</a> J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).</li>
<li>Thesingh, C. W., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mesenchyme+in+embryonic+long+bones+as+early+deposition+site+for+osteoclast+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells.</a> Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).</li>
<li>Scheven, B. A., Hamilton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+bone+growth+in+vitro%3A+effects+of+insulin-like+growth+factor+I+and+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+endocrinologica%22%5BJournal%5D)">Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone.</a> Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).</li>
<li>Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogenesis+of+IGF+regulation+of+longitudinal+bone+growth+in+rat+metatarsal+rudiments+cultured+in+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+physiology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium.</a> Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).</li>
<li>Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+cartilage+and+bone+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Dev%22%5BJournal%5D)">Methods to study cartilage and bone development.</a> Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).</li>
<li>Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-I+augments+chondrocyte+hypertrophy+and+reverses+glucocorticoid-mediated+growth+retardation+in+fetal+mice+metatarsal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures.</a> Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).</li>
<li>Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+plate+sparing+effects+of+the+selective+glucocorticoid+receptor+modulator%2C+AL-438%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).</li>
<li>MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+restricted+potential+for+recovery+of+growth+plate+chondrogenesis+and+longitudinal+bone+growth+following+exposure+to+pro-inflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines.</a> J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).</li>
<li>Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch-up+growth+after+dexamethasone+withdrawal+occurs+in+cultured+postnatal+rat+metatarsal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones.</a> J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).</li>
<li>Haaijman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+terminal+chondrocyte+differentiation+by+bone+morphogenetic+protein+7+%28OP-1%29+in+vitro+depends+on+the+periarticular+region+but+is+independent+of+parathyroid+hormone-related+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide.</a> Bone. 25, 397-404 (1999).</li>
<li>Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OP-1+%28BMP-7%29+affects+mRNA+expression+of+type+1%2C+II%2C+X+collagen%2C+and+matrix+Gla+protein+in+ossifying+long+bones+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro.</a> J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).</li>
<li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEPE+is+a+novel+regulator+of+growth+plate+cartilage+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization.</a> Bone. 51, 418-430 (2012).</li>
<li>Kaufman, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+M+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , 3, Academic Press. (1992).</li>
<li>Boskey, A. L., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture+Systems+for+Studies+of+Bone+and+Tooth+Mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization.</a> Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).</li>
<li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Miner%22%5BJournal%5D)">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined.</a> Bone Miner. 12, 141-155 (1991).</li>
<li>Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+calcification+of+growth+plate+cartilage+as+a+result+of+compressive+force+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro.</a> Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).</li>
<li>Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+osteoclastic+bone-resorption+by+mechanical+stimulation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro.</a> Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).</li>
<li>Dobie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+linear+bone+growth+by+GH+in+the+absence+of+SOCS2+is+independent+of+IGF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1.</a> J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).</li>
<li>Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+1+receptor+%28IGF1R%29+signaling+regulates+osterix+expression+and+cartilage+matrix+mineralization+during+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification.</a> Bone. 83, 48-57 (2016).</li>
<li>Huesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+co-operativity+of+tissue-nonspecific+alkaline+phosphatase+%28TNAP%29+and+PHOSPHO1+during+initiation+of+skeletal+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).</li>
<li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endochondral+Growth+Defect+and+Deployment+of+Transient+Chondrocyte+Behaviors+Underlie+Osteoarthritis+Onset+in+a+Natural+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model.</a> Arthritis & Rheumatology. 68, 880-891 (2016).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fetal+mouse+metatarsal+bone+explant+as+a+model+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis.</a> Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).</li>
<li>Libby, P., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C%2C+collagen%2C+and+cracks+in+the+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque.</a> Circulation. 105, 1396-1398 (2002).</li>
<li>Alvarez, J., Serra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+redundant+roles+of+Smad3+in+TGF-beta-mediated+regulation+of+long+bone+development+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture.</a> Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).</li>
<li>Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOCS2+is+the+critical+regulator+of+GH+action+in+murine+growth+plate+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תרבות metatarsals בעכברים העוברי מספקת מודל פיסיולוגי ביותר של צמיחת endochondral מינרליזציה. מחקרים מוקדמים אימתו כי metatarsals עכבר E15 לעבור דפוס רגיל של צמיחה והבחנת שלד. הסחוס (chondrocytes) ועצמות (אוסטאובלסטים ו osteoclasts) תאים ומטריצות collagenous שלהם הם נבדלים מאלו שנצפו vivo. עם זאת, ישנן מספר מגבלות מוכרות של דגם זה. המהירות של בידול osteoclast נפגעת כמו גם צמיחת עצם (אבל לא סחוס בידול). צמיחת עצם היא כ 50% לאט יותר מאשר לזה שנצפה vivo ועלולה להיות כתוצאה מליקויי גורמים מערכתיים המשפיעים על הייצור של גורמים מקומיים (למשל, IGF-1, BMPs, וכו &#39;) 31. כמו כן, הוא מוכר היטב כי העצם רגיש לסביבה המכאנית שלה וזה גם המקרה עבור metatarsals התרבותי, אשר מגיב גhanges ב 32,33 העמסה מכנית. לכן, במצבים טעונים, כמתואר בפרוטוקול זה, מינרליזציה ספיגת מינרלים עלולים להיות בסכנה. עם זאת, מודל כף הרגל מציע את היכולת למדוד ישירות צמיחת עצם ליניארי הדבר שאינו אפשרי באמצעות 2D and 3D במערכות תרבות במבחנה. סיפקנו תיאור מקיף של פרוטוקול מעורב לנתיחה והתרבות של metatarsals murine E15 ואכן, בפעם הראשונה, לאשר את תוקפו של איגום 2 nd, 3 rd ו 4 th metatarsals לניסויים. Metatarsals מ E17 / E18 משמש בדרך כלל כדי לחקור את המנגנונים של צמיחת עצם בשל הפוטנציאל יוצא הדופן שלהם לגדול vivo לשעבר לתקופות זמן ארוכות (כלומר מעבר 14 ימים בתרבות). הם מודל ומבוסס לחקור את התפקידים של גורמי גדילה על צמיחת עצם אורך עוברית.בנוסף, לנתיחה וההתרבות של metatarsals לאחר הלידה היא מועסק בדרך כלל כדי להתוות את המנגנונים סביב צמיחת עצם לאחר לידה כפי שהיא מובנת כי צמיחת עצם לאחר לידה וצמיחת עצם עוברית מוסדרות באופן שונה 21. צמיחת העצם שנצפתה metatarsals לאחר הלידה התרבותי היא אולם פחות משמעותי מזו שנצפתה יסודות עובריים 25,34, הגבלת הפוטנציאל שלהם במחקרים לטווח ארוכים הדגשת ההשפעה מערכתית יותר על צמיחת עצם בשלב לאחר לידה זה. ואכן, 3 metatarsals לאחר הלידה יממה מעכברים הם בדרך כלל השלב האחרון, שניתן להשתמש בהם כדי להשיג 34 הצמיחה למדידה. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו הבידוד של עצמות כף רגל עובריות E15. העדר מינרלי hydroxyapaptite בעצמות כף רגל E15 אומר שהם מספקים מודל תחרות לחקור לא רק את המנגנונים סביב צמיחת עצם אורכת, אלא גם הייזוםשל מינרליזציה השלד. המטריצה mineralized של אזור הכונדרוציטים היפרטרופית מסוף מספק פיגום לפלישה אוסטאובלסטים להניח את עצם ספציפי מטריקס (דמוי עצם) המהווה מכן mineralized, וכפי מינרליזציה כגון הראשוני הזה הוא חיוני היווצרות העצם מוצלח ופונקציונלי 35. ואכן מספר הדיווחים האחרונים ניצול metatarsals E15 אשר היכולת הייחודית שלהם לחקירה של 28,36,37 תהליך מינרליזציה. בנוסף, חוקרים תארו את שימוש metatarsals E15 כמודל של אנגיוגנזה 38, המדגישים את הפוטנציאל של metatarsals העוברי כמודל מחוץ הגדרת צמיחת העצם / מינרליזציה. הפרוטוקול אנו מתארים דורש ציוד מעבדה רגיל בלבד כולל ברדס זרימה למינרית, מיקרוסקופ לנתח לביצוע הנתיחה, ו CO 2 באינקובטור לתרבות של יסודות ניכרים. יתר על כן, מבוי סתום מאוד בסיסיture בינוני המכיל αMEM, BSA, אנטיביוטיקה, antimycotics וחומצה L-אסקורבית (שיתוף גורם בסינתזה של hydroxyproline ו hydroxylysine, שתי חומצות האמינו החיוניות לייצור קולגן 39) ימנע את השימוש של תוספי מוגדר, כגון סרה חיה . באופן מסורתי, חוקרים הוסיפו βGP למדיה נהג metatarsals התרבות העוברי אבל כפי שמתגלה בתוצאות שלנו, שימוש מקור פוספט נוסף אינו נדרש עבור מינרליזציה מוצלח במערכת התרבות הזאת. זהו ממצא חשוב המרדף שלנו להבנת המנגנונים שבבסיס מינרליזציה ECM. Metatarsals בעבר נדבקו adenoviruses ובתוכה טופסי דומיננטי שלילי של Smad2 לחקור את התפקיד של הפיכת β גורם הגדילה בוויסות התפתחות העצם ארוך 40. כאן אנו חושפים גם את transfection המוצלח של עצמות כף רגל E15 wild-type עם חלקיקי נגיף ה- GFP, המציין tכובע טכניקות lentiviral שאפשר לאמץ בקלות לתמרן ביטוי גנים בתרבויות כף הרגל. באופן דומה, מערכת התרבות איבר כף הרגל היא מודל מצוין בו כדי להשוות את הצמיחה של העצמות מעכברים שינו גנטי כדי להבין טוב יותר את תפקידו של גן מסוים בתהליך צמיחת עצם. המחקרים הקודמים שלנו נצלו את מערכת התרבות איבר כף רגל כדי לקבוע את התפקיד של מדכא של ציטוקינים איתות-2 (SOCS2) ב צמיחת עצם endochondral. שימוש עצמות המסרק מעכברים שחסר לו SOCS2, הראינו הורמון גדילה כי הוא מסוגל לדמות עצמאית הצמיחה האורך שלהם של אינסולין כמו גורם גדילה (IGF-1), שלא כמו עצמות כף הרגל wild-type אשר אינם מגיבים לטיפול בהורמון גדילה 34, 41. זה מדגיש את המידה שבה תרבויות כף רגל ניתן להשפיע כדי לבחון את ההשפעות של גנים שונים ו / או גורמים חיצוניים על צמיחת עצם endochondral. לסיכום, יש לנו detaiהוביל שיטה להפקה והתרבות המוצלחת של עצמות כף רגל עובריות אשר ניתן מניפולציות ובדק באמצעות מגוון של ניתוחים. מודל vivo לשעבר זו שומר תאי תאים ואינטראקציות התא-מטריקס, וכן מכיל chondrocytes בשלבים שונים של chondrogenesis, ולכן מתן מודל פיסיולוגי יותר תאים בשכבה או תרבות 3D. תרבויות איבר כף הרגל ולכן מודל ייחודי לבדיקת המנגנונים המולקולריים האחראים התאבנות endochondral, והם חיוניים כדי לקדם את ההבנה שלנו של שני בפיזיולוגיה העצם והפתופיזיולוגיה

השלד הוא איבר מורכב, דינמי ומורכב מאוד כי יש מגוון של פונקציות הפורשות מן התנועה, הומאוסטזיס יון. מורכב העצם והסחוס, השלד מורכב של אוכלוסיות תאים מובחנות מבחינה תפקודית אשר פועלות כדי לשמור על זה מבני, ביוכימיים מכאני שלמות 1. אחד התפקידים העיקריים של השלד הוא התפקיד בהתפתחות וצמיחה שלה. תהליכים אלה דורשים התזמור של אוכלוסיות תאיות רבות אשר מוסדרות באמצעות האנדוקרינית דוקי בקרה גנטית. למעט עצם השכמה למשל עצמות שטוחות, הגולגולת ועצם החזה, השלד היונק נוצר באמצעות התהליך המכונה התאבנות endochondral. תהליך זה, מוסדר, הן מולקולרי מרחבית, מתחיל עם ההתעבות של תאי mesenchymal נגזרו בעיקר מן mesoderm 2. בהשפעה של SOX9 גורם שעתוק, תאי הדואר פנים של condensations להתמיין chondrocytes, להביע ומפריש מטריקס ספציפיים סחוס (ECM) רכיבים כגון קולגן סוג II ו- aggrecan. תאים בשולים של העיבוי, לבטא סוג אני קולגן ויוצר את perichondrium, המגדיר את העצם 3 הפוטנציאלי. מאוחר יותר, osteoprogenitors של perichondrium להתמיין אוסטאובלסטים, בבימויו של הביטוי של גורמי שעתוק, Runx2 ו osterix 4. זה מוביל דומיננטי של אוסטאובלסטים ושכבה זה שמם של קרום העצם המהווה צווארון גרמי mineralized סביב אמצע הקטע של העצם. חדירה של כלי דם של קרום העצם והפלישה של פיגום הסחוסים מתרחשת מביאה עימה, haematopoetically שמקורם בתאי resorbing עצם, osteoclasts, אשר נספגים שוב ומצע שרידי הכונדרוציטים והרבה מטריקס סחוסי 5. החללים נוצרו מאוישים ע&quot;י osteoprogenitors והוליד את ההתאבנות העיקריתמרכז אשר בהדרגה תופס את הליבה של diaphysis ומתמזג עם periosteum. תאים אחרים להצמיח במח העצם. בסביבות הלידה, כלי דם osteoprogenitors לחדור מטריקס עשיר סחוס משני צדי (epiphysis) של diaphysis פיתוח כדי ליצור את מרכז התאבנות משנית. ממוקם בין epiphysis ו diaphysis בשני קצותיו של העצמות הארוכות היא להקה של סחוס - צלחת צמיחת epiphyseal - האחראית על תיאום גידול ליניארי של כל העצמות הארוכות 6. Chondrocytes בתוך צלחת הצמיחה בתחילה להתרבות ובהמשך להתקדם דרך אזורים ברורים מורפולוגית, מתואמים על ידי ביטוי רציף של גורמי שעתוק וצמיחה. שיאו של רצף זה של אירועים הוא היציאה ממעגל התא היפרטרופיה של כונדרוציטים במרכז מבשר סחוס זה. chondrocytes Hypertrophic בתוקף להביע קולגן סוג X ו- מטלו מטריקס-13 (MMP13) והגדלת הנפח הניכרת שלהם בכיוון של צמיחה אורכת מספקים את התרומה הגדולה ביותר לצמיחת עצם ביונקי 7,8. יתר על כן, chondrocytes היפרטרופית mineralize ECM הסובבת אותם באמצעות שחרור של שלפוחית ​​מטריקס, מבנים מתוחם קרום מתמחה לייצור סידן פוספט אמורפי באמצעות הכללתם של phosphatases (רקמת הלא ספציפית phosphatase אלקליין (TNAP) ו PHOSPHO1) וחלבונים תקשור סידן (annexins ) 9-11. סחוס מסויד זה הוא פלש ידי כלי דם מהמח הבסיסי וכתוצאה מכך גיוס osteoclast ואת ספיגת מטריקס. זה ואחריו הגירה אוסטאובלסטים ויישור אל פני השטח של שרידי סחוס המסוידים שבו הם שכבו שכבה דמוית העצם שהוא mineralized במהירות. העצם הארוג של spongiosa העיקרי הוא ששופץ לעצם שבשבת של spongiosa משני 12. תוצאות היתוך epiphyseal בהפסקת התאבנות endochondral 13. התאבנות Endochondral נמצאת תחת רגולציה הדוקה על ידי הורמונים האנדוקרינית paracrine רבים גורמי גדילה כדי למנוע התפתחות מופרעת ו / או צמיחת עצם אורך 14. הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים ותאיים שבבסיס התהליכים האלה לכן חובה במרדף שלנו של התקדמות קלינית כלפי רווחת אדם. מחקרים קודמים המצביעים על הדמיון והשוני בין צלחות הצמיחה בגילאים שונים, במקומות ומינים שיפרו במידה רבה את הבנתנו של מנגנונים פיזיולוגיים שמסביב הדינמיקה צלחת צמיחה 15,16. עם זאת, המחקר של כונדרוציטים מבודדים קשה, כמו הסרת chondrocytes מסביבתם יכולה להוביל dedifferentiation, מלווה אובדן הביטוי של סמני מפתח כגון Col2a1 17. תרבות explant העכבר המסרק איבר, pioneered ידי פרופ &#39;אליזבת בורגר ועמיתיו בהולנד, הוא מודל פיסיולוגי לשעבר מאוד vivo ללימוד צמיחת התאבנות ועצמות endochondral כמו קצב הצמיחה של העצמות בתרבות לחקות כי ראה in vivo 18. באופן ייחודי, תרבות איבר כף הרגל מאפשרת בחינה של כונדרוציטים בשלבים שונים של chondrogenesis ושומרת תאי תאים ואינטראקציות תא-מטריצה, ולכן מתן תנאים קרובים למצב vivo ב מ תאים בתרבית 19-21. יתר על כן, מודל זה מאפשר לבדיקה ישירה של צמיחת עצם ליניארי אשר אינה אפשרית בתרבויות הכונדרוציטים עיקריות. זה גם מאפשר הפרדת גורמים מערכתיים ומקומיים ולכן מתיר הניתוח הפרטני של ההשפעות המקומיות על צלחת הצמיחה. תרבות metatarsals מאפשרת לחקירת פרמטרים רבים. מדידות יומיות של אורך הכולל ושל אזורי mineralized שלניתן לבצע את היסודות עם מיקרוסקופ לעומת שלב סטנדרטי תוכנת ניתוח תמונה. היסטולוגית, כלאה באתר והכתים immunohistological עשויה להתבצע בקלות על סעיפי כף רגל, מה שמאפשר את הרזולוציה המרחבית של שני הגופים האלה תאיים ומולקולריים, יתרון גדול על פני שיטות תרבית תאים מסורתיות. הגישה immunohistochemical כולל איתור וכימות של 5-bromo-2&#39;-deoxyuridine (BrdU) ספיגת ידי מתרבים chondrocytes 22. בנוסף, עיבוד נוסף של רקמות כף רגל ניתן לבצע כדי לאפשר ניתוח במורד זרם של ביטוי mRNA (RT-qPCR), חלבון וניתוח איתות תאי (מערבי סופג) או רכב שומנים (ספקטרומטריית מסה). רוב המחקרים שפורסמו עד כה להשתמש metatarsals עובריים בתרבית ולא metatarsals מחיות שלאחר הלידה. בעוד שני הדגמים ניתן אינפורמטיבי, חקר עצמות עובריות יש מספר יתרונות: הם גדלים מהר יותר והוא יכול להיות exploited ללמוד בייזום התקדמות של 23-25 תהליך מינרליזציה. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את לנתיחה הסבוכה של metatarsals העוברי מן הגפיים האחוריים של יום עוברי 15 (E15) עובר Murine. יתר על כן, את הצמיחה ואת מינרליזציה של metatarsals מובחנת מבחינה אנטומית מוצג.

<table><tbody><tr><td>מספריים לדיסקציה</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>עיקור חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>Dumont #5 פינצטה</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>עיקור חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>Dumont #4 פינצטה</td><td>World Precision Instruments</td><td>500339</td><td>עיקור חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>SuperFine Vannas מספריים</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td>501778</tr><tr><td>אתנול אבסולוטי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>E/0650DF/17</td><td>מדולל ל-70% v/v ב-dH2O</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM ללא נוקלאוזידים</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>22561021</tr><tr>מסנני מזרק <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A3059</td><td></td><td>בסרום בקר</td></tr><tr><td>(0.22 &mu; m) קוטר 33 מ"מ</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>פוספוכולין כלוריד מלח סידן טטרהידרט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0378</td><td>הוסף ישירות למדיה לפני הניסוי</td></tr><tr><td>חומצה L-אסקורבית-2-פוספט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>איפור מלאי ב-5 מ"ג/מ"ל ו-aliquot ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C5080</td><td>איפור מלאי ב-150 מ"מ ו-aliquot ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>&beta;-גליצרופוספט דיסודיום מלח הידרט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G9422</td><td>איפור מלאי ב-1 מ"מ ו-aliquot ב-20&deg; C</td></tr><tr><td>ג'נטמיצין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>15710049</tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15290018</tr><tr><td>צלחות 24 בארות שטופלו בתרבית תאים Nunc</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>142475</tr><tr><td>פוליברנה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>תרמו פישר מדעי&nbsp;</td><td>D3571</td><td></td></tr></tbody></table>

תרבות של murine העוברי metatarsals: מודל פיסיולוגי של endochondral התאבנות

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

התהליך הבסיסי של התעצמות אנדוכונדרלית נמצא תחת ויסות הדוק באדם הבריא כדי למנוע הפרעה בהתפתחות ו/או צמיחת עצם אורכית. ככזה, הכרחי שנקדם את הבנתנו את המנגנונים המולקולריים הבסיסיים המעורבים בהפרעות כאלה כדי לספק התקדמות לקראת תועלת למטופלים בני אדם ובעלי חיים. תרבית explant של איבר מטטרסל של עכבר היא מודל ex vivo פיזיולוגי ביותר לחקר התעצמות אנדוכונדרלית וצמיחת עצם כקצב הצמיחה של העצמות בתרבית מחקה את זה שנצפה in vivo. באופן ייחודי, תרבית איברי המטטרסל מאפשרת בחינה של כונדרוציטים בשלבים שונים של כונדרוגנזה ושומרת על אינטראקציות תא-תא ומטריצת תא, ולכן מספקת תנאים קרובים יותר למצב in vivo מאשר תאים בתרבית חד-שכבתית או תלת מימדית. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הדיסקציה המורכבת של מטטרסלים עובריים מהגפה האחורית של עוברי עכברים E15 ואת הניתוחים הבאים שניתן לבצע על מנת לבחון אוסיפיקציה אנדוכונדרלית וצמיחת עצם אורכית.

מטרת השיטה הזו הייתה לבודד metatarsals העוברי ותרבות אותם לבדיקה של צמיחת עצם אורך מינרליזציה ECM. שימוש בפרוטוקול שלנו כפי שיתואר בהמשך, עצמות מסרקות עובריות נותחו בהצלחה, כמו מדמיינים ידי מיקרוסקופ אור. מדידות של עצמות כף הרגל, שנערך כמצוין באיור 1, הראו את יכולתם לגדול אורך האורך mineralize ECM שלהם (איורים 2 ו -3). מינרליזציה של המטריצה ​​הוא ציין לראשונה באמצע שנות diaphysis של גֶמֶד העצם הוא ציין בקלות על ידי מיקרוסקופ אור. אין מכתים נדרש למרות ספיג של calcein עשויה להציע להדמיה משופרת של מינרלים שהוקמו זה עתה. מחקרים ניצול metatarsals עובריים עד כה 22,27,28 יש ניתחו את nd 2 גזור, 3 rd ו 4 ה (CENmetatarsals tral שלוש), בהנחה בצמיחה במבחנה מינרליזציה להיות דומה. בשנת vivo ההתפתחותי של metatarsals בעכברים, לעומת זאת, מגלה שהספרות יש 3 rd ו 4 th ראיות של מינרליזציה לפני כל metatarsals אחרים הפלנגות 29. הערכה של צמיחה ופוטנציאל מינרליזציה של בנפרד מבודדים תרבותי E15 2 nd, 3 rd ו -4 metatarsals ה עולה כי אין הבדלים משמעותיים במראה או היקף מינרליזציה לאחר 7 ימים של תרבות (איור 2). אין בדל הגידול האחוז מתחילת המחקר נמצא בתקופת התרבות. כמו הבדלים פוטנציאל מינרליזציה צוין הפרוטוקול הסטנדרטי של איגום 2 nd 3 rd ו 4 th metatarsals מופיע תקף למחקרים עתידיים. באופן מסורתי, החוקרים הוסיפו βGP למדיהנהג metatarsals עוברי התרבות לקדם מינרליזציה ECM. עם זאת, במחקרים תרבית תאים, הוכח כי אם האנזים TNAP מתווסף התקשורת osteogenic המכיל βGP, בתצהיר מינרליים hydroxyapatite אקטופי עדיין מתרחשת גם בהיעדר של תאים 30. כדי לבחון את ההשפעות של מצעי אגוניסטים מינרליזציה שונים על יכולת מינרליזציה מסרקת, אנו מתורבתים metatarsals E15 בתקשורת תרבות המכילות מגוון של תוספי מזון, ותמונות ומדידות אורך נרשמו יומי. התוצאות הצביעו על כך עצמות המסרק E15 עדיין לגדול mineralize ECM שלהם בהעדר βGP. E15 כף הרגל עצמות בתרבית חומצה אסקורבית רק בחומרי הראו עליות דומות באורך מינרליזציה כמו metatarsals בתרבית בנוכחות βGP (איור 3). הראינו גם כי lentivirus ניתן להשתמש כדי transfect DNA אקסוגני לתוך metata תרבותיrsals. כאן אנו transfected בהצלחה עצמות המסרק ביום 0 של תרבות (כלומר יום של דיסקציה) עם 2 x 10 6 חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) חלקיקי הנגיף לכל כף הרגל. כדי לאפשר התמרה וירוס, polybrene נוספה בו זמנית לתרבויות ב 1: 500. תרבויות נותרו 7 ימים, ללא שינויים התקשורת כנדרש עבור מינרליזציה המסרק E15 להתרחש, בטרם מודגרות עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) הכתם למשך 5 דקות ולאחר מכן דמיינו ישירות באמצעות מיקרוסקופ confocal ( איור 4). ההוכחה שלנו של ניסויי רעיון להראות התמרה יעילה בבירור. עם זאת יהיה זה נבון לבחון חלקים ברחבי מכלול של עצמות כף הרגל להעריך מניפולציה גן transfection ויעיל שלהם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> איור 1: מתודולוגיה סטנדרטית המשמש למדידת tהוא אורך ו מינרליזציה אזור של עובריים metatarsals. (א) מדידות סה&quot;כ אורך metatarsals E15 ביום 0 של התרבות (יום דיסקציה) נלקח דרך מרכז כף הרגל. מדידות (ב) אורך אורך הכולל של כף רגל לאחר שבעה ימים בתרבות. הערת העקמומיות הקלה כף הרגל. (ג) מדידת אורך אזור מינרליזציה לאחר שבעה ימים בתרבות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> איור 2: צמיחה וקיבולת מינרליזציה של אנטומית ברורה E15 metatarsals הדמיה ומדידה של 2, 3 ו -4 metatarsals מן הגפיים האחוריים של עכברי E15 w.כפי שבוצע. (א) תמונות סידוריות של 2, 3 ו -4 metatarsals לאורך תקופת התרבות. (ב) עליה באחוזי אורך מהיום 0 בכל יום של תרבות. (ג) אורך מינרליים של 2, 3 ו -4 metatarsals פני תקופת התרבות מבוטא באחוזים של אורך כף הרגל המוחלט. הנתונים מיוצגים כממוצע ± תקן שגיאה של הממוצע (SEM), (n = 6). (ד) C57Bl / 6J אורכי כף הרגל בכל יום של תרבות. הנתונים מיוצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 6). בר שחור = 1 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> איור 3: צמיחת מינרליזציה קיבולת של wild-typeמתורבתות E15 metatarsals ב מדיה שונים לסרטן העצמות. (א) תמונות סידורי של metatarsals בתרבית חומצה אסקורבית בלבד, 1 מ&quot;מ βGP, 3 מ&quot;מ phosphocholine, סידן כלורי 1.5 מ&quot;מ או 3 סידן כלורי מ&quot;מ המכיל התקשורת. (ב) עליה באחוזי אורך מהיום 0 של metatarsals מתורבת עם תוספות שונות. (C) מינרליים אורך metatarsals בתרבית תקשורת שונה מבוטא באחוזים של אורך כף הרגל המוחלט. נתונים מיוצגים כממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM), (n = 6). בר שחור = 1 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> איור 4: Transfection של E15 metatarsals עם וירוס ה- GFP Pמאמרים. (א) עצמות כף הרגל E15 היו transfected עם חלקיקי נגיף ה- GFP עבור הוכחה של מושג. עצמות (B) הוכתמו DAPI להדמיה DNA. (ג) תמונות Dual הצביעו transfection מוצלח של וירוס ה- GFP ברחבי מכלול של עצמות כף הרגל. ברים לבנים = 0.5 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

אנו מציגים פרוטוקול לניתוח ותרבית עצמות מטטרסל עובריות של עכברים ביום 15 (E15). מודל ex vivo פיזיולוגי זה של התעצמות אנדוכונדרלית מספק תנאים קרובים יותר למצב in vivo מאשר תאים בתרבית חד-שכבתית או תלת מימדית והוא כלי חיוני לחקירת צמיחה והתפתחות עצם.

תרבות של Murine העוברי metatarsals: מודל פיסיולוגי של Endochondral התאבנות

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להוציא ולהבטיח תרביות של עצמות המסרק (metatarsals) מעכברים עובריים, כדי לספק מודל ex vivo המאפשר לחקור צמיחת עצם אנדוכונדרלית (endochondral bone growth) ומסמנרליזציה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בנוגע להסמנרליזציה אנדוכונדרלית, התהליך שבאמצעותו גדלות עצמות ארוכות. בפרט, היא מתאימה להחקרה של המנגנונים העומדים בבסיס תחילת המינרליזציה השלדית.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת, באמצעות שימור האינטראקציות בין תאים לתאים ובין תאים למטריצה, מודל פיזיולוגי יותר של התגבשות סחוסית (endochondral ossification) בהשוואה לתאים בתרבית דו-ממדית (2D) או תלת-ממדית (3D). ראשית, הכינו את מדיום הדיסקציה על ידי דילול של alpha minimum essential media ביחס של 1:13 ב-PBS. לאחר מכן, השעיקו מחדש BSA בריכוז של 2 mg/mL וסננו אותו לסטריליזציה באמצעות מסנן מזרק.לאחר מכן, הכין את מצע התרבית והעבירו סטריליזציה באמצעות סינון עם אותו סוג של מסנן מזרק ששימש ל-BSA. לאחר סינון מצעי התרבית, העבר 300 µL של מצע התרבית לכל באער של פלטת תרבית בעלת 24 באערים. לאחר מכן, הנח את פלטת 24 הבאערים עם מצעי תרבית התאים ואת מצעי הנתיחה בתוך אינקובטור למשך שעה אחת לפחות כדי להגיע לשיווי משקל.לאחר מכן, טבול את ציוד הניתוח שעבר עיקור באוטוקלב ב-70% ethanol. השג עוברים של סוג בר (wild type) C57 black 6J בשלב התפתחותי E15 כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף, והנח אותם בצלחת פטרי המכילה תווך ניתוח. לאחר ביצוע דקפיטציה (ניתוק ראש), שטוף את העור ב-70% ethanol והשתמש במספרי מיקרו של Vannas כדי להסיר את הגפיים האחוריות מהעוברים על ידי חיתוך מסביב לפמור הפרוקסימלי.פעולה זו מבטיחה כי חלק גדול ככל האפשר מהגפה האחורית יוסר. העבירו את הגפיים האחוריות לכלי פטרי והטבילו אותן בתמיסת דיסקציה לפני ביצוע הדיסקציה של המטטרסלים. לאחר מכן, הניחו אותן תחת מיקרוסקופ דיסקציה.השתמשו בפינצטה מספר 4 כדי להחזיק את הגפה ביציבות, ובמקביל השתמשו בפינצטה מספר 5 להסרת העור מסביב לכף הרגל העוברית. הפעולה מבוצעת בצורה היעילה ביותר על ידי תפיסת העור בגובה הטיביה (tibia) ומשיכתו לכיוון הפלנגות (phalanges). לאחר מכן, השתמשו בפינצטה מספר 4 כדי להחזיק בזהירות את הטרסלים (tarsals) של כף הרגל העוברית, והשתמשו בפינצטה מספר 5 כדי להסיר ולהשליך את המטאטרסלים (metatarsals) הראשון והחמישי.תוך כדי החזקת כף הרגל באותה תנוחה, השתמשו בפינצטה מספר 5 כדי להפריד את רקמות החיבור בין שלוש הפלנגות (עצמות האצבעות) הנותרות לבין המטאטרסלים (עצמות המסרק). לאחר מכן, הכניסו את קצה הפינצטה מספר 5 למפصل שבין הפלנגות למטאטרסלים כדי להסיר את הפלנגות מהמטאטרסלים. לבסוף, השתמשו בפינצטה מספר 5 כדי להפריד את רקמות החיבור בין הטרסלים (עצמות המסרק) למטאטרסלים.שוב, מקמו את קצה פינצטת מספר 5 במרווח המפרקי שבין העצמות המסרק (tarsals) למטטרסלים (metatarsals) ושחררו בעדינות את המטטרסלים מהעצמות המסרק. לאחר מכן, הרימו בעדינות את המטטרסלים ששוחררו כעת באמצעות פינצטת מספר 4 והניחו אותם בתוך תמיסת דיסקציה רעננה. קריטי להקפיד שהמטטרסלים העובריים לא ייפגעו ולא יתייבשו במהלך שלבי הדיסקציה והטיפול.פגיעה במטטרסלים (עצמות המסרק) משפיעה על גדילתם ומינרליזציה שלהם. רקמות רכות שיישארו יdetached מהמטטרסלים במהלך התרבית, לכן אין צורך להשקיע מאמץ מוגזם בהסרה מוחלטת שלהן במהלך הניתוח. כאשר כל המטטרסלים הנדרשים הופרדו, העברם בזהירות ובאופן פרטני אל פלטת 24 בארות שחוממה מראש ומכילה 300 microliters של מצע גידול.בשלב הבא, בצעו מדידות אורכיות ראשוניות באמצעות מיקרוסקופ עם מצלמה דיגיטלית מחוברת ותוכנה לניתוח תמונות. גדלו את העצמות המטטרסליות למשך עד 14 ימים. עם זאת, אין להחליף את המצע בטרבחות E15 עד ליום החמישי לפחות של התרבית, שכן הדבר משפיע על יכולת המינרליזציה שלהן.לאחר מספר ימי תרבית, מדי את אורך אזור המינרליזציה המרכזי עם הופעתו. לאחר מספר ימי תרבית, מתרחשת מינרליזציה של המטריקס במרכז הדיאפיזה (diaphysis) של שריד העצם, אותה ניתן להבחין בקלות באמצעות מיקרוסקופיה של אור. המטטרסלים השני, השלישי והרביעי מאוגדים לעיתים קרובות למטרות מחקרים עובריים.במהלך שבעה ימי תרבית, לא נצפו הבדלים משמעותיים במראה או בהיקף המינרליזציה של המטטרסלים השני, השלישי והרביעי, דבר המהווה תיקוף לפרקטיקה זו. כדי לבחון את השפעתם של סובסטראטים ואגוניסטים שונים של מינרליזציה על יכולת המינרליזציה של המטטרסלים, תורבדו מטטרסלים של E15 במצעים המכילים מגוון תוספים כפי שמוצג כאן. התמונות ומדידות האורך תועדו מדי יום.מבין כל התסובסטרטים שנבדקו, חומצה אסקורבית הגבירה את אורך המינרל באופן המשמעותי ביותר ובאופן הדומה ביותר להשפעות של beta-glycerolphosphate. טרנספקציה של פלסמיד GFP באמצעות לנטיבירוס למטאטרסלים של E15 הביאה לביטוי של GFP לאורך כל המטאטרסל. הדבר מדגיש את השימוש בלנטיבירוס לטרנספקציה מוצלחת של מטאטרסלים עובריים.ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי להשתיק (knock down) או לבטא יתר (overexpress) של גנים מטרתיים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי המטטרסלים של שלב E15 שבירים ביותר. השמירה על שלמות המטטרסל היא קריטית להצלחת התרבית בהמשך התהליך.בעקבות הניתוח והתרבית של עצמות המטטרסאלס (metatarsals) משלב E15, ניתן לבצע ניתוחים רבים להמשך. לדוגמה, ניתן להעריך ביטוי של mRNA וחלבונים באמצעות RTQPCR ו-Western blotting, בהתאמה. בנוסף, ניתן להשתמש באימונוהיסטוכימיה כדי לאתר חלבונים בתוך המטטרסאלס.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעליי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להוציא בהצלחה את המטטרסלים (עצמות כף הרגל) מהגפיים האחוריות של עוברי עכברים ביום 15 להריון. ניתן להתאים שיטה זו למטטרסלים ביום 17 או 18 להריון, אשר שימושיים יותר למחקר של צמיחת עצם.

culture-murine-embryonic-metatarsals-physiological-model-endochondral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מודלים של בעלי חיים משמשים לעתים קרובות כדי לחקות פגיעה חמורה בעצמות במחקר ביו-רפואי. בשל גודלם הקטן, הקמת נגעי עצם מיוצבים בעכברים היא מעבר ליכולותיהן של רוב קבוצות המחקר. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לביסוס וניתוח פגמים ניסיוניים בעצם הירך בעכברים.

דגם פגם עצם הירך קריטית בגודל פשוט בעכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה osteosynthesis פולשנית באמצעות בורג אורתופדיים עבור מתוקננת ייצוב הירך שברים, אשר ניתן להשתמש כדי לנתח את עצם endochondral ריפוי בעכברים.

מודל פולשנית לניתוח שבר Endochondral ריפוי בעכברים בתנאים מתוקננים ביו-מכני

כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

המודל מאתר סגור בשביליאתה לא רואה שיש הוא כלי עוצמתי ללמוד ריפוי השבר ואסטרטגיות טיפוליים חדשניים כדי להאיץ התחדשות העצם. המטרה של פרוטוקול כירורגי זה היא לייצר חד צדדית שברי הירך סגור בעכברים באמצעות של פלדה מוט. לייצב את עצם הירך.

הדור של שברי הירך סגור בעכברים: מודל ללמוד ריפוי עצם

כאן, אנו מציגים שיטה עבור תרבות vivo ex של עצמות murine ארוך בשלבים העוברי והיילוד, מתאים לניתוח העצם ופיתוח הסחוס הומאוסטזיס בתנאים מבוקרים תוך לכידה בתהליך vivo.

Culturing ומדידת עוברי והיילוד מורנה עצמות ארוכות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של מסוף העכבר למבוגרים פלקים כריתת כריתה לחקור היווצרות בלסטאמה blastema ו intramembranous להתקשות, מנותח על ידי הפלורסנט אימונוהיסטוכימיה ו רציפים ב-vivo מיקרו טומוגרפיית.

כריתה של ספרות עכבר למבוגרים והתחדשות: מודל פשוט כדי לחקור ממגי בלסטאמה היווצרות הIntramembranous פיקציה

פרוטוקול זה מתאר הליך כירורגי להקמת שבר דיאפיזיאלי בעצם הירך של עכברים, המיוצב באמצעות חוט תוך מדולרי, לצורך מחקרי ריפוי שברים.

ביסוס מודל שבר עצם הירך הדיאפיזי בעכברים

לטיפול בעצם באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית על ידי השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מתאי גזע מזנכימליים יש פוטנציאל לעקוף את החסרונות של טיפולים קונבנציונליים. הידרוג'ל חומצה היאלורונית יעיל בהגדלת שתלי סחוס ממוינים באופן אחיד, כמו גם ביצירת עצם משולבת עם כלי דם בין שתלים מאוחים in vivo.

היווצרות עצם משולבת באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo באמצעות תאי גזע מזנכימליים

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר משופר עבור פציעות לוחיות גדילה של עצם בגיל ההתבגרות. באמצעות עכברים טרנסגניים עם כתבים פלואורסצנטיים תלת-שושלותיים עבור סוגי קולגן I, II ו-X, המטריצות העיקריות הקשורות לשלוש תת-שכבות שונות של לוחית הגדילה, מיקום הפציעה מונחה על ידי פלואורסצנטיות טבעית מתחת למיקרוסקופ.

מודל מורין מהונדס טריקולור לחקר פגיעה בלוחיות גדילה

מודל הפגיעה במח העצם של העכברים הוא כלי שימושי לחקר אוסטאוגנזה לאחר לידה באמצעות התעצמות פנימית. פרוטוקול כירורגי פשוט זה מתאר את הליך אבלציה של מח העצם להערכה במורד הזרם של היווצרות עצם חדשה ותגובות תאיות לאחר פציעה.

מתודולוגיה משופרת לחקר אוסטאוגנזה לאחר לידה באמצעות אוסיפיקציה אינטרמברנית במודל פגיעה במח עצם של עכברים

למדו את שיטת התרבות של metatarsals עובריים מעכברים לחקר התאבנות אנדוכונדרלית וצמיחת עצם. מודל זה שומר על אינטראקציות תאיות פיזיולוגיות לתוצאות מדויקות יותר.

תרבות של Murine העוברי metatarsals: מודל פיסיולוגי של Endochondral התאבנות

גלה סרטונים נוספים