פלואורסצנטיות של קרני רנטגן (XRF)
מקור: המעבדה של ד"ר לידיה פיני — המעבדה הלאומית של ארגון
פלואורסצנטיות של קרני רנטגן היא קרינה מושרה, הנפלטת שניתן להשתמש בה כדי ליצור מידע ספקטרוסקופ…
1. הכנת חלונות הסיליקון ניטריד
- השתמש פינצטה הפוכה כדי להרים חלון (חלונות ניטריד סיליקון יתנפץ אם ירד).
- הנח חלון על מגלשת זכוכית, צד שטוח למעלה.
- דבק חתיכות קטנות של סרט ויסקי לצדי החלון, ולהשתמש אלה כדי לדבוק את החלונות לתחתית צלחת התרבות.
- לחטא את החלונות בצלחות תרבות עם קרינת UV. זה יכול להתבצע עם הגדרת crosslink אוטומטי על ארון UV-crosslinking, ואחריו הקרנת UV נוספת תחת מנורת UV במכסה המנוע זרימה למינאר במשך כ 1 שעות.
2. ציפוי התאים על חלונות הסיליקון ניטריד המעוקרים
- החזק את המנה עם זה מוטה על זווית 45°.
- הוסף מדיה על ידי צנרת לכיוון הצד של המנה לאט להקל על זווית ההטיה כדי לצפות את החלון עם מדיה.
- מוסיפים תאים לצלחת התרבות, באותו אופן, ודגרה.
- התבונן בתאים מדי פעם באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לקבוע מתי הם מוכנים לשימוש.
3. קיבעון וייבוש של תאים
- במכסה המנוע של זרימה למינארית, הסר את המדיה על ידי שאיפה עדינה תוך הטיית המנה כמתואר לעיל.
- מוסיפים PBS, צינורות לכיוון הצד של המנה תוך החזקת אותו בזווית. יש להקל באיטיות על זווית ההטיה כדי לצפות את החלון ב-PBS.
- הסר PBS עם שאיפה עדינה.
- צנרת לכיוון הצד של המנה, והחזקתה בזווית, להוסיף 4% PFA / PBS, pH 7 כדי לכסות את התאים. שמור בתמיסה זו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את תערובת PFA / PBS, ולהיפטר כחומר מסוכן.
- הוסף PBS, pipetting כמתואר לעיל.
- חזור על שלבים 3.5 ו-3.6 פעמיים.
- הסר את PBS על ידי שאיפה עדינה.
- הוסף צינורות 20 מ"מ, 200 mM סוכרוז, pH 7.
- הסר את צינורות / סוכרוז על ידי שאיפה עדינה.
- חזור על שלבים 2.8 ו- 2.9 פעמיים.
- כתם במהירות את הקצוות ואת הכניסה האחורית של החלון עם Kimwipe, ולאחר מכן להגדיר את החלון על משטח נקי, כגון מחצלת רשת גומי, להתייבש.
4. הדמיית פלואורסצנטיות של תאים
- לאחר הדגימה יבשה, לאמת את נוכחותם של תאים על החלונות באמצעות מיקרוסקופ אור.
- השתמש בלק כדי לאבטח את החלונות למחזיק אלומיניום המסופק על ידי קו הקורה.
- הכנס את מחזיק האלומיניום להרכבה קינמטית, ולאחר מכן מקם אותו בעמדה בנקודת המוקד של האופטיקה במיקרוסקופ קרני הרנטגן, ובזווית של כ -45° לקרן הרנטגן של האירוע, מותקן על שלבי הננו-מיקום לדוגמה.
- צא מאזור מכשיר המיקרוסקופ של קרני הרנטגן (בדרך כלל כלוב עשוי קירות עופרת), ופתח את התריס. נהל את השלבים הנותרים מרחוק.
- באמצעות לוחית אזור, או מראות קירקפטריק-באאז, למקד את קרן הרנטגן המונוכרומטית (בדרך כלל 10 keV באנרגיה) עד לגודל ספוט תת מיקרון.
- באמצעות שלבי דגימת הננו-מיקום, והצגת המיקום של קרן הרנטגן במדגם באמצעות מצלמת נצנצים מכוילת מראש במורד הזרם, לקבוע את הרוחב והגובה המתאימים של סריקת הרסטר כדי ללכוד נתונים של המדגם.
- עם גלאי נדידת סיליקון באורך גל ב 90° לקרן האירוע, וכ -3 מ"מ או פחות מהדגימה, לאסוף ספקטרום בדיקה עם זמן התעכבות של 1-2 שניות.
- הצגת ספקטרום הבדיקה, בחר זמן התעכבות מתאים לסריקה, כדי לספק אות לרעש מספיק עבור האלמנטים המעניינים.
- בחר רזולוציה מתאימה לסריקה, כזו שאינה קטנה משמעותית מגודל הספוט של הקרן במדגם, ואינה גדולה יותר מתכונות העניין במדגם.
- תכנת את הסריקה לתוך תוכנת הסריקה ואסוף את התמונה.
ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית של קרני רנטגן, או XRF, היא טכניקה אנליטית לא הרסנית המשמשת לביצוע ניתוח יסודות של דגימות בטמפרטורת החדר.
ניתן ליישם XRF על מגוון רחב של דגימות, כולל יצירות ביולוגיות, משפטיות, סביבתיות ואפילו יצירות אמנות. הדגימות יכולות גם ללבוש מגוון צורות, כגון אבקות, גבישים ונוזלים. ב-XRF, דגימה מופצצת בקרן של קרני רנטגן הגורמות לה לפלוט קרני רנטגן משניות באנרגיה נמוכה יותר, הנקראות קרינה פלואורסצנטית.
למרות שהיא מכונה טכניקת פלואורסצנטיות, XRF שונה ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית מסורתית בכך שהיא אינה משתמשת באור נראה באנרגיה נמוכה יותר, או במולקולות פעילות אור.
סרטון זה יציג את היסודות של XRF, וידגים כיצד לאסוף מפות יסודות של דגימה ביולוגית.
כאשר פוטון בעל אנרגיה מספקת מתנגש באטום, האנרגיה נספגת, ומעוררת את אחד האלקטרונים של המעטפת החיצונית. כאשר האלקטרון נרגע, הוא פולט פוטון משני, בדרך כלל בעל אנרגיה נמוכה יותר. תהליך זה ידוע בשם פלואורסצנטי. בניגוד לפוטונים בעלי אנרגיה נמוכה יותר, כמו אלה המשמשים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, פוטונים של קרני רנטגן הם אנרגטיים מספיק כדי להוציא לחלוטין אלקטרונים המוחזקים היטב מהמעטפת הפנימית. אלקטרון ממעטפת בעלת אנרגיה גבוהה יותר ייפול לתוך המקום הפנוי. פוטון פרופורציונלי להפרש האנרגיה בין שתי הקליפות משתחרר. כל יסוד פולט קבוצה ייחודית של פוטונים, או ספקטרום, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות את היסוד ולקבוע את הכמות הקיימת. תופעה זו ידועה בשם פלואורסצנציה של קרני רנטגן.
לאחר שנאסף ספקטרום יסודות, ניתן לבודד את האותות של אלמנטים מעניינים. ניתן לבצע מדידות במספר מיקומים על פני דגימה, וליצור תמונה, פיקסל אחד בכל פעם. תהליך זה נקרא סריקת רסטר. לאחר מכן ניתן ליצור תמונות של כל האלמנטים המעניינים. מפות יסודות אלה מספקות מידע רב ערך על המדגם. עם הבנה של XRF, אתה מוכן כעת להכין דגימת תא ביולוגית ליצירת מפות יסודות.
כדי להתחיל, ראשית הכינו ועקרו חלון סיליקון ניטריד, שיחזיק את הדגימה במקומה לסריקה. השתמש בזהירות, מכיוון שהם שבירים מאוד. כוון את החלון כך שיהיה שטוח כלפי מעלה. לאחר מכן הניחו את החלון בכלי תרבות, והדביקו אותו לכלי בעזרת חתיכות קטנות של סרט דבק.
לבסוף, עקרו את חלון הסיליקון ניטריד בקרינת UV למשך שעה.
כעת, לאחר שהחלון עבר עיקור, ניתן לקבע אליו את הדגימה. ראשית, החזיקו את צלחת התרבות בזווית והוסיפו מדיה לצד המנה. שחרר לאט את ההטיה כדי לצפות את החלון. מוסיפים תאים למנה באותו אופן, ודוגרים.
התבונן מעת לעת בתאים תחת מיקרוסקופ אור עד שהם מוכנים לשימוש.
במכסה מנוע זרימה למינרית, שאפו בעדינות את המדיה מהצלחת.
לאחר מכן, שטפו את התאים במי מלח עם פוספט כדי להסיר עודפי מדיה.
שאפו את ה-PBS וקבעו את התאים עם פרפורמלדהיד. לאחר 20 דקות, הסר את התערובת והשליך כפסולת מסוכנת.
הסר את החלון מהצלחת, ומחק במהירות את הקצוות ואת הכניסה האחורית של החלון בעזרת Kimwipe. הנח את החלון על משטח נקי לייבוש.
לאחר שהדגימה יבשה, ודא את נוכחותם של תאים על החלון באמצעות מיקרוסקופ אור.
בעזרת לק שקוף, אבטח את החלון למחזיק אלומיניום.
הכנס את מחזיק הדגימה לתושבת המכשיר, ולאחר מכן הנח את התושבת על שלב המיקום של מיקרוסקופי הרנטגן.
מקם את חלון הדגימה בנקודת המוקד של האופטיקה של מיקרוסקופ הרנטגן, עם זווית של 45 מעלות לקרן הפוגעת.
צא מאזור המכשיר ובצע את השלבים הנותרים מרחוק כדי למזער את החשיפה לקרני רנטגן.
פתח את התריס והשתמש באופטיקה כדי למקד את קרן הרנטגן המונוכרומטית עד לגודל נקודה תת-מיקרומטרית.
ניתן לצלם את מיקום הנקודה באמצעות מצלמה מכוילת מראש. באמצעות שלבי המיקום, קבע את הרוחב והגובה המתאימים הדרושים כדי להוסיף רסטר מעל הדגימה.
אסוף ספקטרום בדיקה של אלמנט העניין עם זמן שהייה של 1 ? 2 שניות.
מספקטרום הבדיקה, בחר זמן סריקה מתאים על מנת לספק יחס אות לרעש מספיק עבור האלמנטים המעניינים.
לאחר מכן, קבע את הרזולוציה הדרושה לדגימה. הרזולוציה צריכה להיות קטנה יותר מהתכונות המעניינות, אך גדולה יותר מגודל הספוט. לבסוף, תכנת את הסריקה לתוכנת הסריקה, ואסוף את התמונה.
בניסוי זה בוצעה מפת יסודות של תא עבור מספר אלמנטים שונים. מתכות רבות, כגון נחושת, ברזל ואבץ הן חומרי מזון חשובים בתא, וזוהו בבירור בתוך התא.
על ידי קביעת היכן נמצאת כל מתכת בתא, ניתן להבהיר מידע רב ערך על התהליכים התאיים הרגילים שלה. בנוסף, ניתן להבין מחלות המבוססות על מתכות.
פלואורסצנציה של קרני רנטגן משמשת במגוון רחב של תחומים מדעיים. האופי הלא הרסני של XRF מאפשר את השימוש בו בחקר חפצים היסטוריים. היסטוריונים של האמנות משתמשים בטכניקה כדי לקבוע את הפיגמנטים ששימשו במקור ביצירות אמנות. זה יכול להבהיר מידע על היצירה, כגון המקור, הצבעים שדהו עם הזמן והאותנטיות. מדעני זיהוי פלילי משתמשים גם ב-XRF בחקירת זירת פשע. כאשר יורים אקדח, האזור שמסביב מכוסה בשאריות ירי. שאריות ירי אקדח מכילות אבקת שריפה, פריימר הצתה ומתכת מהמעטפת והכדור. המידע שנאסף עם XRF יכול לזהות את האשם וכלי הנשק בו נעשה שימוש.
תחום מחקר נוסף שמתאים לפלואורסצנציה של קרני רנטגן הוא פליאונטולוגיה. כאן, מידע יסודי נאסף ממאובן טרילוביט, פרוקי רגליים ימיים שחיו לפני יותר מ-250 מיליון שנה.
על ידי אפיון הרכב היסודות של מאובנים, ניתן להשיג מידע חדש על חיים ארוכים שנכחדו. דגימות שהשתמרו טוב יותר יכולות אפילו לספק את הרכב הרקמות הרכות שהתדרדרו מזמן.
זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE לפלואורסצנטיות של קרני רנטגן. כעת עליך להבין את התיאוריה של ספקטרוסקופיה של קרני רנטגן וכיצד לאסוף מידע יסודי ממגוון רחב של מקורות.
תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does X-ray fluorescence differ from traditional fluorescence microscopy?
XRF uses high-energy X-ray photons that expel tightly held electrons from inner shells, whereas traditional fluorescence microscopy uses lower-energy visible light and light-active molecules. X-ray photons are energetic enough to cause inner-shell ionization, producing characteristic fluorescent radiation unique to each element that enables elemental identification and quantification.
Q2: What happens when an X-ray photon collides with an atom in XRF?
A high-energy X-ray photon expels an electron from an inner shell of the atom. An electron from a higher-energy shell then falls into the vacancy, releasing a secondary photon proportional to the energy difference between the two shells. This emitted photon is characteristic of the specific element and forms the basis of elemental identification.
Q3: What types of samples can be analyzed using X-ray fluorescence?
XRF can be applied to biological, forensic, environmental, and art samples in various forms including powders, crystals, and liquids. The non-destructive nature of XRF makes it ideal for analyzing historical artifacts, crime scene evidence, and paleontological fossils without damaging the original material.
Q4: How are elemental maps generated in XRF analysis?
Once an elemental spectrum is collected, signals of elements of interest are isolated and measured at multiple locations across a sample through raster scanning. This pixel-by-pixel process generates images for all elements of interest, producing elemental maps that reveal the spatial distribution and concentration of specific elements within the sample.
Q5: Why is sample preparation important before XRF analysis of biological cells?
Proper sample preparation ensures cells adhere securely to the silicon nitride window and remain intact during analysis. Sterilization with UV radiation, fixation with paraformaldehyde, and careful handling prevent contamination and cell damage, enabling accurate elemental mapping and reliable identification of metals like copper, iron, and zinc within cellular structures.
Q6: What information can forensic scientists obtain from XRF analysis of gunshot residue?
Gunshot residue contains gunpowder, ignition primer, and metal from the casing and bullet. XRF identifies the elemental composition of this residue, providing information that can identify the culprit and weapon used in crime scene investigations through the characteristic metal signatures present in the residue.
Q7: How does XRF contribute to understanding paleontological specimens?
By characterizing the elemental composition of fossils using XRF, researchers gain new information about long-extinct life forms. Better-preserved samples can reveal the elemental composition of soft tissues that deteriorated millions of years ago, providing insights into ancient organisms and their biological processes.