לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי תסיסנית שחלות

המטרה הכוללת של הליך זה, היא להדגים שיטות לחקר מבנה ותפקוד המיטוכונדריה ברקמה חיה כמו גם ברקמה קבועה באורגניזם המודל Drosophila melanogaster. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המיטוכונדריאלית. כגון מנגנוני הוויסות של תפקוד המיטוכונדריה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מבצעת ניתוח מפורט של יחסי המבנה/תפקוד המיטוכונדריה. לאחר מיון חמש נקבות זבובים מורדמות על פי פרוטוקול הטקסט, תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, השתמשו בשני זוגות מלקחיים כדי לנתק את בית החזה מהבטן. לאחר מכן, העבירו בזהירות את הבטן לבאר השנייה של המנה.

השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את הבטן בקצה האחורי, השתמש בזוג המלקחיים השני כדי לדחוף לאט את השחלות החוצה. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להחזיק שחלה בודדת בקצה האחורי האטום והעביר אותה בזהירות לבאר השלישית של המנה לצורך התגרות או קיבוע. הקניטו בזהירות את מעטפת המגן מסביב לשחלות, על ידי שימוש בזוג מלקחיים כדי להחזיק את הקצה האחורי וטאטוא קל של מחט מתגרה מהקצה האחורי לקצה הקדמי.

להכנת תאים מצופים פוליליזן, הניחו שתי טיפות מופרדות של 20 מיקרוליטר של פוליליזן על הכיסוי של צלחת פטרי עם תחתית זכוכית. יבש את הצלחות באוויר בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, ומתאר את הפוליליזין בצד התחתון של הצלחת. הגדר את פרמטרי הסריקה במיקרוסקופ הקונפוקלי על ידי פתיחת תוכנת רכישת התמונה, ובכרטיסיית הרכישה, הגדר את פרמטרי הסריקה המתאימים.

סמן את תיבות סדרות הזמן, ההלבנה והאזורים כדי לפתוח את הכרטיסיות הבודדות. לאחר מכן, הזן את ערכי פרמטרי הרכישה המתאימים בכל כרטיסייה. לאחר מכן, הניחו שחלה אחת מנותחת ומתגרה על אזור מצופה פוליליזין מסומן והשתמשו במחט מתגרה כדי לפזר את השחלה ולהפריד בין השחלות.

הניחו טיפה של 10 מיקרו ליטר של מדיום חיתוך חרקים על גבי השחלה, והקפידו לכסות את כל האזור המצופה פוליליזין. לאחר מכן, מכסים את צלחת הפטרי. מיד לאחר הרכבת השחלה, הנח את הדגימה על שלב המיקרוסקופ והשתמש בחתיכת העין כדי לאתר במהירות את שדה העניין ברקמה החיה.

לחץ על שידור חי כדי לקבל תמונה חיה של תחום העניין שנבחר, ולאחר מכן לחץ על עצור כדי להפסיק את הסריקה החיה. במידת הצורך, התאם את פרמטרי הרכישה כך שהאות הפלואורסצנטי שזוהה יהיה מתחת לרמות הרוויה עם הרקע המוגדר כפי שנקבע על ידי התאמת ערכי ההיסט. מהכרטיסייה הגרפית, השתמש בכלי הציור bezier כדי לצייר החזר ROI קטן כדי לתחום את אזור הלבנת התמונות בתמונה שנרכשה בסריקה.

לאחר מכן בצע רכישת תמונה, על ידי לחיצה על התחל ניסוי. כדי לבצע צביעה חיה בצבעי מיטוכונדריה פלואורסצנטיים, יש לדלל את מלאי הכתמים במדיום חיתוך חם עד ריכוזי עבודה סופיים. לאחר הדגמת דיסקציה והתגרות מוקדם יותר, הניחו את השחלות לתוך 200 מיקרוליטר של תמיסת מכתים בבאר של צלחת דיסקציה.

מכסים את הכלי בקופסה עטופה בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור ולדגור על הרקמה למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את השחלות המוכתמות באמצעות מלקחיים כדי להעביר אותן בזהירות לשלוש בארות רצופות המכילות מדיום ללא כתם. לצביעה משותפת עם TMRE, בצביעה המיטוכונדריאלית הכוללת התואמת, יש לבצע תחילה צביעה עם TMRE, ולאחר מכן מבלי לשטוף את הרקמה, להעביר מיד את הדגימה לתוך הצביעה המיטוכונדריאלית הכוללת.

לאחר שטיפה והרכבה של השחלות כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, כדי לבצע הדמיה קונפוקלית על הדגימה, סמן את תיבת חתך ה-z כדי לפתוח את הלשונית. סובב את גלגל המיקוד לכיוון החלק התחתון של הדגימה בזמן שהוא נסרק בשידור חי ולחץ על הגדר תחילה כדי להגדיר את חתך ה-z התחתון ביותר. לאחר מכן הזז את גלגל המיקוד בכיוון ההפוך כדי להגדיר את החלק העליון ביותר.

בצע רכישת תמונות על ידי לחיצה על התחל ניסוי. במקרה של xvivamicroscopy חי, יש להשיג את הנתונים תוך 15 דקות מהרכבת הרקמה, אחרת, תוצאות הניסוי עשויות להיות מושפעות משינויים בפיזיולוגיה עקב מוות של הרקמה כתוצאה מכך. מיד לאחר החיתוך מתחת למכסה אדים, הניחו את השחלות לתוך 200 מיקרוליטר של PFA טרי בטמפרטורת החדר בבאר של כלי חיתוך זכוכית.

דגרו על הרקמה למשך 15 דקות כדי לתקן אותה. לאחר שטיפת השחלות ב-PBS על פי פרוטוקול הטקסט, בעודך ב-PBS, הקניטו את השחלות כדי להסיר בזהירות את מעטפת הסיבים המגנים שעלולה לעכב את גישת האנטיגן מהנוגדן. לחדור את השחלות המתגרות על ידי הנחתן בצינור מיקרו-נתיך עם 500 מיקרוליטר של 0.5 אחוז טריטן x 100 ב-PBS.

לאחר מכן, הנח את הצינור בקופסה מכוסה והגדר להתנדנד ב-25 סל"ד למשך 30 דקות. הסר את ה-PBS/TX לפי פרוטוקול הטקסט חסום את הרקמה על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של BSA מומס ב-0.5 אחוז PBS/TX. דגרו את הדגימות על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר הסרת התמיסה החוסמת, הוסף נוגדנים נגד כלבת desycline E ונוגדני ATPB נגד עכברים. דגרו את הרקמה על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר הדגירה, השתמש ב-PBS-TX כדי לשטוף את השחלות שלוש פעמים למשך 15 דקות כל אחת.

לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של הנוגדנים המשניים המתאימים ו-PBS-TX טרי ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר שטיפת הרקמה פעמיים, הוסף ווים לכביסה השלישית. לאחר מכן, בעזרת מיקרופיפט של מיליליטר אחד, הסר את השחלות המוכתמות במערכת החיסון מצינור המיקרו-פיוז לבאר טרייה של צלחת חיתוך זכוכית המכילה 200 מיקרוליטר PBS.

הוסף טיפה אחת של מדיום הרכבה על בסיס גליצרול לשקופית זכוכית והוסף את השחלות המוכתמות במערכת החיסון אחת אחת למדיום ההרכבה. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, תוך כדי החזקת החלק האטום של השחלה בעזרת מלקחיים, השתמש במחט מתגרה כדי למרוט בעדינות את השחלות השקופות מתאי הביציות הבוגרות האטומות. לאחר מכן, הסר את תאי הביצים הבוגרים ממדיום ההרכבה.

הנח זכוכית כיסוי על השקופית ולחץ קלות כדי להבטיח שאמצעי ההרכבה יתפשט בצורה אחידה. יבש את הדגימות באוויר במשך 15 דקות לפני השימוש בלק כדי לאטום את הקצוות. לבסוף, בצע מיקרוסקופיה קונפוקלית לפי הצורך.

כפי שמוצג כאן, היפוך המכוון לאחד מענני המיטוכונדריה הקשורים לתאי ה-nerse מוביל לאובדן של יותר מ-50 אחוז של האות הפלואורסצנטי מה-ROI הכחול-לבן המקיף את ה-ROI האדום תוך 200 שניות בעוד שה-ROI של הבקרה הצהובה מולבן באופן מינימלי. השחלות של הדרוזופילה הראו ירידה באות עם עומק הרקמה, וחשוב להבחין בעומק המקסימלי של הרקמה שבתוכה ניתן לזהות את הפלורופורים כגון TMRE ומיטוסטיין, במהלך הדמיה חיה. ניתוח איכותני מצביעה משותפת עם TMRE והצביעה המיטוכונדריאלית הכוללת, מראה כי הגרמריום של הדריזופילה מציג פוטנציאל מיטוכונדריאלי גבוה יותר ליחידת מסה בשלב 2B.

באיור זה, ניתוח איכותני למחצה מדגים את ההבדל בפוטנציאל המיטוכונדריאלי ליחידת מסה בין AFC ל-MBC כפי שנותח מתא ביצים שלב 9. תמונות אלה חושפות כי ספיגת מיטוזוקס מתרחשת בתאי זקיקי הדריזופילה. בניסוי זה, צביעה קו-אימונונית מזהה אות דציקלין מוגבר החופף לאות ה-ATPB המיטוכונדריאלי ולשיבוטי נול DRP1 שלילי GFP בגרמריום ובתא ביצים שלב 9.

ניתן לשנות את השיטות המתוארות ולהשתמש בהן כדי לחקור את תפקוד המבנה המיטוכונדריאלי ברקמות דריזופיליה אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח, להכתים ולדמות שחלות דריזופילה קבועות וחיות כדי לחקור את המבנה והתפקוד של המיטוכונריה.