Name: לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי תסיסנית שחלות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: למד שיטות לניתוח מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי ברקמות חיות וקבועות של Drosophila melanogaster. טכניקות אלו חיוניות להבנת מנגנוני הרגולציה של תפקוד מיטוכונדריאלי בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ללינה פאטל ודיימונד וודארד על עזרתם בהכנת המדיום לדרוזופילה ולד"ר איגור צ'סנוקוב על מתן גישה לסטריאומיקרוסקופ המחובר למצלמה.

<ol><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>Youle, R. J., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fission%2C+fusion%2C+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fission, fusion, and stress.</a> Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).</li>
<li>Mitra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fission-fusion+as+an+emerging+key+regulator+of+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation.</a> Bioessays. , (2013).</li>
<li>Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+division%3A+molecular+machinery+and+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions.</a> Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).</li>
<li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+functions+of+mitochondrial+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Physiological functions of mitochondrial fusion.</a> Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).</li>
<li>Liesa, M., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+the+regulation+of+nutrient+utilization+and+energy+expenditure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure.</a> Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).</li>
<li>Hoppins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The regulation of mitochondrial dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).</li>
<li>Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4%2C+Analysis+of+mitochondrial+dynamics+and+functions+using+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).</li>
<li>Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRP1-dependent+mitochondrial+fission+initiates+follicle+cell+differentiation+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis.</a> J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).</li>
<li>Klusza, S., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+crossroads+of+differentiation+and+proliferation%3A+precise+control+of+cell-cycle+changes+by+multiple+signaling+pathways+in+Drosophila+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells.</a> Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).</li>
<li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li>
<li>Parker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mitochondrial+pool+of+cyclin+E%2C+regulated+by+Drp1%2C+is+linked+to+cell-density-dependent+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).</li>
<li>Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+mitochondrial+axonal+transport+and+membrane+potential+without+increased+reactive+oxygen+species+production+in+a+Drosophila+model+of+Friedreich+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia.</a> J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).</li>
<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
<li>Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+the+Drosophila+follicle+cell+epithelium+produces+%26%2334%3Bfalse+clones%26%2334%3B+with+apparent+polarity+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces &#34;false clones&#34; with apparent polarity phenotypes.</a> Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+cell+cycle+progression+during+development+as+revealed+by+the+tenured+mutation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila.</a> Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).</li>
<li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).</li>
<li>Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+in+Drosophila%3A+Imaginal+Discs+as+a+Model+for+Epithelial+Tumor+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול Photobleaching: מניעת photobleaching מופרזת של דגימות ניאון הוא הכרחי כדי ביצוע מיקרוסקופיה confocal יעיל. לכן, הזמן שלוקח לאתר דגימות דרך העינית או להגדיר פרמטרים רכישת התמונה דרך במצב סריקה בזמן אמת צריך להיות ממוזער כדי למזער photobleaching. נזק לרקמות: מאז המיטוכונדריה נחשבים החיישנים של ב...

המיטוכונדריה מתואר קלסי כמו תחנת הכח הסלולר, שכן הם המושבים העיקריים של ייצור אנרגיה בתאי בדיל. יתר על כן, המיטוכונדריה לשחק תפקיד קריטי במטבוליזם, דור חום, שינוי שומנים, סידן הומאוסטזיס חיזור, תזמור תהליכי איתות תא, וכו &#39;1. המיטוכונדריה גם לשחק תפקיד פעיל האינדוקציה של מוות של תאי 2, כמו גם מחזור התא תקנה 3. רב-פונקציונלי כזו מעלה את השאלות העקרוניות הבאות: א) איך המיטוכונדריה אל לבצע את כל הפונקציות האלה בו זמנית ב) האם יש ברכות המיטוכונדריה ספציפיות או subzones כי הם מיוחדים עבור פונקציות נפרדות? בהקשר זה, חשוב לציין כי המיטוכונדריה רב התכליתית הן דינמיות הצורה, הגודל שלהם, ואת המבנה בתוך תאים בודדים וכי הצורה היציבה של המיטוכונדריה יכולה להשתנות בין סוגי תאים. עשרות שנים של מחקר ממעבדה שונהoratories מראה כי השינוי של צורת המיטוכונדריה, גודל ומבנו, דינמיקה המיטוכונדריה פנתה במשותף, הוא חיוני בשמירת פונקציות המיטוכונדריה שונה 4,5,6. ממצאים אלה מעלים את האפשרות כי המיטוכונדריה יכול להשיג רב הפונקציונלית שלהם מכוח הדינמי המבני שלהם. מאמצים נרחבים נערכים להבין את הקשר מבנה-תפקוד המיטוכונדריה. הדינמי של מבנה המיטוכונדריה נשמר בעיקר על ידי היכולת שלהם לעבור אירועי ביקוע ואיחוי אחד עם השני. ביקוע של המיטוכונדריה גדול ממיר אותם אלמנטי המיטוכונדריה קטנים, תוך היתוך בין שני המיטוכונדריה קטן ממזג אותם לאלמנט המיטוכונדריה גדול 7. יתר על כן, היתוך חולף של שתי המיטוכונדריה עלול להתרחש כדי לאפשר הערבוב של תוכנם. אירועי הביקוע ואיחוי של ממברנות המיטוכונדריה הפנימיות וחיצוניות נשלטים בקפידה על ידי המפרטific קובע של חלבונים. מנגנון ביקוע הגרעין מורכב הקשורות dynamin חלבון 1 (Drp1), אשר גייס מן cytosol אל המיטוכונדריה ידי האינטראקציה שלה עם חלבונים המיטוכונדריה בתום לב מסוים (למשל, Fis1 או Mff1), בעוד פונקצית Drp1 יכולה גם להיות מוסדרת על ידי חלבונים אחרים על פני המיטוכונדריה 4. למרות Drp1 פועלת על הממברנה החיצונית, יכולות הביקוע שלה להשפיע על הקרום הפנימי גם כן. התזמור של הביקוע של ממברנות המיטוכונדריה חיצוניות ופנימיות אינו מובן היטב. מצד השני, פיוז&#39;ן של הקרום הפנימי נשלט על הליבה על ידי הפעילויות של Opa1, בעוד mitofusins השולטים ההיתוך של 5-הממברנה החיצונית. יתרת אירועי הביקוע ואיחוי המנטרל של המיטוכונדריה להכתיב את צורת המיטוכונדריה היציבה בתא. לדוגמה, הדחקה של ביקוע המיטוכונדריה תביא היתוך שלם ללא התנגדות, בעוד יתר פעילות של המיטוכונדריהביקוע l יביא לפיצול של המיטוכונדריה 3. המחקר של קשר מבנה פונקצית המיטוכונדריה כרוך בעיקר שתי גישות מחמיאות: א) מנתח של פנוטיפים הסלולר האורגניזם לאחר מניפולציה גנטית של חלבוני היתוך / ביקוע המיטוכונדריה ב) הערכות ישירות של מבנה המיטוכונדריה ותפקוד. ראוי לציין כי אנליזה גנטית לא תמיד לחשוף את הפונקציונליות הישירה של המולקולה בהישג היד (במקרה זה, חלבוני היתוך / ביקוע המיטוכונדריה), כמו פנוטיפים שעלולים להתעורר עקב השפעות משניות. לכן, זה הוא בעל חשיבות עליונה לפתח ולהשתמש בכלים כדי לחקור את המבנה המיטוכונדריה ותפקוד ישירות. כל הערכה של מבנה המיטוכונדריה כרוכה כלים מיקרוסקופיה שונים. שימוש מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי חיים התקדם המחקרים מאוד של דינמיקה המיטוכונדריה, מאז הדינמיות המיטוכונדריה ניתן לנטר הן מבחינה איכותיות quantitatively באמצעות כלי מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתאימים וטכניקות 8. כלי מיקרוסקופיה קרינה מבוססות פותחו כדי לחקור את המבנה המיטוכונדריה ותפקוד ברקמות תסיסנית חיות וקבועות, הבהרת המשמעות של הדינמיות המיטוכונדריה vivo 9. אלה ושיטות החישוב לסקר מתוארים כאן, עם המטרה של לימוד מבנה המיטוכונדריה ותפקוד בשחלה תסיסנית. השחלה תסיסנית מורכבת שושלות בתאי מין וגם סומטיים, אשר נובעות בתאי גזע בוגרים שלהם שוכני germarium 10,11. שישה עשר בתאי הנבט סינסיציאלי (GCS) לקבל במארז ידי תאי זקיק סומטי (FCS) כדי ליצור תאי ביצה הפרט העולות מתוך germarium (איור 1). אחת מ -16 GCS לקבל מחויב להיות ביצית, ואת GCS 15 הנותר להתפתח לתאי אחות ששומרים על הגדילה של תא הביציתאת הקלת הבשלת הביצית לפני שהוא הניח. רוב FCS לעבור 9 סיבובים של חטיבות mitotic לפני שהם יציאת מחזור תא mitotic סופנים להתמיין שכבת תא אפיתל בדוגמת המורכבת תאי זקיק קדמי (AFCs), תאי זקיק אחורי (PFCs), ותאי גוף עיקריים (MBCs) . תאי הביצה הרצופים מחוברים באמצעות תאי גבעול, אשר הם מובחנים תאים נגזרים גם FCS בשלב המוקדם של התפתחות. צורת מיטוכונדריאלי מוסדרת על ידי Drp1 חלבון ביקוע המיטוכונדריה מעורב באופן פעיל בתהליך של התמיינות במהלך ההתפתחות הנורמלית של שכבת FC שחלות תסיסנית 9,12. שיטות שימוש במחקרים אלה כדי לזהות את המעורבות של Drp1 בפיתוח שכבת תאי זקיק תסיסנית מתוארות כאן.

<table><tbody><tr><td>המדיה של גרייס (מדיום ניתוח חרקים)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 Paraformaldehyde AQ</td><td>Electronic Microscopy Sciences</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green (כתם מיטוכונדריאלי כולל)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>Reconstruct and Aliquot</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>Remake and Aliquot</td></tr><tr><td>MitoSox (כתם Mito-Ros)</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>Reconstruct and Aliquot</td></tr><tr><td>PolyLysine</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זבוב</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>זבוב חרוטי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>זיזי בקבוקון זבוב</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>זבוב חרוטי פלגים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>ג'אזמיקס מזון דרוזופילה (מזון דרוזופילה)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>ציקלין E נוגדן (d-300)</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ATPB [3D5] - סמן מיטוכונדריאלי</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>מאט טק קורפ&nbsp; תחתית זכוכית Mircrowell צלחת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>שמרים מיובשים פעילים</td><td>פישר</td><td>ICN10140001</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>קארל זייס</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>דומונט #5 מלקחיים</td><td>טכנולוגיות מדע עדינות</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק סיכות מצופה ניקל מוריה</td><td>טכנולוגיות מדע עדינות</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>Fly Pad</td><td>Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun</td><td>Fly stuff</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun needle</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Analyses software</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אנליזות תוכנה</td> קוד <td>פתוח</td><td>תמונה J</td><td></td></tr><tr><td>מחקר מיקרוסקופ זום מאקרו</td><td>אולימפוס</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM מהיר 1394 מצלמה דיגיטלית מקוררת, 12 סיביות, מונו&nbsp;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי תסיסנית שחלות

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

ניתוח הקשר בין מבנה המיטוכונדריה לתפקוד נדרש להבנה מעמיקה של מנגנוני הרגולציה של פונקציונליות המיטוכונדריה. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא כלי הכרחי להערכה ישירה של המבנה והתפקוד המיטוכונדריאלי בתאים חיים ולחקר יחסי המבנה-תפקוד המיטוכונדריה, אשר מווסת בעיקר על ידי המולקולות השולטות באירועי ביקוע והיתוך בין מיטוכונדריה. מאמר זה מתאר ומדגים שיטות ספציפיות לחקר המבנה והתפקוד המיטוכונדריאלי ברקמה חיה כמו גם ברקמה קבועה באורגניזם המודל Drosophila melanogaster. הרקמה הנבחרת כאן היא שחלת הדרוזופילה, שניתן לבודד ולהפוך אותה למתאימה למיקרוסקופיה קונפוקלית חיה ex vivo. יתר על כן, המאמר מתאר כיצד לבצע מניפולציה גנטית של חלבון הביקוע המיטוכונדריאלי, Drp1, בשחלות דרוזופילה כדי לחקור את המעורבות של ביקוע מיטוכונדריאלי מונע Drp1 בוויסות הקשר בין מבנה לתפקוד המיטוכונדריאלי. השימוש הנרחב בשיטות כאלה מודגם בנתונים שכבר פורסמו כמו גם בנתונים חדשים. ניתן להרחיב את השיטות המתוארות עוד יותר להבנת ההשפעה הישירה של חומרים מזינים ו/או גורמי גדילה על התכונות המיטוכונדריאליות ex vivo. בהתחשב בכך שחוסר ויסות מיטוכונדריאלי עומד בבסיס האטיולוגיה של מחלות שונות, השיטות החדשניות המתוארות שפותחו באורגניזם מודל הניתן לטיפול גנטי, דרוזופילה, צפויות לתרום באופן משמעותי להבנת הפרטים המכאניסטיים של הקשר בין מבנה לתפקוד המיטוכונדריה ולפיתוח אסטרטגיות טיפוליות מכוונות מיטוכונדריה.

השיטות שתוארו ניתן להשתמש כדי לחקור את המבנה המיטוכונדריה ותפקוד שחלות תסיסנית חיות וקבועות (איור 2 ב). בתנאים כמה דוגמאות של תוצאות חזויות שהושגו עם השיטות שתוארו. דיסקציה של השחלה תסיסנית: כאשר גזור נוסף, הבטן ניתקה (איור 3B) מן (איור 3 א) תסיסנית כולה צריכה לשחר...

ניתוח הקשר בין מבנה המיטוכונדריה לתפקוד נדרש להבנה מעמיקה של מנגנוני הרגולציה של פונקציונליות המיטוכונדריה. שיטות ספציפיות לחקר המבנה והתפקוד המיטוכונדריאלי בשחלות דרוזופילה חיות וקבועות מתוארות ומודגמות במאמר זה.

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

המטרה הכוללת של הליך זה, היא להדגים שיטות לחקר מבנה ותפקוד המיטוכונדריה ברקמה חיה כמו גם ברקמה קבועה באורגניזם המודל Drosophila melanogaster. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המיטוכונדריאלית. כגון מנגנוני הוויסות של תפקוד המיטוכונדריה.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מבצעת ניתוח מפורט של יחסי המבנה/תפקוד המיטוכונדריה. לאחר מיון חמש נקבות זבובים מורדמות על פי פרוטוקול הטקסט, תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, השתמשו בשני זוגות מלקחיים כדי לנתק את בית החזה מהבטן. לאחר מכן, העבירו בזהירות את הבטן לבאר השנייה של המנה.השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את הבטן בקצה האחורי, השתמש בזוג המלקחיים השני כדי לדחוף לאט את השחלות החוצה. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להחזיק שחלה בודדת בקצה האחורי האטום והעביר אותה בזהירות לבאר השלישית של המנה לצורך התגרות או קיבוע. הקניטו בזהירות את מעטפת המגן מסביב לשחלות, על ידי שימוש בזוג מלקחיים כדי להחזיק את הקצה האחורי וטאטוא קל של מחט מתגרה מהקצה האחורי לקצה הקדמי.להכנת תאים מצופים פוליליזן, הניחו שתי טיפות מופרדות של 20 מיקרוליטר של פוליליזן על הכיסוי של צלחת פטרי עם תחתית זכוכית. יבש את הצלחות באוויר בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, ומתאר את הפוליליזין בצד התחתון של הצלחת. הגדר את פרמטרי הסריקה במיקרוסקופ הקונפוקלי על ידי פתיחת תוכנת רכישת התמונה, ובכרטיסיית הרכישה, הגדר את פרמטרי הסריקה המתאימים.סמן את תיבות סדרות הזמן, ההלבנה והאזורים כדי לפתוח את הכרטיסיות הבודדות. לאחר מכן, הזן את ערכי פרמטרי הרכישה המתאימים בכל כרטיסייה. לאחר מכן, הניחו שחלה אחת מנותחת ומתגרה על אזור מצופה פוליליזין מסומן והשתמשו במחט מתגרה כדי לפזר את השחלה ולהפריד בין השחלות.הניחו טיפה של 10 מיקרו ליטר של מדיום חיתוך חרקים על גבי השחלה, והקפידו לכסות את כל האזור המצופה פוליליזין. לאחר מכן, מכסים את צלחת הפטרי. מיד לאחר הרכבת השחלה, הנח את הדגימה על שלב המיקרוסקופ והשתמש בחתיכת העין כדי לאתר במהירות את שדה העניין ברקמה החיה.לחץ על שידור חי כדי לקבל תמונה חיה של תחום העניין שנבחר, ולאחר מכן לחץ על עצור כדי להפסיק את הסריקה החיה. במידת הצורך, התאם את פרמטרי הרכישה כך שהאות הפלואורסצנטי שזוהה יהיה מתחת לרמות הרוויה עם הרקע המוגדר כפי שנקבע על ידי התאמת ערכי ההיסט. מהכרטיסייה הגרפית, השתמש בכלי הציור bezier כדי לצייר החזר ROI קטן כדי לתחום את אזור הלבנת התמונות בתמונה שנרכשה בסריקה.לאחר מכן בצע רכישת תמונה, על ידי לחיצה על התחל ניסוי. כדי לבצע צביעה חיה בצבעי מיטוכונדריה פלואורסצנטיים, יש לדלל את מלאי הכתמים במדיום חיתוך חם עד ריכוזי עבודה סופיים. לאחר הדגמת דיסקציה והתגרות מוקדם יותר, הניחו את השחלות לתוך 200 מיקרוליטר של תמיסת מכתים בבאר של צלחת דיסקציה.מכסים את הכלי בקופסה עטופה בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור ולדגור על הרקמה למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את השחלות המוכתמות באמצעות מלקחיים כדי להעביר אותן בזהירות לשלוש בארות רצופות המכילות מדיום ללא כתם. לצביעה משותפת עם TMRE, בצביעה המיטוכונדריאלית הכוללת התואמת, יש לבצע תחילה צביעה עם TMRE, ולאחר מכן מבלי לשטוף את הרקמה, להעביר מיד את הדגימה לתוך הצביעה המיטוכונדריאלית הכוללת.לאחר שטיפה והרכבה של השחלות כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, כדי לבצע הדמיה קונפוקלית על הדגימה, סמן את תיבת חתך ה-z כדי לפתוח את הלשונית. סובב את גלגל המיקוד לכיוון החלק התחתון של הדגימה בזמן שהוא נסרק בשידור חי ולחץ על הגדר תחילה כדי להגדיר את חתך ה-z התחתון ביותר. לאחר מכן הזז את גלגל המיקוד בכיוון ההפוך כדי להגדיר את החלק העליון ביותר.בצע רכישת תמונות על ידי לחיצה על התחל ניסוי. במקרה של xvivamicroscopy חי, יש להשיג את הנתונים תוך 15 דקות מהרכבת הרקמה, אחרת, תוצאות הניסוי עשויות להיות מושפעות משינויים בפיזיולוגיה עקב מוות של הרקמה כתוצאה מכך. מיד לאחר החיתוך מתחת למכסה אדים, הניחו את השחלות לתוך 200 מיקרוליטר של PFA טרי בטמפרטורת החדר בבאר של כלי חיתוך זכוכית.דגרו על הרקמה למשך 15 דקות כדי לתקן אותה. לאחר שטיפת השחלות ב-PBS על פי פרוטוקול הטקסט, בעודך ב-PBS, הקניטו את השחלות כדי להסיר בזהירות את מעטפת הסיבים המגנים שעלולה לעכב את גישת האנטיגן מהנוגדן. לחדור את השחלות המתגרות על ידי הנחתן בצינור מיקרו-נתיך עם 500 מיקרוליטר של 0.5 אחוז טריטן x 100 ב-PBS.לאחר מכן, הנח את הצינור בקופסה מכוסה והגדר להתנדנד ב-25 סל"ד למשך 30 דקות. הסר את ה-PBS/TX לפי פרוטוקול הטקסט חסום את הרקמה על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של BSA מומס ב-0.5 אחוז PBS/TX. דגרו את הדגימות על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך שעה.לאחר הסרת התמיסה החוסמת, הוסף נוגדנים נגד כלבת desycline E ונוגדני ATPB נגד עכברים. דגרו את הרקמה על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר הדגירה, השתמש ב-PBS-TX כדי לשטוף את השחלות שלוש פעמים למשך 15 דקות כל אחת.לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של הנוגדנים המשניים המתאימים ו-PBS-TX טרי ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר שטיפת הרקמה פעמיים, הוסף ווים לכביסה השלישית. לאחר מכן, בעזרת מיקרופיפט של מיליליטר אחד, הסר את השחלות המוכתמות במערכת החיסון מצינור המיקרו-פיוז לבאר טרייה של צלחת חיתוך זכוכית המכילה 200 מיקרוליטר PBS.הוסף טיפה אחת של מדיום הרכבה על בסיס גליצרול לשקופית זכוכית והוסף את השחלות המוכתמות במערכת החיסון אחת אחת למדיום ההרכבה. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, תוך כדי החזקת החלק האטום של השחלה בעזרת מלקחיים, השתמש במחט מתגרה כדי למרוט בעדינות את השחלות השקופות מתאי הביציות הבוגרות האטומות. לאחר מכן, הסר את תאי הביצים הבוגרים ממדיום ההרכבה.הנח זכוכית כיסוי על השקופית ולחץ קלות כדי להבטיח שאמצעי ההרכבה יתפשט בצורה אחידה. יבש את הדגימות באוויר במשך 15 דקות לפני השימוש בלק כדי לאטום את הקצוות. לבסוף, בצע מיקרוסקופיה קונפוקלית לפי הצורך.כפי שמוצג כאן, היפוך המכוון לאחד מענני המיטוכונדריה הקשורים לתאי ה-nerse מוביל לאובדן של יותר מ-50 אחוז של האות הפלואורסצנטי מה-ROI הכחול-לבן המקיף את ה-ROI האדום תוך 200 שניות בעוד שה-ROI של הבקרה הצהובה מולבן באופן מינימלי. השחלות של הדרוזופילה הראו ירידה באות עם עומק הרקמה, וחשוב להבחין בעומק המקסימלי של הרקמה שבתוכה ניתן לזהות את הפלורופורים כגון TMRE ומיטוסטיין, במהלך הדמיה חיה. ניתוח איכותני מצביעה משותפת עם TMRE והצביעה המיטוכונדריאלית הכוללת, מראה כי הגרמריום של הדריזופילה מציג פוטנציאל מיטוכונדריאלי גבוה יותר ליחידת מסה בשלב 2B.באיור זה, ניתוח איכותני למחצה מדגים את ההבדל בפוטנציאל המיטוכונדריאלי ליחידת מסה בין AFC ל-MBC כפי שנותח מתא ביצים שלב 9. תמונות אלה חושפות כי ספיגת מיטוזוקס מתרחשת בתאי זקיקי הדריזופילה. בניסוי זה, צביעה קו-אימונונית מזהה אות דציקלין מוגבר החופף לאות ה-ATPB המיטוכונדריאלי ולשיבוטי נול DRP1 שלילי GFP בגרמריום ובתא ביצים שלב 9.ניתן לשנות את השיטות המתוארות ולהשתמש בהן כדי לחקור את תפקוד המבנה המיטוכונדריאלי ברקמות דריזופיליה אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח, להכתים ולדמות שחלות דריזופילה קבועות וחיות כדי לחקור את המבנה והתפקוד של המיטוכונריה.

studying-mitochondrial-structure-and-function-in-drosophila-ovaries

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה...

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה...

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

סרטון זה מתאר את האנטומיה הכללית של שחלה דרוזופילה וכולל שיטה לניתוח שחלות לצורך הדמיה חיה או קבועה.

דרוזופילה מלנוגסטר דיסקציה שחלתית: טכניקה להכנת רקמות Ex Vivo

מיטוכונדריה ממלאים תפקידים מרכזיים בוויסות חילוף החומרים וההומאוסטזיס. שינויים עדינים במטבוליזם המיטוכונדריאלי המשפיעים על הפיזיולוגיה של האורגניזם עשויים להיות קשים לאיתור במחקרי מטבולומיקה של אורגניזמים שלמים. כאן אנו מתארים שיטת בידוד המשפרת את הזיהוי של שינויים מטבוליים עדינים בדרוזופילה מלנוגסטר.

הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em

Drosophila oogenesis ממשיכה להיות שימושית במיוחד בחקר התפשטות מיטוכונדריאלית ותורשה. כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט המשמש לתיוג ה-DNA המיטוכונדריאלי המשכפל (mtDNA) בשחלות בוגרות של דרוזופילה עם 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), המאפשר לחשוף מנגנונים הקשורים לתורשה מיטוכונדריאלית שהיו שנויים במחלוקת בעבר.

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

אנו מציגים פרוטוקולים לאיסוף, הכנה והדמיה של ביציות דרוזופילה בוגרות. שיטות אלו מאפשרות הדמיה של התנהגות הכרומוזומים והרכבת הציר ותפקודו במהלך מיוזה.

טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע<em&gt; תסיסנית</em&gt; ביציות

ב פרוטוקול זה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה .

Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

קרום המרתף חיוני למורפוגנזה של רקמות ואיברים במהלך ההתפתחות. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המובילים למיקום נכון של מבנה זה, הפרוטוקול שהוצג מתאר שיטות להמחשה ואפיון של הסחר התוך-תאי וההפרשה של חלבוני קרום המרתף בתאי אפיתל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה.

הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך Drosophila Oogenesis

כאן אנו מציגים פרוטוקול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה לניתוח ביו-אנרגטיקה בזבובי פירות מוטנטיים מסוג PINK1B9-null. השיטה משתמשת בפרוטוקול Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט Drosophila melanogaster PINK1B9-Null באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

למד שיטות לניתוח מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי ברקמות חיות וקבועות של Drosophila melanogaster. טכניקות אלו חיוניות להבנת מנגנוני הרגולציה של תפקוד מיטוכונדריאלי בביולוגיה התפתחותית.

לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי תסיסנית שחלות

גלה סרטונים נוספים