$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כרומטוגרפיה של שכבה דקה, או TLC, היא שיטה כרומטוגרפית המשמשת להפרדת תערובות של תרכובות לא נדיפות, הנפוצה בכימיה אורגנית.
TLC מבוצע על צלחת עם גב זכוכית או פלסטיק. קו בסיס מסומן על הצלחת, יחד עם תוויות. התערובת הנבדקת ותרכובות הייחוס מומסות בממס מתאים ומורחות ליד הקצה התחתון של לוחית ה-TLC בנקודות קטנות. הצלחת מונחת בצנצנת, וממס? (השלב הנייד)?מפריד את התערובת על סמך התכונות הפיזיקליות של כל רכיב.
למרות העובדה שלטכניקות הפרדה כבדות יותר של מכשירים יש יותר כוח פתרון מאשר TLC, המהירות והעלות הנמוכה הן שהופכות את TLC לטכניקה אטרקטיבית לניתוח איכותי תוך כדי תנועה. סרטון זה ידגים את ההכנה, התפעול והניתוח של כרומטוגרפיה של שכבה דקה.
טכניקות כרומטוגרפיות כוללות שלב נייח ונייד. ב- TLC, השלב הנייח מורכב משכבה דקה של חומר קבוע לצלחת. החומר הוא חומר קוטבי, כמו סיליקה ג'ל. השלב הנייד הוא נוזל לא קוטבי הנע במעלה השכבה הסופחת על ידי פעולה נימית. כאשר השלב הנייד נע במעלה הצלחת, הוא נגרר לאורך הרכיבים של כל נקודה, המופרדים לאחר מכן על סמך קוטביות.
תרכובות פחות קוטביות יבלו זמן רב יותר בשלב הנייד כאשר הוא נמשך במעלה הצלחת. תרכובות קוטביות יותר נמשכות יותר לשלב הנייח, ולכן לא ינועו במעלה הצלחת עד הסוף.
ההפרדה מתבצעת במיכל מתפתח. אלה יכולים להיות צנצנות עם מכסים או כוסות מכוסות בנייר אלומיניום. השתמש במיכל הקטן ביותר הזמין שיכיל את לוחית TLC כדי להאיץ את ההפרדה.
השלב הנייד, או הממס המתפתח, צריך להיות לא קוטבי ככל האפשר להפרדה טובה. מוצגת כאן סדרה אלואוטרופית לסיליקה ג'ל, רשימה של שלבים ניידים נפוצים לפי סדר הגדלת כוח החילוץ.
ניתן לבדוק מספר שלבים ניידים בו זמנית. על צלחת נקייה, הבחין בדגימה המומסת מספר פעמים, במרחק של לפחות 2 ס"מ זה מזה. מרחו מספיק שלב נייד על כל נקודה ליצירת עיגול בקוטר 1-2 ס"מ.
סמן את המרחק שעובר השלב הנייד. אם השלב הנייד אינו קוטבי מספיק, הדגימה תישאר קרובה לנקודה הראשונית. אם השלב הנייד קוטבי מדי, כל הדגימה תנדוד עם חזית הממס. פאזה ניידת מתאימה תציג טבעות מופרדות היטב, כאשר הטבעת החיצונית ביותר כ-50% מהמרחק לחזית הממס.
במידת הצורך, ניתן לערבב שני שלבים ניידים הניתנים לערבוב בפרופורציות משתנות כדי להשיג את המאפיינים הרצויים. כאן, תערובת של 1:1 של אתיל אצטט והקסאן הייתה קוטבית מדי, אך תערובת של 1:20 הופרדה כראוי.
עם בחירת השלב הנייד, אתה מוכן להתחיל לפתח את הצלחת.
כדי להתחיל בהליך, חתוך צלחת TLC זמינה מסחרית לגודל הרצוי. אם לצלחת יש גיבוי זכוכית, קלעו אותה בעזרת חותך זכוכית ושברו בזהירות לאורך הקו.
בעזרת עיפרון מסמנים קו בסיס כ -1 ס"מ מתחתית הצלחת. סמן את המיקום שבו הדגימות ייצפו לאורך הקו. וודאו שהכתמים נמצאים במרחק של לפחות 1 ס"מ מהקצה ובמרחק של 3 מ"מ זה מזה. תייגו אותם כראוי.
יש להמיס דגימות מוצקות בממס מתאים. ממיסים נפוצים כוללים הקסנים, אתיל אצטט או דיכלורומתאן. השתמש בממס הכי פחות קוטבי שימיס את הדגימה.
ערכו את תערובת הדגימה/ממס בעזרת נימי זכוכית. גע בעדינות בקצה למיקום הרצוי על צלחת TLC והסר אותו מיד. חשוב לא להפריע לשלב הנייח.
שמור על המקום קטן ככל האפשר, מכיוון שהדבר מוביל להפרדה טובה יותר. אם יש צורך בדגימה נוספת, ניתן למרוח כתמים ברצף בכל מיקום. הניחו לממס להתייבש בין היישומים. ניתן להשתמש בזרם אוויר לייבוש ממיסים פחות נדיפים.
לוחית ה-TLC מוכנה כעת לפיתוח. הניחו פיסת נייר פילטר בתחתית הצנצנת כדי להגביר את לחץ האדים. הוסף את שלב הנייד לעומק שאינו מגיע לקו הבסיס. כסו את הצנצנת כאשר אינה בשימוש כדי שאדי הממס לא יברחו.
הנח בזהירות את צלחת ה-TLC המנומרת בצנצנת המתפתחת. ודא שהשלב הנייד נמצא מתחת לקו הבסיס. צפו בהתקדמות חזית הממס? חוד החנית של שלב המובייל? מכיוון שהוא ינוע במהירות במעלה הצלחת.
אל תאפשר לשלב הנייד להגיע לקצה העליון של הצלחת, מכיוון שדוגמאות רצועות יתחילו להתרחב באמצעות דיפוזיה. ברגע שחזית הממס מתקרבת לחלק העליון, הסר את הצלחת מהתא המתפתח וסמן את חזית הממס בעיפרון לפני שהממס מתייבש.
אם התרכובות אינן צבעוניות, ניתן להשתמש במנורת UV כדי לדמיין את הכתמים. התרכובת תחסום את הקרינה הרקע של הצלחת. הגדר את ה-lamp להגדרת הגל הקצר, והאיר את הצלחת היבשה. בעזרת עיפרון, מתאר את כל הכתמים הנראים מתחת למנורה. בעזרת עיפרון, מתאר את כל הכתמים הנראים מתחת למנורה.
טכניקת הדמיה אפשרית נוספת היא שימוש באשלגן פרמנגנט, חומר מחמצן. בעזרת פינצטה טובלים את הצלחת בכתם הפרמנגנט.
הסר וטפטף עודפי תמיסה בעזרת מגבת נייר. במכסה אדים, מחממים בזהירות את הצלחת בעזרת אקדח חום כדי לדמיין את הכתמים. השתמש בעיפרון כדי לסמן כתמים שמופיעים.
לאחר הדמיית הכתמים, ניתן להשוות את החומר המעניין לסטנדרטים, כפי שמוצג כאן. בדוגמה זו, הלא ידוע הוא 1,3-דיפנילפרופינון, אבן בניין בסינתזה אורגנית. על ידי השוואת הרצועה לתקן ידוע ובנזואיל כלוריד, אחד מחומרי המוצא, ניתן לזהות את המוצר.
גורם הפיגור, או Rf, משמש לזיהוי התרכובת הלא ידועה. ה-Rf הוא היחס בין המרחק שתרכובת עוברת במעלה לוחית TLC למרחק שהפאזה הניידת עוברת. הגורם נקבע על ידי מדידת המרחק מקו הבסיס לנקודה וחלוקה במרחק מקו הבסיס לחזית הממס.
ה-Rf של תרכובת נתונה תלוי בתנאים המשמשים בניסוי, כולל בחירת ממס, עובי ופעילות הסופח, טמפרטורה וגודל המדגם. יש להקפיד על עקביות גורמים אלה בין הניסויים.
ישנם מספר יישומים של כרומטוגרפיה של שכבה דקה.
בדוגמה זו נחקרה תכולת הטריאציל גליצרידים של בלוטות החלב של העטלפים. שבר פני השטח של השומנים הופרד לראשונה על ידי קוטביות על צלחת TLC. לאחר מכן הוסרה רצועת הטריאציל גליצריד מהצלחת בעזרת מרית. אבקת הסיליקה הועברה לצינור מיקרו-צנטריפוגה עם ממס. לאחר הצנטריפוגה, השלב הנייח נותר בתחתית הצינור, ואילו התרכובות נותרו מומסות בממס. לאחר מכן הופרדו הטריאציל גליצרידים עוד יותר על ידי תכונה פיזיקלית אחרת. במקרה זה, הממד השני של ההפרדה היה גודל מולקולרי.
ניתן להשתמש ב-TLC גם כדי לעקוב אחר התקדמות התגובה הכימית. בדוגמה זו, חומר המוצא של התגובה שימש כסטנדרט, ורץ לצד תמיסת התגובה על צלחת TLC. תהליך זה חזר על עצמו במרווחי זמן ספציפיים במהלך התגובה. ככל שהתקדמה התגובה, רצועת חומר המוצא הצטמצמה ורצועת המוצר גדלה. כאשר לא היה שינוי ברצועות, או שכל חומר ההתחלה נצרך, התגובה הייתה שלמה. ?
לבסוף, ניתן להשתמש בלוחות TLC בבדיקות ביולוגיות. בדוגמה זו, תרכובות הופרדו מתלתן אדום עם TLC. לאחר מכן כל רצועה הונחה על חיידקים שגדלו על צלחות אגר. מולקולות שהראו עיכוב בצמיחת חיידקים נותחו עוד יותר בשל תכונותיהן האנטי-מיקרוביאליות.
זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE לכרומטוגרפיה של שכבה דקה. כעת עליך להבין את התיאוריה הבסיסית של ההפרדה, כיצד לבחור שלב נייד מתאים לניסוי שלך, וכיצד להגדיר ולהפעיל לוחית TLC. תודה שצפית!
