באמצעות רנטגן קריסטלוגרפיה, ביופיזיקה, מבחנים תפקודיים לקביעת הכרת קולטן מנגנוני שלטון תאי T של אנטיגנים הסרטן

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר קולטן תאי T מסיסים וחלבוני HLA פפטידים באיכות מספקת לשימוש בניתוח ביופיזי ומבני. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום האימונולוגיה של תאי T. כמו, למשל, מדוע תאי T אינם מגיבים בעוצמה לסרטן?

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו מקבלים נתונים מכניסטיים ברזולוציה גבוהה במיוחד המסבירים כיצד קולטני תאי T מזהים את המטרות שלהם, מה שמוביל לתגובות חיסוניות מתווכות של תאי T. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחון של כמעט כל מחלה אנושית מכיוון שתאי T ממלאים תפקיד מרכזי ברוב התגובות החיסוניות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התגובות החיסוניות של תאי T, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות הנשלטות על ידי אינטראקציות ליגנד קולטנים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שקשה מאוד לייצר חלבונים מסיסים ופעילים באיכות מספקת לניסויים ביופיזיים ומבניים. כדי להתחיל בהליך הקיפול מחדש של פפטיד HLA לשישה מיליליטר של מאגר גואנידין עם 10 מילומטר דיתיותרייטול, הוסף 30 מיליגרם של גופי הכללה HLA-A2, 30 מיליגרם של גופי הכללה בטא 2-M וארבעה מיליגרם של הפפטיד הרצוי המעניין. דוגרים על התערובת למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, מדללים את התערובת בליטר אחד של מאגר HLA refold, מקורר מראש לארבע מעלות צלזיוס ומערבבים את התערובת במשך שלוש שעות בטמפרטורה זו. דיאליזה של התערובת פעמיים כנגד 20 ליטר של 10 טריס מילימולר, pH 8.1, למשך 24 שעות כל אחד. כדי להתחיל בהליך הקיפול מחדש של TCR, לשישה מיליליטר של מאגר גואנידין עם 10 מילי-מולרי דיתיותרייטול, הוסף 30 מיליגרם כל אחד של TCR אלפא ו-IB של שרשרת בטא.

דוגרים את התערובת למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס ומדללים את התערובת בליטר אחד של מאגר TCR מקורר מראש. מערבבים ועושים דיאליזה של תערובת ה-TCR המדוללת באותו אופן כמו תערובת הפפטיד HLA. סנן את שתי תערובות הרפולד הדיאליזה דרך מסנן ממברנה של 0.45 מיקרומטר.

לאחר מכן, טען את אחד מתכשירי הרפלד המסוננים על עמוד שרף חילופי אניונים בנפח 7.9 מיליליטר 50 מיקרומטר, מאוזן מראש עם 20 מיליליטר של 10 מילי-מולרי טריס, pH 8.1. יש לסלק את החלבון עם מערכת חיץ שיפוע מלח בחמישה מיליליטר לדקה. אסוף שברים של מיליליטר אחד ונתח את השברים עם SDS-Page.

שלב את השברים המכילים את החלבון המקופל מחדש. מניחים את תערובת החלבון ברכז צנטריפוגלי במשקל מולקולרי של 10 קילודלטון. צנטריפוגה את התערובת למשך 20 דקות או כמה זמן שנדרש, ב -4000 פעמים גרם, כדי לרכז את התערובת ל -500 מיקרוליטר.

השליכו את הזרימה. יצקו את תכשיר החלבון המרוכז ללולאת הזרקה של שני מיליליטר והזריקו את החלבון על עמודת כרומטוגרפיה של 24 מיליליטר, מאוזנת מראש עם מאגר החמקמקות המתאים. יש להוציא את החלבון בנפח עמודה אחד של חיץ ב-0.5 מיליליטר לדקה.

אסוף שברים של מיליליטר אחד, נתח את השברים עם SDS-Page ושלב את השברים המכילים את החלבון המעניין. הכן 10 דילולים סדרתיים של תמיסת ה-TCR, בטווח ריכוז המשתרע על פני פי 10 מעל עד פי 10 מתחת ל-KD של אינטראקציית ה-HLA הספציפית של פפטיד TCR אם ידוע. אחרת, התחל מריכוז TCR של 200 מיקרומולר.

לאחר מכן, הפעל שבב חיישן מצופה דקסטרן קרבוקסימתילציה על ידי הזרמת תערובת אחד לאחד של 100 מילי-מולרי ו-N-Hydroxysuccinimide ו-400 מילי-מולרי EDC על השבב בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה למשך 10 דקות, ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, טען 110 מיקרוליטר של 200 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטווידין ו-10 מילי-מולרי אצטט pH 4.5 בכל ארבעת תאי הזרימה כדי לתפקד את פני השבב. השבת את כל הקבוצות התגובתיות שנותרו עם 100 מיקרוליטר של אתנולאמיד הידרוכלוריד טוחנת אחת.

לאחר מכן, הזרימו תמיסה של כ-HLA פפטיד מיקרו-מולרי אחד במאגר שסופק על ידי יצרן השבב על פני השבב ב-10 מיקרוליטר לדקה עד שספירת יחידות התגובה גדלה ב-500 עד 600. רווי את פני השבב בביוטין מילי-מולרי אחד ומאגר המסופק על ידי היצרן למשך 60 שניות. לאחר מכן, הזרקו את 10 הדילולים הסדרתיים של תמיסת ה-TCR ב-30 מיקרוליטר לדקה ב-25 מעלות צלזיוס.

חשב את קבוע קשירת שיווי המשקל והפעל ניתוח קינטי. בצע סדרה של ניסויי SPR בדרך זו, תוך שינוי רק הטמפרטורה שבה מוזרקים דילולי ה-TCR. קבע את קבוע קשירת שיווי המשקל עבור כל טמפרטורה וחשב את אנרגיות גיבס ופרמטרים תרמודינמיים אחרים.

חבר את אנרגיות הגיבס כנגד הטמפרטורה באמצעות התאמת רגרסיה לא ליניארית. רכז את תמיסת הפפטיד HLA למאגר התגבשות של 0.2 מילי-מולרית והתגבשות על ידי צנטריפוגה ב-3,000 פעמים גרם, ברכז צנטריפוגלי במשקל מולקולרי של 10 קילודלטון. הכן תמיסה של 0.1 מילי-מולרית של TCR ופפטיד HLA אחד לאחד להתגבשות קו-קומפלקס.

באמצעות רובוט התגבשות וערכת סינון, הכינו ניסויי התגבשות בטכניקת טיפת ישיבה בצלחת 96 בארות. עם 60 מיקרוליטר של מאגר התגבשות בכל מאגר, וכל טיפה מורכבת מ-200 ננוליטר כל אחד של תמיסת חלבון וחוצץ. גדל את הגבישים ב -18 מעלות צלזיוס.

ציון עבור גבישים תחת מיקרוסקופ לאחר 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, ולאחר מכן, מדי שבוע. לאחר שגדלו גבישים בודדים באיכות מספקת, קצרו את הגבישים הבודדים עם לולאה תואמת קריוגן ואחסנו את הגבישים בחנקן נוזלי. לבצע עקיפה של קרני רנטגן סינכרוטרון תחת זרם של גז חנקן ב-100 קלווין, לנתח את הנתונים ולפתור את המבנים באמצעות התוכנה המתאימה.

חשב את המגעים, השלמת פני השטח וזווית המעבר מהמבנים שנפתרו. באמצעות שיטות אלה, מולקולות TCR ופפטיד HLA בוטאו וקופלו מחדש לצורה מסיסה. הפפטיד במולקולות הפפטיד HLA היה אנטיגן gp100.

SPR שימש לקביעת זיקת הקישור של PMEL17 TCR לאנטיגן בטמפרטורות שונות. לאחר מכן נעשה שימוש ב-SPR ובטיטרציה קלורימטרית איזותרמית, כדי לקבוע את הפרמטרים התרמודינמיים של האינטראקציה בין חלבון-חלבון. קומפלקס PMEL17 TCR A2-YLE-9V התגבש והוערך באמצעות עקיפה של קרני רנטגן סינכרוטרון.

לולאות ה-TCR CDR ושאריות הפפטיד HLA שאליהן מגע חלבון ה-TCR, זוהו שניהם ונחקר אופי המגעים. מולקולות פפטיד HLA עם צורות מוטציות של הפפטיד טוהרו והתגבשו גם הן בדרך זו. לחקור הבדלים מבניים שעלולים למנוע אינטראקציות קשורות עם TCR.

מוטציה של השארית השלישית או החמישית נמצאה כמשנה באופן משמעותי את המיקום של פרולין ארבע, מה שישבש רבים מהמגעים עם TCR CDR-3 Alpha Loop. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לבחור רק את החלבונים הטהורים ביותר להמשך ניתוח. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעת פפטיד HLA טטרמר, באמצעות החלבונים המסיסים על מנת לבודד תאי T ספציפיים לאנטיגן מדם המטופל לצורך אבחון וניתוח נוסף.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה של תאי T לחקור את קשירת פפטיד TCR HLA בפירוט מעולה, ואפשרה פיתוח תרופות חדשות לסרטן ומחלות אנושיות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לייצר חלבוני TCR ופפטיד HLA באיכות מספקת לביצוע ניתוח ביופיזי ומבני.